研究成果報告書

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1 様式 C-19 科学研究費助成事業 ( 科学研究費補助金 ) 研究成果報告書 研究成果の概要 ( 和文 ): 平成 24 年 5 月 15 日現在 機関番号 :32612 研究種目 : 基盤研究 (C) 研究期間 :2009~2011 課題番号 : 研究課題名 ( 和文 ) 再生に向けたヒト人工多能性幹細胞を用いた網膜変性疾患の病態解明 研究課題名 ( 英文 ) AnanlysisoftheretinaldegenerativediseasesusingiPScells 研究代表者小沢洋子 (OZAWAYOKO) 慶應義塾大学 医学部 講師研究者番号 : 再生に向けたヒト人工多能性幹細胞 (induced-pluiripotentstemcell;ips 細胞 ) を用いた網膜変性疾患の病態解析をするために ips 細胞から分化誘導した網膜細胞を用いた実験を行った 山中研究室より供与された 201B7 細胞に加え 患者皮膚細胞に山中 4 因子をレトロウイルスで導入することで樹立した患者の遺伝子異常を持った ips 細胞において いくつかの液性因子を投与することで網膜細胞を分化誘導した この分化誘導した培養細胞において 網膜細胞特異的マーカーを発現している細胞の死に関して解析している 本研究において 患者遺伝子異常を持つ ips 細胞由来の網膜細胞を培養可能になることは その遺伝子異常による病態の解析に必須であり 重要なステップであった 引き続き研究を進めることが今後の網膜変性疾患に対する新規治療法の開発に向けて重要である 研究成果の概要 ( 英文 ): We analyzed the pathogenesis of the retinal degenerative diseases using ips cell-inducedretinalcells.wegeneratedtheipscellwhichconservespatient sgene sequences.retinalcellswereinducedbothfromcontrolipscellsandthepatient-derived ipscells,andanalyzedthecharacteristicsofthecells.thisresearchwasvaluableto clarifythepathogenesisoftheretinaldegenerativedisease,andfurtherstudyisnow requiredtoexploreanewtherapeuticapproach. 交付決定額 ( 金額単位 : 円 ) 直接経費 間接経費 合計 2009 年度 1,400, ,000 1,820, 年度 1,200, ,000 1,560, 年度 900, ,000 1,170,000 総計 3,500,000 1,050,000 4,550,000 研究分野 : 医歯薬学科研費の分科 細目 : 外科系臨床医学 眼科学キーワード : 網膜 視細胞 再生 ips 神経保護 1. 研究開始当初の背景遺伝子異常に基づく網膜色素変性症 などでは 発症時から徐々に進行して失明に至るが 進行していく視機能低下を

