2013 年 12 月 12 日 ( 木 ) 文部科学省動物性集合 胚作業部会講演 多能性幹細胞と動物胚とのキメラ作製 - 現状とその可能性ー 宮崎大学テニュアトラック推進機構テニュアトラック准教授本多新
1. マウスの発生と多能性幹細胞 着床前 受精 始原生殖細胞 生殖細胞 EpiSC 着床後 ips 細胞 体細胞 ES EpiSC ips 細胞には多能性 ( 理論的にどのような組織にも分化可能 ) がある
ES 細胞を用いたキメラマウス作製 (1980 年代後半から ) 緑色遺伝子導入 マウス ES 細胞 緑色に光る ES 細胞 マウスの初期胚に注入 緑色の細胞を持つキメラマウス
3. 各動物種の ES/iPS 細胞の特徴について
多能性幹細胞の品質について ナイーブ型 幹細胞としての質が高い プライム型 幹細胞としての質は低い 高 多能性幹細胞の質とは? 精子 卵子に分化可能テラトーマ形成能未分化マーカー陽性マウスラットそれ以外 ( ヒト サル ブタなど ) キメラ形成能体外での分化能 低 ナイーブ型とプライム型の多能性幹細胞には質的な相違がある
1. マウスの発生と多能性幹細胞 着床前 ナイーブ型 受精 プライム型 始原生殖細胞 生殖細胞 ナイーブ型 ips 細胞 EpiSC 着床後 体細胞
マウス ラットから樹立される多能性幹細胞 (ES/iPS/EpiSC) マウスES/iPS 細胞マウスEpiSC(Epiblast Stem Cell) ES/iPS コロニー形態テラトーマ形成能キメラ形成能生殖細胞分化能相同組換え活性多能性維持因子 2i 培地への対応相同なマウス発生段階多能性の状態 重層 ( ドーム型 ) ありありあり高い LIF 自己複製 4.5~5.0 日胚ナイーブ型 単層 ( 扁平型 ) ありほとんど無しなし低い Fgf2, アクチビン分化 6.5~7.0 日胚プライム型
キメラ作製を利用した応用技術 ( 補完法 ) このマウスを交配してお腹から胚を取り出す この胚は本来であれば目のないマウスとして生まれるはずである 先天的に目のないマウス 正常な ES 細胞 ( 緑色 ) を注入すると ES 細胞で 本来ならば生じない目を補完した! ES 細胞が目となり 目を持ったキメラマウスが生まれてくる
先ほどの例はマウス ES 細胞をマウスの初期胚に入れた では もしも異種間でキメラを作ったらどうなるのか? 膵臓のできないマウスの初期胚に注入して ラットの ES 細胞はマウスの体の中で膵臓になれるのだろうか? ラットの ES 細胞 ( 緑 ) を メスマウスの子宮に移植したら
Cell (2010) 中内啓光先生の研究チーム ( 東京大学 ) 血糖も下がっている! マウスにラットの細胞でできた膵臓が!!
Cell (2010) このシステムの課題点 1. 寄与率はさほど高くはないが 全身に寄与している ( 寄与させる組織を完全にコントロールできるわけではない ) 2. 発生率が低い 生後の発育も悪い 3. 膵臓の発生に必須な Pdx1 欠損マウス胚をホストにしているが Pdx1 の影響を受けない他の細胞 ( 神経 血管 間質系細胞 ) はマウスの細胞なので 膵臓丸ごと全部がラットの細胞で構成されているわけではない
Genes to Cells (2011) The American J. Phathology (2012) 岡部先生の研究チーム ( 阪大 ) マウスとラットの異種間キメラによる胚盤胞補完 ヌードマウス ( 胸腺なし ) にラット由来の胸腺を補完 ラットの T 細胞は確認できなかったが マウス T 細胞の発生 維持により機能を発揮していることを確認 中内先生の研究チーム ( 東大 ) マウスによる胚盤胞補完 ( 異種間ではない ) マウス腎臓の補完に成功 尿の生成により機能を確認 ちなみに マウスの中でラットの精子も確認 ( 腎臓は異種間 ( マウス ラット ) 補完が困難 ) おそらく Sal1 遺伝子の異種間相違が原因
胚盤胞補完法を行うために必要なこと ナイーブ型 精子 卵子に分化可能 テラトーマ形成能 プライム型 未分化マーカー陽性 高 ES/iPS 細胞マウス ラットEpiSCも含むマウスラットそれ以外 ( ヒト サル ブタなど ) 低 キメラ形成能 体外での分化能 1. キメラになりうる多能性幹細胞の有無 2. ホスト胚の適合性と遺伝子破壊技術の有無 ナイーブ型幹細胞の有無はキメラ作製において有力な指標となる つまりマウスかラット以外の動物では技術的に困難 では 他の動物種で胚盤胞補完を行うためにはどうすれば良いか? プライム型の多能性幹細胞はキメラにならないのか? プライム型の多能性幹細胞をナイーブ型に変換することはできないか?
