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2 図1Mycobacterium 分 裂 初 期 で 隔 壁(crw)の smegmatisの 超薄 切 片像 両 端 に 接 し て メ ソ ソ ー ム(m)が 認 め られ る. 4)核(nnclena) 従 来 の超 薄 切 片 技 術 の 一 般 的 な 手 法 に な らっ てKellenberger固 定 法 を 用 い る と,ミ コバ クテ リア の核 部 位 は菌 体 中 央 部 に線 維 様 物 質 の充 満 した 部 位 と して と ら えられ る.最 近,天 児,高 出4)の 急 速 凍 結 置 換 固 定 法 を用 い た実 験 に よる と,Escherichia thisで,従 codi, Bacillus sub- 来 線 維 様 構 造 と して と らえ られ て い た 核 部 位 が 細 胞 質 全 体 に 広 くひ ろが っ て お り,高 倍 率 で は細 か な線 維 が か らみ あ って 網 目状 構 造 と して観 察 され る こ と が 明 らか に され た.ミ コバ クテ リアで は まだ こ の手 技 に よる 報 告 は 見 られ て いな い ので 推 測 の域 を 出 な いけ れ ど も,生 体 の 状 態 で は 細 胞 質 内部 は 流 動 的 であ る と思 わ れ るの で,ミ いless コバ クテ リア の核 部 位 も おそ ら く無 構 造 に近 denseな 物 質 の 分 散 した 状 態 で存 在 して い る で あ ろ う. バ ク テ リ オ フ ァ ー ジDNAの schmidt and Zahn5)に 直 接 観 察 法 がKlein- よって 開 発 され て以 来,ウ イル 図2結 核菌 の核酸 の観察法 ス,細 菌 を は じめ,動 物 細 胞 の核 酸 の観 察 も広 く行 わ れ コバ ク テ リア につ い ては 報 告 を 見 バ クテ リア の染 色体 観察 を 行 った.そ の 方 法 は ミコバ ク な か った.細 菌 の 核 の染 色 体 を菌 体 外 に放 出 さ せ る た め テ リア以外 の 細 菌 に つ い て 行 わ れ てい る の と お お む ね 同 る よ うに な った が,ミ に は,あ らか じめ 細 胞 壁 を溶 解 して ス フ ェ ロプ ラ ス トの 状 態 に して お か な け れ ば な らな い の で あ るが,ミ コバ ク テ リアの 場 合 に は,そ れ 以 外 の細 菌 と は異 な っ て細 胞 壁 じで あ るが,こ の場 合 に は 特 殊 な ス フ ェ ロプ ラ ス ト化 の 手技 が 加 え られ て い る. 菌 種,菌 株 に よ っ て 最 適 条 件 が 異 な る の で,図2に が溶 解 しに く く,単 分 子 膜 法 の最 初 の段 階 で 困 難 がつ き ヒ ト型 結 核 菌Mycobacterium ま と って い た ので あ る. に つ い て 行 っ た 実 験 を 例 と し て そ の 概 要 を 示 す. a.染 色 体 の 観 察 法3ミ ラ ス ト化 が 水 口,徳 で,筆 18 永6)に コバ ク テ リ ア の ス フ ェロ プ よ っ て よ う や く実 現 さ れ た の 者 ら は こ の 手 技 を 用 い て,い ろ い ろ な菌 種 の ミコ tuberculosis は H37Ra株 結 核 菌 を デ ュボ ス培 地 に懸 濁 培 養 し,対 数 増 殖 期 に こ の 培 地 にglycine(和 よ うに 加 え,20 24時 光純 薬)を 最 終 濃 度1.5%に 間37 なる で 培 養 を 続 け る(Myco- 電子顕微鏡