2 抑制する治療法で安定した効果を得られるものはほとんどなかった 神経幹細胞の研究が進むにつれ 網膜の分野でも再生治療への期待は大きくなってきているが 病的な既存の網膜神経細胞の機能回復による機能再生治療にせよ 幹細胞を用いた再生治療にせよ その治療法を確立するためには治療対象となる組織である網膜の病態解明が必要である 一方 異常遺伝子が明らかになっていても 網膜神経細胞障害 ( 死 ) のメカニズムは今のところ わかっていないものが多い 網膜視細胞の死のメカニズムに関しては マウスを用いた実験の報告が以前からあるが (Delyferetal.BiolCell 2004 総説 ) 不明の点も多く ヒト網膜細胞での研究は 検体を採取し難いことからこれまでほとんど不可能であった 一方 ヒト線維芽細胞から人工多能性幹細胞 ( induced-pluripotent stem cell;ips 細胞 ) を作成する方法が発表され (Takahashi,YamanakaCell2006) これを用いて網膜細胞を分化誘導すれば 遺伝情報を維持したままのヒト網膜細胞を誘導し培養できる可能性があった 2. 研究の目的網膜色素変性症の患者細胞から ips 細胞を樹立し 網膜細胞障害 ( 死 ) のメカニズムを分子レベルで解析することを目的とした 3. 研究の方法遺伝子異常を持つ網膜色素変性症患者の皮膚組織を採取し Yamanaka らの方法を用いてすべての体細胞に分化しうる ips 細胞を樹立した これを網膜視細胞に分化誘導する方法を再現した そして 細胞生物学的解析を行い 患者異常遺伝子を持つ網膜視細胞の死のメカニズムを解析した 4. 研究成果遺伝子異常を持つ網膜色素変性症患者の皮膚組織を採取し ips 細胞を樹立した そのうえで ips 細胞としての妥当性を 遺伝子発現 および三胚葉への分化能の解析により確認した さらに 網膜視細胞への分化を研究室でも再現することに成功した 視細胞であることはロドプシンなどの網膜の各細胞特異的マーカーを発現しているかで解析した その網膜視細胞の性質の詳細を細胞死のマーカーを中心に解析した 5. 主な発表論文等 ( 研究代表者 研究分担者及び連携研究者には下線 ) 雑誌論文 ( 計 28 件 ) すべて査読有 1. Blockadeofvascularadhesion protein-1attenuateschoroidal neovascularization.yoshikawan,noda K,OzawaY,TsubotaK,MashimaY, IshidaS.MolVis.2012;18: Epub2012Mar2. cles/pmc /?tool=pubmed 2. TheVisionVan,aMobileEyeClinic, AidsReliefEffortsin Tsunami-strickenAreas.OshimaCR, YukiK,UchidaA,DogruM,KotoT,Ozawa Y,TsubotaKKeioJMed.2012 Mar;61(1): pdf 3. Visionpreservationduringretinal inflammationbyanthocyanin-rich bilberryextract:cellularand molecularmechanism.miyakes, TakahashiN,SasakiM,KobayashiS, TsubotaK,OzawaY.LabInvest.2012 Jan;92(1):102-9.doi: /labinvest Usageofmicronutrientsupplementfor preventingadvancedage-related MacularDegenerationinJapan.Sasaki M,ShinodaH,KotoT,UchidaA,Tsubota K,OzawaY*.ArchivesofOphthalmology Feb;130(2):254-5 *Correspondingauthor. doi: /archopthalmol NeuroprotectiveEffectsofLuteinin theretina.ozaway*,sasakim, TakahashiN,KamoshitaM,MiyakeS, TsubotaK.CurrentPharmaceutical Design.2012;18(2):51-6. *Correspondingauthor.doi: / Theformationofanangiogenic astrocytetemplateisregulatedbythe neuroretinainahif-1-dependent manner.nakamura-ishizua,kuriharat, OkunoY,OzawaY,KishiK,GodaN, TsubotaK,OkanoH,SudaT,KubotaY. DevBiol.2011Dec24.[Epubaheadof print]

