Eiji OBAYASHI, Hisashi YOSHIDA and Sam-Yong PARK: The Structural Basis for an Essential Subunit Interaction in Influenza Virus RNA Polymerase. Influen

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1 Eiji OBAYASHI, Hisashi YOSHIDA Sam-Yong PARK: The Structural Basis for an Essential Subunit Interaction in Influenza Virus RNA Polymerase. Influenza A virus is a major human animal pathogen with potential to cause catastrophic loss of life. The virus reproduces rapidly, mutates frequently, occasionally crosses species barriers. The recent emergence in Asia of avian influenza related to highly pathogenic forms of human virus has highlighted urgent need for new effective treatments. No current medication targets this heterotrimeric polymerase complex. All three subunits, PB 1, PB2, PA are required for both transcription replication. PB 1 carries polymerise active site, PB2 includes capped-rna recognition domain, PA is involved in assembly of functional complex, but so far very little structural information has been reported for any of m. We describe crystal structure of a large fragment of one subunit (PA) of influenza A RNA polymerise bound to a fragment of anor subunit (PB 1). The C terminal domain of PA forms a novel fold, forms a deep, highly hydrophobic groove into which N-terminal residues of PB 1 can fit by forming a 310 helix.

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3 イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス のRNAポ 表1デ リ メ ラ ー ゼPA-PB1複 合 体 のX線 結晶構造解 析 ー タ 測 定 お よ び 精 密 化 の 結 果.(Datacollectionrefinement.) armerge= Ii-<I> / Ii, where Ii summations merit (FOM) factor 図2イ are over all amplitudes, respectively. ン フ ル エ ン ザRNAポ influenza intensity Values of an in parenses = Fbest - F.cR-factor= h Fo (h) The free - c R-factor RNA crystal of PA-PB1 polymerase.)大 observation are was (h) I hfo calculated リ メ ラ ー ゼ のPA-PB1複 の 構 造 の 結 晶 写 真.(The is reflections. 合 体 complex for (h), where with 5% of 図3イ of (Sodium Formate)を data Fc are value for this reflection, briso= FPH-FP I FP. cfigure excluded observed from calculated of structure refinement. ン フ ル エ ン ザRNAポ 体 の 構 造.(The き さ は 約0.2 リ メ ラ ー ゼ のPA-PBI複 structure 中 右 側 に あ るStickモ 用 い た 条 件 で 行 い,良 質 の単 結 晶 を 相 問 題 解 決 の た め使 用 した 重 金 属 は水 銀 化 度1mM,沈 条 件 で 結 合 す る こ と を 確 認 し,PF-BL5で 5個 mean shell. of PA-PBl 積 時 間 は12時 間 の 測 定 を行 い 分 解 の 水 銀 が タ ン パ ク 質 と結 合 し て い る こ と を 確 認 し た.位 相 計 算 に は,Solve/Resolveで デ ル がPBlのN末 端 部位 で プ ロ グ ラ ム を用 (Protein Data Bank)に お い て 調 べ た 結 果,こ れ まで に 解 明 さ れ て い る タ ンパ ク 質 に は な い 新 規 構 造 で あ り,13個 α ヘ リ ッ ク ス と9個 ま た,そ のa10,a11,α13の3つ ネ ル が 構 成 さ れ て お り,そ の ヘ リ ック ス に よ り トン こ にPB1サ ブ ユ ニ ッ トのN末 端 が 突 き 刺 さ る よ う に 結 合 し て い る(図4).こ の 際PBl は310ヘ 解 能 デ ー タ は 高 輝 度 光 科 学 研 究 セ ン タ ー(SPring-8)に ン パ ク 質 問 結 合 様 式 と して 非 常 に 珍 し い.PBIとPAサ い て 測 定 を 行 い,分 解 能2.3 明 さ れ たPAサ 日本 結 晶 学 会 誌 第50巻 お まで 解 析 す る こ とが で きた ブ ユ ニ ッ トの 立 体 構 造 は,PDB 第6号(2008) の の β シ ー トで 構 成 さ れ て い る(図3). い て 計 算 し,良 好 な 初 期 マ ッ プ を得 る こ とが で き た.高 分 (表1).解 合 complex.)図 あ る. 合 物(Thimerosal)で,濃 能3.2 in resolution Fo mm. 得 た(図2).位 <I> highest リ ッ ク ス と呼 ば れ る 構 造 を と っ て お り,こ れ は タ ユ ニ ッ ト間 の 水 素 結 合 は,主 にPB1の ブ ペ プ チ ドの 主 鎖 を 通 し て 形 成 さ れ て お り,特 にAsp2とAsn4は,PAのne

