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あかりこけい
7 years ago
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1 平成 29 年 6 月 1 日研究成果発表広島大学大学院医歯薬保健学研究院二川浩樹虫歯歯周病を抑える L8020 乳酸菌を利用産学連携で新しいタブレットが誕生

2 2010 年 10 月

3 歯磨きしなくても虫歯にならない昭和 47 年 6 月 29 日生まれ 30 歳女性 FJ 病院

4 むし歯の治療歴のない FJ さん昭和 47 年 6 月 29 日生まれ,30 歳, 女性の口腔内写真必ずしも口腔内衛生状態は良いわけではない

5 むし歯菌がいない

6 ひょっとしてミュータンス菌を抑制する乳酸菌が口腔内にいるのではないか?

8 OD 13 名の口腔内から 42 菌株ミュータンス菌抑制効果系

9 歯周病菌 (P. gingivalis) に対する抑制効果

10 カンジダバイオフィルム (C. albicans GDH18 株 ) に対する抑制効果抑制している

>KO3 TCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTC TGATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTT

11 >KO3 TCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTC TGATTATTGAAAGGTGCTTGCATCTTGATTTAATTTTGAACGAGTGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTT GGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGC TGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGA GAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAAC GCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGA AGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAA AGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG CGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGT CTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGA AACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATG CGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTA ACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCC CTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACC GCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACAT CTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAG GTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCC CGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACT CTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAA TCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTA CAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTC AGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGT AATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAAC CCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAA [BLAST top 20] Score E Sequences producing significant alignments: (Bits) Value gb EF Lactobacillus rhamnosus strain IDCC S r gb EF Lactobacillus rhamnosus strain LV108 16S ribos gb EF Uncultured bacterium clone P2D S riboso emb AM Lactobacillus rhamnosus partial 16S rrna gene, i gb AF Lactobacillus casei 16S ribosomal RNA gene, parti gb AY Lactobacillus sp. rennanqilfy10 16S ribosomal gb AY Lactobacillus sp. rennanqilfy16 16S ribosomal dbj AB Lactobacillus rhamnosus gene for 16S rrna, pa gb AY Lactobacillus sp. BCRC S ribosomal RNA gb AY Lactobacillus rhamnosus strain LR2 16S ribosom gb AY Lactobacillus sp. IDLAc 16S ribosomal RNA gene gb AY Lactobacillus sp. rennanqilfy15 16S ribosomal gb AF Lactobacillus rhamnosus strain F11 16S ribosom gb AY Lactobacillus casei strain LC2 16S ribosomal R gb AY Lactobacillus rhamnosus strain LCG SHARDINGER dbj D Lactobacillus casei gene for 16S rrna gb AY Lactobacillus rhamnosus strain LR3 16S ribosom

13 以下追加データスターターとして S. thermophilus を用いて,L. bulgaricus と L. rhamnosus KO3 株を用いて発酵させ L8020 ヨーグルトを作成したまた, スターターとして S. thermophilus を用いて, L. bulgaricus のみによりプラセボヨーグルトを作成したその組成を下記に示す L8020 ヨーグルト配合成分 100g あたりエネルギー 76Kcal たんぱく質 3.5g 脂質 2.5g 炭水化物 9.9g ナトリウム 44mg カルシウム 122mg 乳脂肪分 2.5% 無脂乳固形分 9.5% プラセボヨーグルト配合成分 100g あたりエネルギー 76Kcal たんぱく質 3.5g 脂質 2.5g 炭水化物 9.9g ナトリウム 44mg カルシウム 122mg 乳脂肪分 2.5% 無脂乳固形分 9.5%

14 Q ヨーグルトを食べると口の中のむし歯菌歯周病菌が減るか?

15 ミュータンス菌の口腔内保菌の変化 * p<0.01

歯周病菌 It is reported that periodontal diseases are commomly associated with Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Dialister pneumosintes, Campylobacter rectus,

16 歯周病菌 It is reported that periodontal diseases are commomly associated with Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Dialister pneumosintes, Campylobacter rectus, Fusobacterium species, Selenomonas sputigena, Peptostreptococcus micros and spirochetes, including Treponema denticola (Kamma et al 2004). Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium species