3 表1ミ bacterium smegmatisで は2時 コパ ク テ リア染 色 体 を観 察 す る条 件 とDNAの 間 で 十 分 で あ る).遠 心 表2Mycobacterium 所 見 smegmatisのdnaの 測 値 と 推 定 分 子 量(No,は 集 菌 し て か ら 次 の 酵 素 含 有 生 食 水 で 処 理 す る. 実 試 料 番 号) グ リシ ン(和 光 純 薬)1.5% サ ッ カ ロ ー ス(Sigma)15% リ ゾ チ ー ム(Sigma)300μg/ml リパ ー ビ(和 光 純 薬)300μg/ml 以 上 を 含 有 す る 生 食 水 に 菌 体 を 移 し,37,18時 ン キ ュ ベ ー トす る.こ プ ラ ス ト化 す る(た れ で90%以 に 浮 遊 させ る.展 開 液 は ペ トリ皿 に満 た した 蒸 留 水 で, は リパ ー ゼ この 水 面 上 に あ らか じめ 微 量 の タル ク粉 末 を 浮 か べ て お く と,核 酸 のひ ろが り状 態 が 見や す い.滲 透 圧 の急 激 な ェ ロ プ ラ ス トを 遠 心 集 菌 し,単 分子膜法で核酸を展開す る. 低 下 に と もな って 破 裂 した ス フ ェ ロプ ラス トの 内部 か ら 染 色 体 が 遊 出 され,タ ス フ ェ ロ プ ラ ス ト化 し た 結 核 菌 を 常 法 に し た が っ て 0.01%チ な ス ラ イ ドグ ラ ス面 に 滴 下 し,こ の 面 に そ って 展 開 液 上 の よ うに して得 ら れ た ス フ だ しM.smegmatisで を 添 加 し な くて も よ い).こ 間 イ 上 の菌 体 が ス フ ェ ロ ト ク ロ ー ムc(Sigma)を ン モ ニ ウ ム 液 に 懸 濁 し,毛 細 管 ピペ ッ トに 取 っ て,清 図3Mycobacterium Vol.20,No.1(1985) 含 有 す る1M酢 smegmatisの 酸 ア 浄 ル ク粉 末 を押 しのけ る よ うな形 で 水 面 上 に ひ ろが る.染 色 体 核 酸 は チ トクー ムc単 分子 膜 と と もに この 水 面 上 に ひ ろが るか ら,こ れ を カ ー ボ ン 補強 した グ リッ ド膜 を 上 か ら接 触 させ て膜 上 に載 せ る. ス フ ェ ロ プ ラ ス トか ら 放 出 さ れ た 染 色 体DNA 19