3 doi: /j.ydbio Neuroprotectiveresponseafter photodynamictherapy:roleofvascular endothelialgrowthfactor.suzukim, OzawaY*,KubotaS,HirasawaM,Miyake S,NodaK,TsubotaK,KadonosonoK, IshidaS.JNeuroinflammation.2011 Dec16;8:176.*Correspondingauthor. doi: / Neuraldegenerationintheretinaof thestreptozotocin(stz)-inducedtype 1diabetesmodel.OzawaY*,KuriharaT, SasakiM,BanN,YukiK,KubotaS, TsubotaK.ExperimentalDiabetes Research2011;2011: Epub2011 Nov17.Review.*Correspondingauthor. FocusIssueonDiabetic Retinopathy doi: /2011/ RolesofAMP-ActivatedProteinKinase indiabetes-inducedretinal Inflammation.KubotaS,OzawaY*, KuriharaT,SasakiM,YukiK,MiyakeS, NodaK,IshidaS,TsubotaK.Invest OphthalmolVisSci.2011Nov 25;52(12): *Equally Contributed.*Correspondingauthor. doi: /iovs Biologicalroleofluteininthe light-inducedretinaldegeneration. SasakiM,YukiK,KuriharaT,MiyakeS, NodaK,KobayashiS,IshidaS,Tsubota K,OzawaY*.JNutrBiochem.2011Jun 8.[Epubaheadofprint] *Correspondingauthor. doi: /j.jnutbio Retinalganglioncelllossin superoxidedismutase1 deficiency.yukik,ozaway,yoshidat, KuriharaT,HirasawaM,OzekiN,Shiba D,NodaK,IshidaS,TsubotaK.Invest OphthalmolVisSci.2011Jun 13;52(7): Print2011Jun.doi: /iovs Transcriptionalfactorsassociated withepithelial-mesenchymal transitioninchoroidal neovascularization.hirasawam,nodak, NodaS,SuzukiM,OzawaY,ShinodaK, InoueM,OgawaY,TsubotaK,IshidaS. MolVis.2011;17: Epub2011 May6. cles/pmc /?tool=pubmed 13. Clinicalfindingsinachoroideremia patientwhounderwentvitrectomyfor retinaldetachmentassociatedwith macularhole.shinodah,kotot,fujiki K,MurakamiA,TsubotaK,OzawaY.Jpn JOphthalmol.2011Mar;55(2): Epub2011Mar13.*Corresponding author.doi: /s HydrogenandN-acetyl-L-cysteine rescueoxidativestress-induced angiogenesisinamousecorneal alkali-burnmodel.kubotam,shimmura S,KubotaS,MiyashitaH,KatoN,Noda K,OzawaY,UsuiT,IshidaS,Umezawa K,KuriharaT,TsubotaK.Invest OphthalmolVisSci.2011Jan 21;52(1): Print2011Jan.doi: /iovs Regulationofposttranscriptional modificationasapossibletherapeutic approachforretinalneuroprotection. OzawaY,KuriharaT,TsubotaK,Okano H.JOphthalmol.2011;2011: Epub2010Nov7. doi: /2011/ Resveratrolpreventslight-induced retinaldegenerationviasuppressing activatorprotein-1activation. KubotaS,KuriharaT,EbinumaM,Kubota M,YukiK,SasakiM,NodaK,OzawaY, OikeY,IshidaS,TsubotaK.AmJPathol. 2010Oct;177(4): Epub2010Aug 13.DOI: /ajpath Retinalagingandsirtuins.OzawaY, KubotaS,NarimatsuT,YukiK,KotoT, SasakiM,TsubotaK.OphthalmicRes. 2010;44(3): Epub2010Sep9. Review.DOI: / Secondarymacularholeformationwith presumedevulsionoffovealhard exudatesinapatientwithdiabetic retinopathy.tomitay,nodak,shinoda H,OzawaY,TsubotaK,IshidaS.JpnJ Ophthalmol.2010Jul;54(4):366-8.

4 Epub2010Aug11DOI: /s z 19. Eicosapentaenoicacidsuppresses ocularinflammationin endotoxin-induceduveitis.suzukim, NodaK,KubotaS,HirasawaM,OzawaY, TsubotaK,MizukiN,IshidaS.MolVis. 2010Jul17;16: cles/pmc /?tool=pubmed 20. vonhippel-lindauproteinregulates transitionfromthefetaltotheadult circulatorysysteminretina.kurihara T,KubotaY,OzawaY,TakuboK,NodaK, SimonMC,JohnsonRS,SuematsuM, TsubotaK,IshidaS,GodaN,SudaT, OkanoH.Development.2010 May;137(9): doi: /dev Neurodegenerativeinfluenceof oxidativestressintheretinaofa murinemodelofdiabetes.sasakim, OzawaY,KuriharaT,KubotaS,YukiK, NodaK,KobayashiS,IshidaS,Tsubota K.Diabetologia.2010May;53(5): Epub2010Feb17.DOI: /s Mechanismofvisualsensations experiencedduringparsplana vitrectomyunderretrobulbar anesthesia.sugisakae,shinodak, SanoRY,IshidaS,ImamuraY,OzawaY, ShinodaH,SuzukiK,TsubotaK,Inoue M.Ophthalmologica.2010;224(2): Epub2009Sep1.DOI: / Retinalphototoxicityinanovel murinemodelofintraocularlens implantation.kuriharat,omotom, NodaK,EbinumaM,KubotaS,KoizumiH, YoshidaS,OzawaY,ShimmuraS,Ishida S,TsubotaK.MolVis.2009Dec 12;15: cles/pmc /?tool=pubmed 24. Secondarymacularholeassociatedwith centralretinalveinocclusiontreated withcorticosteroidinjection. HirasawaM,NodaK,ShinodaH,OzawaY, TsubotaK,IshidaS.JpnJOphthalmol. 2009May;53(3): DOI: /s Involvementofhyaluronanandits receptorcd44withchoroidal neovascularization.mochimaruh, TakahashiE,TsukamotoN,MiyazakiJ, YaguchiT,KotoT,KuriharaT,NodaK, OzawaY,IshimotoT,KawakamiY, TaniharaH,SayaH,IshidaS,Tsubota K.InvestOphthalmolVisSci.2009 Sep;50(9): Epub2009Apr1DOI: /iovs (Pro)reninreceptor-mediatedsignal transductionandtissue renin-angiotensinsystemcontribute todiabetes-inducedretinal inflammation.satofukas,ichiharaa, NagaiN,NodaK,OzawaY,FukamizuA, TsubotaK,ItohH,OikeY,IshidaS. Diabetes.2009Jul;58(7): Epub2009Apr23.DOI: /db Preventionofocularinflammationin endotoxin-induceduveitiswith resveratrolbyinhibitingoxidative damageandnuclearfactor-kappab activation.kubotas,kuriharat, MochimaruH,SatofukaS,NodaK,Ozawa Y,OikeY,IshidaS,TsubotaK.Invest OphthalmolVisSci.2009 Jul;50(7): Epub2009Mar11. DOI: /iovs Neuroprotectiveeffectofan antioxidant,lutein,duringretinal inflammation.sasakim,ozaway, KuriharaT,NodaK,ImamuraY, KobayashiS,IshidaS,TsubotaK. InvestOphthalmolVisSci.2009 Mar;50(3): Epub2008Nov7. DOI: /iovs 学会発表 ( 計 4 件 ) 1. Yoshida T, Koizumi H, Yuki K, Hirabayashi Y, Suzuki K, Mitani K, TsubotaK,ShimmuraS,OzawaY,Okano H.Agenetherapyforagenemutation in human ips cell using helper-dependent adenoviral vector. TheAssociationforResearchinVision and Ophthalmology (ARVO) Annual