17 歯周病菌の口腔内保菌の変化 Pg Pi * p<0.01 * p<0.01 Tf Fuso * p<0.01 * p<0.01

19 Lantibiotics バクテリオシン (Bacteriocin) は細菌類が産生するおもに同種や類縁種に対する抗菌活性をもったタンパク質やペプチドの総称通常個々のバクテリオシンの抗菌スペクトルは狭く同属から同門程度である

20 Bacteriocin Genome 解析 Sequence 192 BP; 41 A; 28 C; 61 G; 62 T; 0 other; CRC32; atgaagaagc atagtcggca tagtgaaggc gtgtggctgg atatcgtttg ttgtatcagt 60 ctatggctgg cggttggaag tttggtggcc gcggcaacgg tgattcatat taatcggcca 120 tacgtcatta ttgtgttggc attagcattt tgcgcgattg gtgagacgct gactgttttt 180 agaaattggt ga 192 抗菌スペクトルが広い哺乳類 ( ヒト ) 由来の塩基性抗菌ペプチドに類似している疎水性アミノ酸塩基性アミノ酸 pi 値が高い Sequence 126 BP; 29 A; 37 C; 28 G; 32 T; 0 other; CRC32; atgaccaaag tacggtcatc acgcctgagg ccacttacac tccgacttct aagcgcgccg 60 gctcgcgctc agttcctgac gatcgcgtgc cgagccattc tgcgttatga tttaattaat 120 agttaa 126 atggccaaag cccggccatc acgtccaagg ccgcttacac tccgatcctt aaccgcgcca 60 gctcacgctc acaaaaaatg ggccagccgt tggattttat ccatgcgact ggcccgagtt 120 ttcggtatcg aaaagccgca tggatga 147 Gen e A Gen e B Gen e C Gen e D

Bacteriocin Genome 解析 Sequence 192 BP; 41 A; 28 C; 61 G; 62 T; 0 other; 4052425725 CRC32; atgaagaagc atagtcggca tagtgaaggc gtgtggctgg atatcgtttg ttgtatcagt 60 ctatggctgg cggttggaag tttggtggcc

21 Bacteriocin Genome 解析 Sequence 192 BP; 41 A; 28 C; 61 G; 62 T; 0 other; CRC32; atgaagaagc atagtcggca tagtgaaggc gtgtggctgg atatcgtttg ttgtatcagt 60 ctatggctgg cggttggaag tttggtggcc gcggcaacgg tgattcatat taatcggcca 120 tacgtcatta ttgtgttggc attagcattt tgcgcgattg gtgagacgct gactgttttt 180 agaaattggt ga 192 抗菌スペクトルが広い哺乳類 ( ヒト ) 由来の塩基性抗菌ペプチドに類似している疎水性アミノ酸塩基性アミノ酸 pi 値が高い Sequence 126 BP; 29 A; 37 C; 28 G; 32 T; 0 other; CRC32; atgaccaaag tacggtcatc acgcctgagg ccacttacac tccgacttct aagcgcgccg 60 gctcgcgctc agttcctgac gatcgcgtgc cgagccattc tgcgttatga tttaattaat 120 agttaa 126 atggccaaag cccggccatc LRH_05489.pep acgtccaagg ccgcttacac tccgatcctt aaccgcgcca 60 gctcacgctc acaaaaaatg ggccagccgt tggattttat ccatgcgact ggcccgagtt 120 ttcggtatcg aaaagccgca tggatga 147 MKKHSRHSEGVWLDIVCCISLWLAVGSLVAAATVIHINRPYVIIVLALAFCAIGETLTVFRNW HMPREF0539_2969.pep Isoelectric Point = Gen MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG e A HMPREF0539_1169.pep Isoelectric Point = Gen MTKVRSSRLRPLTLRLLSAPARAQFLTIACRAILRYDLINS e B Gen e C Gen e D

24 Peptide Sequence pi MW AA Kog1 MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG K1α MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG Kog1-A MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG Kog1-B MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG Kog1-C MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG Kog1-RP MAKARPSRPRPLTLRSLTAPAHAHKKWASRWILSMRLARVFGIEKPHG Kog2 MTKVRSSRLRPLTLRLLSAPARAQFLTIACRAILRYDLINS 本実験に用いた抗菌ペプチドのアミノ酸配列 (Sequence), 分子量 (MW), 等電点 (pi), アミノ酸残基数 (AA) を示す 24

25 viability (%) viability (%) Streptococcus mutans Ingbritt Kog1 K1α Kog1-A Kog1-B Kog1-C Kog1-RP Streptococcus sobrinus B13 Kog1 K1α Kog1-A Kog1-B Kog1-C Kog1-RP Concentration of peptides (μm) ミュータンスレンサ球菌に対する抗菌性 25

kda 40.0 Mr. 20.0 15.0 10.0 4.6 1.7 図 2.