PLoS ONE(2011) 丹羽仁史先生の研究チーム ( 理研 CDB) マウス EpiSC に細胞接着因子 E-cadherin を過剰発現させれば 寄与率の高いキメラを得ることができる ( ただし 効率は低く生殖細胞には分化できない ) プライム型 ( マウス ラット以外の ES/iPS) でもキメラ動物を作製できる可能性が示唆された
他の動物種由来の ES/iPS 細胞はどうか? 幹細胞の特徴とキメラ形成能について
( ヒトへの応用を見据えた )ES/iPS 細胞研究の実験動物間の比較 サルサル ブタブタ ウサギラット ラットマウス マウス? ES (ips) 細胞の特徴 動物の価格 ( 万円 ) 飼育 維持の規模および経費 プライム型ヒト型プライム型ヒト型 (?) プライム型マウス型ナイーブ型マウス型ナイーブ型 ( 有 ) ( 有 ) ( 有 ) ( 有 ) 30~50 30~5010~30 10~30 1~20.15 0.15 0.1 大大大大中中中小小 繁殖 中程度中程度 ~ 困難 ~ 困難容易容易 容易容易 容易容易 容易 利用施設数 小 大 中 小 多 小 多小 多 少 プライム型 利用に制限 中 ヒト型だが利用に制限あり 多 プライム型 利用しやすい 多 ナイーブ型 利用しやすい
ブタ ( プライム型 ) 利点 : 臓器の大きさがヒトに近い発生工学技術が確立されている ( キメラ作製技術 クローン技術など ) 難点 :ips 細胞の比較対象として重要な ES 細胞の樹立が非常に困難樹立された ips 細胞の不安定性 ( 外来遺伝子の発現持続 ) Stem Cell and Development (2013) 花園先生の研究チーム ( 自治医科大 ) ブタは外来山中因子のサイレンシングがかかりにくいことを利用し 培養環境の変化でナイーブ型 ( 様 ) 細胞の樹立に成功 サイレンシングおよび分化能 ( テラトーマ形成能 ) に課題 内部細胞塊や中期胚の一部に寄与
サル ( プライム型 ) 利点 : 霊長類モデル発生工学技術が確立されている ( 特にマーモセット ) 難点 : 繁殖に難点あり ( 妊娠期間 140~160 日 )( 産仔数が少ない :1~2 頭 / 出産 ) 他実験動物に比べて動物倫理の壁が高い ( 高次精神構造の発達による ) Cell (2012) 立花先生 &Mitalipov の研究チーム ES 細胞由来キメラは産まれず ( 胚盤胞に寄与できず ) 4-cell 集合胚であればキメラになった プライム型多能性幹細胞はキメラになりにくい
マウス同様 数をこなせば プライム型もキメラになりうる ( 寄与率は低い ) ウサギ ( プライム型 ) 利点 : マウス ラットに次ぐ扱い安さ ( 動物価格 倫理 繁殖 ( 妊娠期間が 30 日で多産 ) 発生工学技術が確立されている ES 細胞もある難点 : 遺伝子配列情報の整備が若干遅れている ウサギの細胞に反応する抗体を見いだすのが一苦労 マウス以外ではプライム型の幹細胞由来で ( まともな?) キメラ作製の報告がある唯一の動物 ( キメラ作製実験のやりやすさ ( 高い発生工学技術 優れた繁殖能力 ) を物語っている ) Mol.Reprod. Dev. (1996) Biol. Reprod. (2010) 野生型 ( 黒 ) 白い毛がキメラ 野生型 ( ダッチベルト ) 黒い毛がキメラ 3 頭 /287 個注入 ( 約 1%) 2 頭 /188 個移植 ( 約 1%) ただし 生後 60 日目で死んでしまった
ウサギ ( プライム型 ) J.Biol.Chem.(2013) ナイーブ型への変換による幹細胞の質的改良 プライム型のウサギ ips 細胞をナイーブ型 ( 様 ) 細胞への変換に成功 ナイーブ型化 プライム型のウサギ ips 細胞 プライム型ウサギ ips 細胞は胚盤胞に寄与しない ナイーブ様ウサギ ips 細胞は胚盤胞に寄与する ナイーブ型 ( 様 ) に変換したウサギ ips 細胞 ナイーブ様に変換すれば マウス胚盤胞にも寄与できる 成熟オリゴデンドロサイトまで出現するようになった ナイーブ型様に変換することにより 体外での ( 神経系への ) 分化誘導能力が向上することも判明
4. 動物性集合胚技術 ( ヒト細胞 + 動物胚 ) の有用性 ( マウス以外で ) ドナー細胞として用いる多能性幹細胞種としては ヒト多能性幹細胞研究が圧倒的に樹立数も多く その解析も進んでいる 特に 体外での分化誘導や難治性疾患の解析などで期待されていることから その品質評価についても厳格な培養法 評価法が発達している キメラを作る際は ドナー幹細胞の品質とホスト胚の状態 ( 組み合わせ ) を検討する必要がある
