分子科学的アプローチによる遺伝子発現の制御と機構の解明京都大学大学院理学研究科化学専攻生物化学研究室研究目的 : 2 つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めている 11) エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について DDAA フレームを利用して直接可視化し解析する手法の開発

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よしおこしの
7 years ago
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(2014) Issue Date 2014-09-28 URL http://hdl.handle.

1 TitleDA オリガミを使ってできること Author(s) 板東, 俊和 ; 杉山, 弘 ; 朴, 昭映 ; 山本, 清義 ; 谷口, 純 Citation 京都大学アカデミックデイ2014 : ポスター / 展示 (2014) Issue Date URL Right Type Presentation Textversion author Kyoto University

2 分子科学的アプローチによる遺伝子発現の制御と機構の解明京都大学大学院理学研究科化学専攻生物化学研究室研究目的 : 2 つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めている 11) エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について DDAA フレームを利用して直接可視化し解析する手法の開発 ~100 nm DA フレームエピジェネティクな変化を 1 分子観測 22) エピジェネティクな遺伝子発現の活性化能を付与した DDAA 配列特異的結合分子による細胞の初期化分化の制御 5'-WWCCWW-3' I (+ 3'-WWGGWW-5' SAA ヒト皮膚線維芽細胞 (DF) において ct 3/4, anog の発現上昇

3 細胞生物の構造機能における基本単位人体 = 約 60 の細胞で構成される核 = 細胞内小器官内部に46 本の染色体を持っている染色体 = 細胞の遺伝情報の保存と伝達を担う (Chromosome) クロマチン=DAとヒストン ( タンパク質 ) で構成される構造体 (Chroma4n) 細胞膜核遺伝子発現タンパク質 ( 遺伝子 ) 翻訳 mra リボゾームクロマチンヒストン転写 ~50nm DA 染色体

2 nm 3' 2 nm 5' 8 7 major groove A 3 minor groove T 5 チミン (T) アデニン (A) 1122 塩基対からなる二本鎖 DDAA

4 DDAA 塩基配列情報が保存されている生体分子 5' 塩基対 (base pair): A- T, G- C 塩基間で対を形成する 3' major groove 5 シトシン (C) 右巻き二重らせん構造 8 7 G 3 minor groove C グアニン (G) base pair B-DA minor groove major groove 1.1 nm 2.2 nm 3' 2 nm 5' 8 7 major groove A 3 minor groove T 5 チミン (T) アデニン (A) 1122 塩基対からなる二本鎖 DDAA の二重らせん構造モデル主溝 ((mmaajjoorr ggrroooovvee)) と副溝 ((mmiinnoorr ggrroooovvee)) が交互に現れている塩基対 ((bbaassee ppaaiirr)) はらせん内部に存在している (( 実際に分子モデルで確認!)

5 ナノテクノロジー研究において魅力的な素材! DA は任意に形状を設計することができる! DA の良い所 1. 塩基対を利用して配列特異的に分子を構築することができる点 (program) 2. 空間的に二重らせん構造体として考えて設計することができる点 (geometry) DA 折り紙法 Rothemund, ature, 2006, 440, 297. 数百 nm スケールで様々な 2D, 3D のナノ構造体を望むように設計合成することができる

6 AFM (Atomic Force Microscope) : 原子間力顕微鏡カンチレバーの先についた針と試料の間に働く力 ( 原子間力 ) レーザーで検出しながら試料の表面を針でなぞる ( 走査する ) レーザー検出器カンチレバー試料の表面の凹凸情報を画像 ( 動画 ) として得る試料

7 DDAAナノ構造の設計と構築機能化可視化する技術 DA ナノテクノロジー DAと酵素の反応を可視化する技術 DAナノ構造の設計と構築 ~100 nm 京都大学大学院理学研究科化学専攻生物化学研究室 DA 折り紙技術 J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010) Rewiew: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 874 (2012) 40 nm 40 nm J. Am. Chem. Soc. 132, (2010) Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9412 (2010) 新規二次元構造体 DA フレーム igh- speed AFM imaging system 多様なDAピースを任意に構成する技術 ~300 nm DA ジグソウ ~300 nm ACS ano, 5, 665 (2011) Chem. Eur. J. 16, 5362 (2010) J. Am. Chem. Soc. 133, (2011) 特異的な機能を付与した単分子 DAの挙動を観察する技術 DA トランスポーター ature anotechnology, 6, 166 (2011) ature anotechnology, 7, 169 (2012)