27 kda 40.0 Mr 図 2. Tricine-PAGE によるバンドの検出結果 Mr. はマーカーを示す Tricine-PAGE 後, CBB 染色を行った 27

Cell membrane AMPs in aqueous solution (eg.)mechanism of antimicrobial peptides Binding of AMPs to the membrane and forming α helix structures (A) (B) (C) Bahar, A. A., et al.

28 Cell membrane AMPs in aqueous solution (eg.)mechanism of antimicrobial peptides Binding of AMPs to the membrane and forming α helix structures (A) (B) (C) Bahar, A. A., et al.,(2013). Pharmaceuticals, 6(12), This is the possible mechanisms of antimicrobial peptides, and Kog1 might kill the microorganisms through similar manner.

29 FITC-labeled Kog1 and Candida (3min) When we used the FITC-labeled Kog1, Kog1 gathers candida cells within 3min.

30 FITC-labeled Kog1 and Candida (5min) 20μM 20μM Then Candida cells (including hyphae) are destroyed by Kog1.

31 歯周病患者の症例患者 : 42 歳女性主訴 : 奥歯が腫れて痛いー初診時処置ー歯肉膿瘍切開ー 2 回目処置ー切開部 SP 歯周関連検査

32 パントモ所見

33 adiponectin 動脈硬化歯周病連鎖歯槽骨吸収全身の慢性炎症肝障害糖尿病

34 IL-1β mrna Level (% of LPS alone) 結果 1 Kog1 および P.g LPS を同時に添加 ~Kog1 が IL-1β mrna の発現に与える影響 ~ 1.2 IL-1β/GAPDH ** ** ** P.g LPS (10μg/ml) Kog1(nM) (ANOVA:**p<0.01,vs P.g LPS alone)

35 ERK1 ERK2 JNK1 JNK2 JNK3 JNK pan p38α p38β p38δ p38γ MKK3 Volume (Intensity) LPS LPS+Kog LPS LPS+Kog1

36 SPR 法 SPR を利用して, 分子間相互作用による表面への有機および生体分子の吸脱着挙動を膜厚あるいは膜の屈折率変化として検出する方法センサーチップアナライトリガンドリガンド : ペプチドアナライト :P.g LPS

37 SPR angle shift (mda) SPR angle shift (mda) SPR angle shift (mda) SPR angle shift (mda) Immobilization amount of Kog1 (433mDA) Immobilization amount of Kog1 (432mDA) Time (min) Time (min) Adhesion amount of LPS (2.44 mda) Adhesion amount of LPS (5.15 mda) Time (min) Time (min) BK7 COOH in PBS PBS 1min ->EDC.NHS 5min -> PBS 1min -> Histatin5 PBS 15min->NH2EtOH3min-> PBS5min->LPS10min->PBS10min 0 平均 :2.52 mda

38 結合量 (mda) LPS との結合量 (mda) Kog Histatin <M.W> Kog1 : Histatin5 : Kog x Histatin x

39 L8020 の Kog1 Kog1C K1α adiponectin 動脈硬化歯周病連鎖歯槽骨吸収全身の慢性炎症肝障害糖尿病

40 タイトジャンクションとは内部及び外部環境間にある細胞に存在するバリア機能の 1 つ主な機能物質透過制御異物病原体の侵入阻害 ( 生体防御機能 ) 過剰な水分喪失の防止恒常性の維持 (Yuki et al. 2011) タイトジャンクション

41 TEER 値の測定方法

42 TEER(Ohms cm2 ) 乳酸菌溶菌液が GE-1 の TEER 値に与える影響 * * * * * * Cont. KO1 KO3 YU3 YU4 *:p<0.05 **:p<0.01 KO3,YU3 および YU4 の溶菌液は TEER 値を増加させた KO1,KO3 の溶菌液間には有意な差が認められた

43 乳酸菌溶菌液がタイトジャンクション関連遺伝子の発現に与える影響 Claudin-1 Occludin CON KO1 KO3 YU3 YU4 β-actin Claudin-1 :YU3 および YU4 の溶菌液で発現上昇 Occludin : 全ての乳酸菌溶液で発現上昇