体外での分化誘導でわかること できること これまでの多能性幹細胞 分化細胞という限界を越えて Cell Stem Cell (2012) 笹井先生の研究チーム ( 理研 CDB) 多能性幹細胞 分化細胞 複雑な組織 眼杯 ES 細胞の 自己組織化 により複雑な眼杯や立体網膜組織が形成されていく様子を観察することができた 立体網膜構造 長期培養により 視細胞 ( 錯体細胞 桿体細胞 ) 神経節細胞 介在神経細胞 双極細胞前駆細胞など複数の細胞から成る構造の分化誘導が可能である
サル ES 細胞をマウス初期胚へ注入した異種間キメラ胚 Stem Cell Research (2011) 予想どおり ほとんどキメラにならず
ではヒトの ES 細胞を動物の初期胚へ注入した異種間キメラ胚はどうか? Developmental Dynamics (2002) Developmental Biology (2006) ヒト ES 細胞をニワトリの初期胚へ注入した異種間キメラ胚 ( イスラエル ) ヒト ES 細胞をマウスの初期胚へ注入した異種間キメラ胚 ( アメリカ )) ヒト ES 細胞がニワトリ胚の中で神経組織に分化している 8.5 日マウス胚においてヒト ES 細胞がわずかではあるが寄与している
プライム型のヒト ES 細胞はやはりキメラとして寄与しにくい では ナイーブ型への変換はどうか? PNAS (2010) Nature (2013) Oct3/4, Klf4 の過剰発現および培養環境の変換でナイーブ型のヒト ES 細胞を樹立した 培養環境の変換だけでナイーブ型への誘導を成し遂げている コントロールには見られない広範囲にわたる神経褶の GFP のシグナル マウス 10.5 日胚におけるキメラとしての寄与
ホストとなる動物胚についての考察 異種間でキメラを作製する場合 ドナーとなる幹細胞だけでなくホストとなる動物胚についても考慮する必要がある 1. 時間軸において発生のプログラムが異なるドナー細胞と胚は同調するのか? マウス (20 日 ) とラット (23 日 ) であれば異種間でも同調したが ヒト (280 日 ) の細胞とマウス胚 (20 日 ) で同調するのだろうか? 2. キメラ動物の体内に臓器をまるごと作るような研究 ( 補完法 ) を行うためには その臓器が発生しないような遺伝子欠損ホスト胚が必要になる ( 遺伝子欠損動物をどのようにして作製するか?)
高いキメラ率が確認されているマウス ES 細胞をウサギ胚に注入した場合 胚盤胞には高効率で寄与 抗 GFP 抗体による免疫染色 拡大 14.5 日胚 A 多能性幹細胞だけでなく ホストとなる胚についても多岐にわたる解析が必要であろう 14.5 日胚 B 全体 拡大 質の高いマウス ES 細胞でも ウサギ胚には若干しか寄与できない ( 未発表 ) ホスト胚の種類 時期 方法などの検討が異種間キメラ動物作製に重要
マウス以外の動物種における遺伝子破壊 ( ゲノム編集 ) 標的結合型ヌクレアーゼの注入 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9 といった多能性幹細胞を介さずとも遺伝子破壊ができる技術が開発され 世界的な競争が激化している ほ乳動物でもマウス ラットでは成功している ブタなどでも成功例があり我々もウサギでの遺伝子破壊に成功している ( 投稿準備中 ) 他動物種における遺伝子破壊の環境も整いつつある
遺伝子欠損技術とマウス型多能性幹細胞を組み合わせた研究例 ウサギ遺伝子破壊技術 ナイーブ型にしたヒト多能性幹細胞があれば ウサギの体の一部にヒトの組織を補完することも可能になるはず 造血系組織がヒトの細胞 ( ウサギからヒトの血液 ) 器官まるごとがヒトの細胞 ( 薬理モデルなどへの展開 ) ブタやサルをホストにすれば 臓器の大きさや体内環境がよりヒトに近い状態となる
まとめ ヒト ( 型 ) 多能性幹細胞と動物胚でキメラを作製するためには ドナー幹細胞 1.E-cad の過剰発現やナイーブ化により ドナー細胞を改変してキメラ率を高める 2. ドナーとして寄与させる ES/iPS 細胞の品質評価も重要 ( 染色体異常の検定や分化能など ) ホスト胚 1. ドナーとホスト胚発生の同調化に関する研究も必要 2. マウス以外の遺伝子破壊動物作成技術は環境が整いつつある 動物性集合胚の有用性 発生メカニズムの力を借りて 機能を有した臓器の大部分を作ることさえ可能である ただし ドナー細胞がホスト胚に寄与するのか否か 寄与しない場合どうすれば寄与するようになるのか ヒトを含む様々な種での早急な検討が必要不可欠