Template ( 鋳型 )DA DA オリガミの折り方 :2 次元 DA ナノ構造体の構築方法 Staple ( かすがいホッチキス )DA 一本鎖 DA テンプレート (M13mp18 DA: 7249 bases) 相補的な塩基配列を持つ DA (226 種類 ) プログラム化された DA 構築 85 o C- 15 o C (-

9 Template ( 鋳型 )DA DA オリガミの折り方 :2 次元 DA ナノ構造体の構築方法 Staple ( かすがいホッチキス )DA 一本鎖 DA テンプレート (M13mp18 DA: 7249 bases) 相補的な塩基配列を持つ DA (226 種類 ) プログラム化された DA 構築 85 o C- 15 o C (- 1 o C/min) ~100 nm (288 塩基 ) 一本鎖 DA M13mp18 TTCAGGGT AAGTCCCA AGCCTTCA ACCGCACT TCGGAAGT TGGCGTGA TGAATGCC ACTTACGG 32- mer staple 一本鎖 DA ~70 nm (12 回の折り返し ) 高解像度 AFM イメージ

10 DA Box 構造形成と開箱プロセスのリアルタイム観測動的光散乱法 (DLS) による分析 folding +Staple 375 x 500 nm 2D opened Box Side I 750 x 1000 nm 3D Box 観測値 : 直径 68 nm (89%) ( 計算値 : 直径 67 nm) 開箱プロセスの AFM イメージ Box folding Top Side IV BoMom Side II Side III opened Box II III IV bottom II I top 2s- 3s 11s- 12s II bottom I 4s- 9s III bottom II 10s I DA Box 構造が段階的に開いていく様子をリアルタイムで観察することに成功した 1 image / sec rg. Biomol. Chem. 9, (2011).

11 複数の DA パスルピースからプログラム化された自己集合によって文字を表示させるパスルピース monomer I G F E D A 自己集合自己集合 200 x 200 nm D A 500 x 500 nm 525 x 525 nm DA ナノ構造体が優れたナノマテリアルになる可能性を示している

12 複数の 2 次元 DA ジグソウピースを用いるプログラム化した 2 次元自己集合 D A J I G S A W ACS ano o. 5 Vol. 1, 2011 ( 表紙に採用された ) D A J I G S A W 450 X 450 nm 2 次元 DA ジグソウピースによる自己集合技術は水平と垂直両方向へ応用が広がっていくだろう ACS ano, 5, (2011).

13 2 次元 DA フレームの開発 : 一分子観察を可能にする有用な観測技術として 4 種の連結部を内包した DA フレーム構造体の設計 25nm (80 bp) 40 nm (128 bp) 25nm (80 bp) 18 nm (7 duplexes) 20 nm (64 bp) 80 nm (32 duplexes) 10 nm (4 duplexes) 40 nm (16 duplexes) 23 nm (9 duplexes) 90 nm (288 bp) 連結部には任意の配列長さをもった DA 鎖を組み込むことが可能

14 我々の開発技術 DAフレーム技術によってDAの構造変化や酵素反応を単分子観測する高速AFM測定技術 DA オリガミ技術 DAフレーム単分子観察技術 G- ４重鎖構造 40nmx40nmのナノ観察空間 DAの構造変化 G- ４重鎖構造の形成酵素反応 DA メチル化転移酵素 DA 再構成酵素

40 nm C A 酵素 (EcoRI) の結合と反応の様子をリアルタイムで 1 分子観察する 40 nm 64 bp dsda 74 bp dsda B D CTGTAGCTCATCATGT GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT C A Sequence- specific M.

15 40 nm C A 酵素 (EcoRI) の結合と反応の様子をリアルタイムで 1 分子観察する 40 nm 64 bp dsda 74 bp dsda B D CTGTAGCTCATCATGT GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT C A Sequence- specific M. Eco RI CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA TCAATTAAGAGGGCAG tensed duplex strand 64 bp dsda 張った状態 TTGCCTGAGAGTCTGG CGAGC GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT TCCTC GCTCG CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA AGGAG TACAACAA ATAACAGC relaxed duplex strand 74 bp dsda 緩んだ状態 B D EcoRI メチル化転移酵素 DA 鎖を折り曲げてアデニンの 6 位をメチル化するメチル転移酵素 40x40 nm のナノ空間内の単一の酵素分子の挙動をリアルタイム観察 DA フレーム内で起きているメチル化反応の数をカウントする Eco RI on the tensed 64mer dsda 1 frame / sec メチル化観測数 : 74 塩基対 ( 緩んだ状態 )=43%, 64 塩基対 ( 張った状態 )=13% (118 フレーム中 ) J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010).