4 尾 林 栄 治,吉 田尚 史,朴 三用 図6PA-PB1サ ブ ユ ニ ッ ト間 疎 水 結 合.(Hydrophobic contacts between PA PB1.)PA-PB1サ ッ トの 疎 水 結 合 の 様 子 を,分 し て い る.PA分 図4PA-PB1サ up view はStickモ of subunits デ ル で 表 さ れ,そ 子 を 白 色,PB1分 子 を灰 色 で 示 し て い る. ブ ユ ニ ッ ト 間 結 合 部 位 の 分 子 表 面 図. (Close ブユ ニ 子 表 面 図 を用 い て 示 interaction site.)pb1 の 周 り でPAの 黒 く示 し た 部 位 と 水 素 結 合 疎 水 結 合 を 通 し て 相 互 作 用 し て い る.下 図 は 上 図 を180 回 転 して 反 対 側 か ら 見 た も の で あ る. 図7PAサ ブ ユ ニ ッ ト変 異 体 を 用 い たPBIと 験.(GST-pull-down のN末 端14残 て 調 製 し,PA野 で,GSTア assay using 基 をGSTと PA の結 合実 mutants.)pb1 の融 合 タンパ ク質 と し 生 型(WT)も し くは 変 異 体 存 在 下 フ イニ テ ィ カ ラ ム を 用 い て プ ル ダ ウ ン し,SDS-PAGEに 657は,PA分 よ りPAと の 結 合 を 分 析 し た. 子 の ア ミ ノ 酸 番 号 ま はPA分 で, 子 の ア ミ ノ 酸 番 号 ま で を 欠 失 させ た 変 異 体 で あ る. とGlu623と 図5).実 β シ ー ト に 似 た 様 式 で 結 合 し て い た(図4, 際,PAのIle621とGlu623を 欠 失 させ た 変 異 体 は,PB1と 含 む ル ー プ部 分 を 結 合 す る こ とが で き な くな っ て い る こ と を 確 認 し て い る(図7).一 図5PA-PB1サ ブ ユ ニ ッ ト間 水 素 結 合 の 模 式 図.(Schematic diagram of PA PB1.)点 あ る. 332 の 側 鎖 は,非 hydrogen bonding network 線 の 水 素 距 離 は, 常 に 広 い 範 囲 でPAと い る(図4,図6).こ between で 方,PB1の ア ミ ノ酸 疎 水 性 相 互 作 用 を して れ ま で に,PB1の1 14番 まで にあ る ア ミ ノ 酸 残 基 を 置 換 し た 変 異 体 実 験 に よ り,多 くの 疎 水 性 残 基,特 にPro5,Leu7,Leu8,Phe9とLeu10がpA 日本 結 晶 学 会 誌 第50巻 第6号(2008)