5 Meeting. Fort Lauderdale, FL, USA, 2011/5/1-5/5 2. YoshidaT,KoizumiH,YukiK,Tsubota K,OkanoH,OzawaY.Purificationof ips cells derived from a retinitis pigmentosapatientfromfeedercells. AssociationforResearchinVisionand Ophthalmology(ARVO)AnnualMeeting. Fort Lauderdale, FL, USA, 2010/5/2-5/6 3. OzawaY,NakaoK,TsubotaK,Yoshimura A, Okano H.SOCS3 is required to temporally fine-tune photoreceptor cell differentiation. OIST Retinal Workshop The Retina: Neural Stem Cells and Photoreceptor Degeneration Okinawa, 2009/11/ YoshidaT,KumeS,HaradaT,Tsubota K,OzawaY.ExpressionofEpiplakin1 in the developing and adult mouse retina. OIST Retinal Workshop The Retina: Neural Stem Cells and Photoreceptor Degeneration Okinawa, 2009/11/9-11 図書 ( 計 0 件 ) 産業財産権 出願状況 ( 計 0 件 ) 取得状況 ( 計 0 件 ) その他 ホームページ等 ml 6. 研究組織 (1) 研究代表者 小沢洋子 (OZAWA YOKO) 慶應義塾大学 医学部 講師 研究者番号 : (2) 研究分担者なし (3) 連携研究者なし

を行った 2.iPS 細胞の由来の探索 3.MEF および TTF 以外の細胞からの ips 細胞誘導 4.Fbx15 以外の遺伝子発現を指標とした ips 細胞の樹立 ips 細胞はこれまでのところレトロウイルスを用いた場合しか樹立できていない また 4 因子を導入した線維芽細胞の中で ips 細

を行った 2.iPS 細胞の由来の探索 3.MEF および TTF 以外の細胞からの ips 細胞誘導 4.Fbx15 以外の遺伝子発現を指標とした ips 細胞の樹立 ips 細胞はこれまでのところレトロウイルスを用いた場合しか樹立できていない また 4 因子を導入した線維芽細胞の中で ips 細 平成 19 年度実績報告 免疫難病 感染症等の先進医療技術 平成 15 年度採択研究代表者 山中伸弥 京都大学物質 - 細胞統合システム拠点 / 再生医科学研究所 教授 真に臨床応用できる多能性幹細胞の樹立 1. 研究実施の概要 胚性幹 (ES) 細胞は受精後間もない胚から樹立する幹細胞であり 様々な細胞へと分化する多能性を維持したまま 長期かつ大量に培養することが可能であることから 脊髄損傷 若年性糖尿病

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