4 純 エ タ ノ ール に 瞬 間 的 に ひ た して か ら空 気 乾 燥 す る. 菌 体 か ら染 色 体 の 全 部 を 放 出 さ せ て 観 察,計 白 金 また は 白 金-パ ラ ジ ウ ム 合 金 で 回 転 シ ャ ドウ イン グ は,い を 行 い,透 過 電 子 顕 微 鏡 で 観 察 す る. 菌 は リ ゾチ ー ム 抵 抗 性 が 高 い た め,し シ ャ ド ウ イ ン グ せ ず,酢 4%リ 酸 ウ ラ ン で 染 色 す る 方 法 や, ン タン グ ス テ ン 酸 と エ タ ノ ー ル と の 混 合 液 で 染 色 つ で も 可 能 で あ る と は い え ず,と ラ ス ト化 が 困 難 で,染 ば し ば ス フ ェロ プ 色 体 の 放 出 も 容 易 で な か っ た,実 験 に 用 い た ミ コ バ ク テ リ ア の な か でM.smegmatisの す る 方 法 も よ い コン ト ラ ス トを 与 え る こ と が あ り,しば 染 色 体 が 最 も 完 全 に 追 跡 で き た.BCG,ヒ し ば 試 み られ た.こ H37Ra,同H37Rv,M.smegmatis,M.smegmatisの れ ら の よ り 詳 細 な 手 技 は 山 岸7β)の b.染 色 体DNAの 形 態:ミ ト型 結核 菌 ス ト レ プ トマ イ シ ン 耐 性 株 な ど で,染 文 献 な ら び に 著 書 に よ っ た, コバ ク テ リ ア の1個 の 測す る こと く に ヒ ト型 結 核 色 体 観 察 の ため の 処 理 条 件 お よ び 観 察 さ れ た 染 色 体DNAの の で 表1に 所 見 が異 な る ま と め て み た, 図3は,M.smegmatisの1菌 体 か ら放 出 され た 染 色 体 の 電 子 顕 微 鏡(電 続 した1本 の 線 維 で あ っ て,そ ドで あ る.電 連 実 測 し た 値 か ら,Lang,Bujard,Wolff Russel9)のDNA分 定 す る と 表2の 子量計算法でその分子量を推 と お り で あ っ て,大 も や や 長 く約1,200μmで,分 で あ る.こ DNAの 色 体DNAは の 線 維 は ダ ブ ル ス トラ ン 顕 写 真 を数 十 倍 に 拡 大 しマ ップ メ ー タ ーを 用 いDNAを and 顕)像 で あ る.染 腸 菌 のDNAよ り 子 量 は daltons の 値 は 光 学 的 方 法 で算 出 した ミコバ ク テ リア 分 子 量 と ほ ぼ 一 致 す る. ミコバ ク テ リアか ら も耐 性 遺 伝 子 を に な っ た プ ラス ミ ド(核外 遺 伝 子)が 分 離,観 察 され る よ うに な り(水口10), 形 態 学 の うえ か ら も遺 伝 学 的 な 研 究 に寄 与 しつ つ あ る と い って よい. 5)電 子線不透過性 顆粒 ミ コバ ク テ リ ア を 塩 基 性 色 素 で 染 色 し て 光 学 顕 微 鏡 で 見 る と,メ タ ク ロ マ ジ ー を 示 す 異 染 顆 粒 が 見 ら れ る.こ れ が 透 過 型 電 顕 で 観 察 さ れ る 電 子 密 度 の 高 い,電 子線不 透 過 性 の 円形 顆 粒 と か な らず し も一致 す るわ け で は な い が,Takeya,Koike,Yuda,Mori,Nakashima,Tokunaga and Hagiwara11)の ェ ー ト顆 粒(polyphosphate 研 究 に よ っ て,ポ granules)で リフ ォス フ あ る と報 告 さ れ て い る. 菌 体微 小 部 分 の 元 素 分 析 を電 顕 で行 った の で,そ の 方 法 と成績 を や や 詳 し く報 告 す る. a.試 料 の作 り方:全 菌 体 で 観 察 す る 場 合 と,超 薄 切 片 で観 察 す る場 合 とが あ る.超 薄 切 片 で 観 察 す る場 合 に は,使 用 したbuffer,固 図4Mycobacterium smegmatisの 小 コロ ニ ー の 多 い ので,注 意 が必 要 で あ り,と くに オ ス ミウ ム酸 固 定 微小部元素分析像 a,菌 体 先 端 部 に 電 子 密 度 の 高 い 顆 粒 が 見 ら れ る.元 素Pの 線 分 析 を こ の 画 面 に 記 録 し て い る.b.同 画 像 の 元 素Kの 分 析(顆 20 一 画 像 の 元 素Pの 粒 に 一 致 し て 集 積 像 が 見 られ る).d,同 画 像 の 元 素Kの 粒Gの 線 分 析.c,同 面 分 析(均 点 分 析.P,K,Mgの 定 液,染 色 液 な ど に含 有 され る元 素 が,菌 体 固有 の成 分 の 元 素 と ま ぎ らわ しい こ とが 一 面 一 切 片 像 の観 察 時 に は配 慮 が必 要 で あ る.凍 結 切 片 な どが 適 当 な 場 合 が 多 い.こ の超 薄 切 片使 用 時 の分 析 電 顕 法 に つ い て は,別 の機 会 に述 べ る こ と とす る, 等 に 菌 体 に 分 布).e.顆 今 回 は 全 菌 体 を試 料 と した 場 合 につ い て述 べ る が,細 順 に 量 が 多 い. 菌 の 観 察 に も っ と も適 してい る のは 膜 面 培 養 に よる試 料 電子 顕微鏡