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6 尾 林 栄 治,吉 田 尚 史,朴三 用 どの 変 異 体 で もそ の 活 性 は 著 し く低 下 した.8)今 後,本 構 M. Katz T. M. Tumpey: 造 を基 に したPA-PB1サ 7558 (2008). ブユ ニ ッ ト結 合 阻害 剤 が 設 計 さ れ,抗 イ ン フ ル エ ンザ 薬 と して 応 用 され る こ とが 期 待 さ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 6) Ohtsu, Honda, Sakata, H. Kato T. Toyoda: Microbiol. Immunol. 46, 167 (2002). れ る.さ ら に,図8に RNAポ 見 られ る よ う に,イ ン フ ルエ ンザ リ メ ラー ゼ の ア ミノ酸 配列 は,す べ て の 亜 型 の イ 8) E. Obayashi, H. Yoshida, F. Kawai, N. Shibayama, A. Kawaguchi, K. Nagata, Tame S.- Park: Nature 454, 1127 (2008). ン フ ルエ ンザ ウ イ ル ス に お い て 保 存 性 が 高 く,特 にPAと PB1の 7) D. Perez O. Donis: Virol. 75, 8127 (2001). 結 合 に 関与 して い る残 基 は す べ て保 存 され て い る. 9) E. Torreira, G. Schoehn, Fernez, N. Jorba, W. Ruigrok, S. Cusack, Ortin O. Llorca: Nucleic Acids Res 35, 3774 そ の た め,今 回解 明 さ れ たPA-PB1サ ブ ユ ニ ッ ト構 造 を 基 に 開 発 され る 新 薬 は,ウ イ ル ス の 変 異 に 強 く,ま た こ れ ま で の ワ クチ ン とは 違 い,ど ん な 亜 型 の イ ン フル エ ン (2007). 10) D. Guilligay, Crepin, F. Tarendeau, P. Resa-Infante, P. Sehr, Lewis, W. Ruigrok, Coloma, T. Ortin, D. Hart S. Cusack: Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 500 (2008). ザ ウ イル ス に も効 果 が 出 る 画 期 的 な もの に な る と期 待 さ プ ロ フ ィー ル れ る. 尾 林 栄 治Eiji 5.お わ りに OBAYASHI 横 浜市 立 大 学 大学 院 国際 総 合科 学研 究 科設 計 科学 研究室 本 研 究 で は,イ ン フル エ ンザRNAポ リメラーゼのサ ブ ユ ニ ッ ト問結 合 を原 子 レベ ルで 解 明 す る こ と に成 功 した. こ れ まで 本 ポ リ メ ラ ー ゼ の 構 造情 報 は,電 子 顕 微 鏡 に よ る低 分 解 能 の もの な ど非 常 に 限 られ て お り9)立 体 構 造 を Protein Design City University 浜 市 鶴 見 区 末 広 町 Suehiro,Tsurumi,Yokohama ,Japan 最 終 学 歴:中 基 に した薬 剤 設 計 に は不 十 分 な も の で あ っ た.最 近 に な (1999年 っ て,本 ポ リ メ ラー ゼ の活 性 部位 で あ る キ ャ ップRNA結 専 門 分 野:構 合部 位 の構 造 が 報 告 され たが,明 らか に さ れ た キ ャ ッ プ Laboratory,Yokohama 横 央大 学 大学 院 理工 学研 究 科博 士 課程 修 了) 造 生 物 学 生 化 学 研 究 テ ー マ:病 気 関 連 タ ン パ ク 質 お よ びRNA結 合 タ ン パ ク質 の 構 造 生 物 学 研 究 結 合 様 式 は,ヒ トの も つ キ ャ ップ 結 合 タ ン パ ク質 の もの と非 常 に よ く似 て お り,こ の部 位 を基 に した薬 剤 は 副 作 吉 出 尚 史Hisashi 用 の心 配 が 出 て くる.10)一方 で,本 研 究 で 明 らか に な っ た 横 浜 市立 大 学 大 学 院 国 際 総 合 科 学 研 究 科 設 計 科 学 サ ブ ユ ニ ッ ト結 合 様 式 は イ ン フル エ ンザ に特 有 の もの で 研究室 YOSHIDA Protein Design Laboratory,Yokohama あ り,設 計 さ れ る 薬 剤 に よ る副 作 用 の 心 配 は 比 較 的 小 さ 横 City University 浜 市 鶴 見 区 末 広 町 い.今 後,ま だ 明 らか に され て い な い部 位 の 構 造 や,ポ リ Suehiro,Tsurumi.Yokohama ,Japan メ ラ ー ゼ 全 体 の 構 造 が 明 らか に され る こ と に よ り,そ の 最 終 学 歴:横 詳 細 な機 能 の 解 明 が な さ れ,ま た そ れ が さ ら に効 果 的 な 科 修 士 課 程2年 浜 市立 大 学大 学 院 国際 総 合科 学研 究 専 門 分 野:構 新 規 抗 イ ン フ ル エ ンザ 薬 の設 計 につ な が っ て い く と期 待 され る. S. 20, 2) 3) P. Peiris, , 5) van 334 L. Liu, A. D. de Belser, Hoeven, F. Jong Haire, Skehel, 1258 Kawaoka Academic ン フ ル エ ンザRNAポ リ メ ラー ゼ 朴 Guan: Clin. Microbial. 三 用Sam-Yong PARK 横 浜市 立 大学 大 学 院 国際総 合 科 学研 究 科 設計 科学 Rev. 研究室 Collins, Nature 4) M. 献 (2007). Walker, 研 究 テ ー マ:イ の 構造 生 物学 的研 究 文 1) 在学 中 造 生 物 学 生 化 学 S. Martin, A. Liu, Hay Russell, S. P. A. Norfolk, Zhang Blixt, Donis, Protein Design Laboratory,Yokohama 横 Gamblin: City University 浜 市 鶴 見 区 末 広 町 Suehiro,Tsurumi,Yokohama ,Japan ed.: ginfluenza Lin, (2008). Press, O. P. Virology : Current Topics h park@tsurumi.yokohama-cu.ac.jp Caister 最 終 学 歴:k阪 (2006). W. Xu: L.-M. Curr. Med. Chen, C. Busch. Chem. Pappas, McBride, 14, T C. Maines, Paulson, 程(1995年 (2007). N. 大 学 大学 院 基礎 工 学研 究 科博 士 課 専 門 分 野:構 修了) 造 生 物 学 生 化 学 研 究 テ ー マ:疾 患 由 来 タ ン パ ク質 の 構 造 生 物 学 日本 結 晶 学 会誌 第50巻 第6号(2008)

22 610407487 ロ ペ ミ ッ ク 小 児 用 0. 0 5 % 2319001C1072 23 610412059 ゲ シ ン L 錠 5 0 m g 2478001G1046 24 610412105 ソ レ ル モ ン S R カ プ セ ル 3 7. 5 m g 1147002N1

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