10 s 15 s 20 s 25 s 30 s 35 s 40 s 45 s 50 s Cre

16 DA フレーム内での酵素 (Cre) による再構成反応のリアルタイム観察 A separated dsdas DA 組換え酵素 Cre A 再構成 A double- loops C D C D C D 基質 DA- 酵素複合体の形成再構成された生成物 Cre 四量体 5 s 10 s 15 s 20 s 25 s 30 s 35 s 40 s 45 s 50 s Cre 四量体による再構成反応プロセスを初めてリアルタイムで直接観察することに成功した Cre 四量体は再構成の後 4 つのモノマーに解離している 0.2 frame / sec (5 x speed)

17 DAフレーム技術によって様々な酵素のダイナミックな結合や反応過程をリアルタイムで観察する 40 nm Eco RI methyl transferase on the 74bp DA strand 40 nm 72bp 72bp 74bp 40 nm 64bp 40 x 40 nm の領域で直接観察 40 nm 97 ). J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, Cre recombinase on the oliday Junc\on 4 s 張力による酵素の反応性の違い 64 塩基対張った状態と74 塩基対緩んだ状態観察結果より折り曲げやすい 74 塩基対の配列がメチル化されやすい J. Am. Chem. Soc., 132, (2010) 7 s Cre : DA組換え酵素 oliday Junc4on を経由して鎖交換反応を触媒する 180 x 180 nm, Scan rate: 1.0 frame / sec 5 s 8 s 6 s 9 s oliday Junc\on : 4本の鎖の間で形成される構造 ucleic Acids Res., 42, (2014)

GAGTTAGGGTTAGGG(T) 21 GGGT- 3 3 5 - GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21 GGGT- 3 4 5 - GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21

18 [3+1] ybrid 型の G- 四重鎖構造は T- loop 形成において安定な構造であることを提唱 (2008) [3+1] ybrid 型の G- 四重鎖構造ゲルシフト解析 K + K + +KCl - KCl ヒトテロメア配列 [5 - (GGGTTA)n- 3 ] GGGTTAGGGTTAGGG(T) 21 GGGT GAGTTAGGGTTAGGG(T) 21 GGGT GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21 GGGT GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21 AGGT AGGTTAGAGTTAGGA(T) 21 AGGT- 3 濃度依存的な Tm 値 T-loop J. Am. Chem. Soc. 130, (2008).

19 DAフレーム技術によって単分子のG 四重鎖構造への形成を確認する 5 -CTGTAGCTCAACATGT-GGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-----TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACT-GAACACCCTGAACAAA-3 3 -CCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-5 AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGA-5 64量体二本鎖DA A 3 -TGGGTTT- B C A D B 3 -TGGGTTT K+ 5 -GGGTTAGGGTTAGGGTTT K+ C D 74量体二本鎖DA 5 -GGGTTAGGGTTAGGGTTT- 5 -CGAGCGGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-3 TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACTTCCTC-3 3 -CTAAGAGAACAAACGA-GCTCGCCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-----AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGAAGGAG-TACAACAAATAACAGC-5 KClが入っていない時 100 mm KClを添加後 [ ] G- 四重鎖構造拡大 1000 x 750 nm 1000 x 750 nm 225 x 225 nm G- 四重鎖構造形成 : 44% (220 frames counted)

20 DAフレーム技術によってG 四重鎖構造へのダイナミックな形成過程をリアルタイムで観察する A C B D + KCl A C B D +"KCl" 20 mm Tris buﬀer (p 8.0) 10 mm MgCl2 100 mm KCl 20 mm Tris buﬀer (p 8.0) 10 mm MgCl2 単分子レベルのG 四重鎖構造の形成過程をDAフレーム内で確認 200 x 200 nm 10 sec / frame J. Am. Chem. Soc., 132, (2010)

Microsoft PowerPoint - DNA1.ppt [互換モード]

Microsoft PowerPoint - DNA1.ppt [互換モード] 生物物理化学タンパク質をコードする遺伝子 (135~) 本 PPT 資料の作成には福岡大学機能生物研究室のホームページを参考にした http://133.100.212.50/~bc1/biochem/index2.htm 1 DA( デオキシリボ核酸 ) の化学的特徴シャルガフ則とDAのX 線回折像をもとに,DAの構造が予測された (Watson & Crick 1953 年 ) 2 Watson