5 作 製 で あ る.減 ぎ,こ 菌 シ ャ ー の 上 に コ ロ ジ オ ン を 滴 下 し て 膜 を 張 り,こ に ミ コバ ク テ リ ア 懸 濁 液 を 注 射 器 で 滴 下,培 ー ペ で 小 コ ロ ニ ー を 観 察 で き る ま で に,菌 間 要 す る.小 の膜上 H-6010走 種 に よ り日数 ム 製 の グ リ ッ ドも 試 み た が,今 ii)stem像 リ リウ a.顆 粒 中 心 部(A)と50nm離 分(B).d.顆 粒 中 心 部(C)と50nm離 の あ る特 定 の 菌 体 部 位 を水 平 に よ ぎる tuberculosis青山b株(d f) 点 分 析.b.顆 れ た 細 胞 質 部 分(D)を scan) 体 内 の特 定 の 部 分 に 微 小 スポ ッ トを 当 て て, よ びMycobacterium れ た 細 胞 質 部 分(B)を 量 が記録で dot map) 線 上 の元 素 分 析 を行 う線 分 析(line iii )菌 smegmatis(a c)お の画 面 全 体 に つ い て のx線 きる 面分 析(X-ray ドが 適 し て い た. 図5Mycobacterium の元 素 分 析 像 ネ 分 析装 置 を付 属 した装 置 で 観察,撮 析の方法 i)stem像 コ ロニ ー 形 成 を 見 届 け た 回 の実 験 に は銅 製 グ リ ッ 子 顕 微 鏡 に, 査 電 子 像 観 察 装 置 お よびKEVEX-7000エ c.分 ト型 結 金 製,ベ 立H-600電 影,記 録 した. う え で こ の 小 コ ロ ニ ー を 含 む コ ロ ジ オン 膜 を 切 り離 し, 銅 製 グ リ ッ ドに 載 せ て 空 気 乾 燥 す る.白 析 型 電 子 顕 微 鏡:日 ル ギ ー分 散 形X線 養 す る.ル の 違 い が あ る が,M.smegmatisで2 3日,ヒ 核 菌 で7 10日 b.分 レ内 に ソ ー トン 液 体 培 地 を 注 粒 中 心 部(A).c.細 点 分 析.e.顆 胞 質部 粒 中 心部(C).f.細 胞 質 部 分(D). Vol.20,No.1(1985) 21

6 5) Kleinschmidt, A. K. and Zahn, R. K.: Z. Naturforsch., 14b, 770 (1959) 9) Lang, D., Bujard, H., Wolff, B. and Russel, D.: J. Mol. Biol., 23, 163 (1967) 11) Takeya, K., Koike, M., Yuda, Y., Mori, R., Nakashima, N., Tokunaga, T. and Hagiwara, Y.: Ann. Rep. Jpn. Soc. Tuberc., 4, 1 (1959)

22 610407487 ロ ペ ミ ッ ク 小 児 用 0. 0 5 % 2319001C1072 23 610412059 ゲ シ ン L 錠 5 0 m g 2478001G1046 24 610412105 ソ レ ル モ ン S R カ プ セ ル 3 7. 5 m g 1147002N1

22 610407487 ロ ペ ミ ッ ク 小 児 用 0. 0 5 % 2319001C1072 23 610412059 ゲ シ ン L 錠 5 0 m g 2478001G1046 24 610412105 ソ レ ル モ ン S R カ プ セ ル 3 7. 5 m g 1147002N1 お 知 ら せ ( 薬 ) 0 0 5 平 成 2 0 年 8 月 2 9 日 医 薬 品 マ ス タ ー の 改 定 に つ い て 今 般 下 記 の と お り 医 薬 品 マ ス タ ー を 改 定 し ま し た の で お 知 ら せ し ま す 記 次 の 医 薬 品 に つ い て は 平 成 2 0 年 3 月 5 日 付 け 厚 生 労 働 省 告 示 第 7 2 号 に 基 づ

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主 要 な が ん 治 療 に つ い て 入 院 に か か る 医 療 費 の 支 払 い か ら 計 算 し た も の で す 例 え ば 胃 が ん に つ い て は 平 均 入 院 費 は 総 額 約 1 1 0 万 円 で 自 己 負 担 額 は 約 3 3 万 円 程 度 必 要 市 民 の 健 康 ~ が ん の 予 防 と 体 操 で 健 康 づ く り ~ 1 挨 拶 こ ん に ち は 長 久 手 市 役 所 健 康 推 進 課 の 伊 藤 と 申 し ま す 本 日 は よ ろ し く お 願 い し ま す 座 っ た ま ま で 説 明 さ せ て い た だ き ま す 今 回 の タ イ ト ル は 市 民 の 健 康 が ん の 予 防 と 体 操 で 健

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