DNASIS Pro ワンペーパーマニュアルシリーズ ー 基 礎 編 <20>siRNA 設 計 - DNASIS Pro では 任 意 のシーケンスから お 客 様 自 身 の 手 によって 簡 単 に 特 異 性 の 高 い sirna 設 計 を 行 うことができ 今 回 は Local Blast と Internet Blast の 両 方 を 使 う 方 法 について ご 紹 介 し 本 マニュアルでは お 客 様 の PC に DNASIS ProV2.7 トライアル 版 がインストールされ ファ イルが 読 み 込 めることと インターネットに 接 続 できることを 前 提 としてご 説 明 しており ワンペーパーマニュアルシリーズ 入 門 編 <0>と<1>と<5>をご 参 照 下 さい 1.Local Blast 検 索 用 データベースの 構 築 sirna 設 計 機 能 では sirna ターゲット 領 域 の 特 異 性 を 高 めるため Blast 検 索 機 能 を 使 用 し この 際 に Local Blast を 実 行 するためには あら かじめ Blast 検 索 の 対 象 とするデータベースを 構 築 する 必 要 があり 今 回 は NCBI Reference Sequences(RefSeq)の Homo sapiens RNA のデータベースを 作 成 し 1お 手 持 ちのインターネット ブラウザを 開 い て 下 さい 本 マニュアルでは Internet Explorer を 利 用 しま す 2NCBI の RefSeq の FTP サイトにアクセスし て 下 さい ( 図 1) FTP サイト: ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ Homo sapiens(h_sapiens)の RNA のディレク トリ( 図 1)に 移 動 し rna.fa.gz というファイル 名 をクリックし 3 rna.fa.gz ファイルをダウンロードし PC の 適 当 なディレクトリに 保 存 し 4ダウンロードしたファイルを 解 凍 ソフトで 解 凍 し ファイルは gz 形 式 で 圧 縮 されていますので 解 凍 には 解 凍 レンジ (http://www.vector.co.jp/soft/win95/util/se0 94501.html)や Lhaplus (http://www.vector.co.jp/soft/win95/util/se1 69348.html)などをご 利 用 下 さい 5DNASIS Pro を 起 動 し 解 析 ボタンビューの 下 から2 番 目 データベース タブを 開 いて 下 さ い 図 2に 示 す 解 析 ボタンが 含 まれてい 図 2 解 析 ボタンビューの データベース タブ 上 から3 番 目 に シーケンス データベース ボタンがあり 図 1 NCBI の RefSeq の FTP サイト ヒトの 場 合 : ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/h_sapiens/h_sapie ns/rna/ 6 上 から3 番 目 にある シーケンスデータベー ス ボタンを 押 して 下 さい 図 3に 示 すダイアロ グが 表 示 され
10 OK ボタンを 押 して 下 さい Sequence Database Manager ダイアログに human_rna が 追 加 されていれば 成 功 です 図 3 Sequence Database Manager ダイアログ DNASIS Pro 内 にある 配 列 データベースを 管 理 するダイアログです 7 右 上 の New ボタンを 押 して 下 さい 8 表 示 されたダイアログの In-house タブを 選 択 して 下 さい 図 4のようになり 図 6 リストに human_rna が 追 加 11 OK ボタンを 押 して Sequence Database Manager ダイアログを 閉 じて 下 さい 12 登 録 したデータベースを Local Blast 検 索 用 に 変 換 し 解 析 ボタンビューの 下 から2 番 目 データベース タブを 開 いて 下 さい 図 7に 示 す 解 析 ボタンが 含 まれてい 図 7 解 析 ボタンビューの データベース タブ 図 4 New Database ダイアログ In-house タブを 表 示 した 状 態 9 Name に human_rna と 入 力 し Data Source は fasta file(nucleotide)を 選 択 し 右 の ボタンを 押 して 先 ほど 解 凍 した rna.fa ファイルを 指 定 し 上 から4 番 目 に Blast 検 索 専 用 データベース ボタンが あり 13 上 から4 番 目 にある Blast 検 索 専 用 データ ベース ボタンを 押 して 下 さい 図 8に 示 すダイ アログが 表 示 され 図 5 New Database ダイアログ rna.fa ファイルを 指 定 した 状 態 図 8 Blast Database Manager ダイアログ
14 右 上 の New ボタンを 押 して 下 さい 15Select Sequence Database ダイアログ( 図 9)が 開 くので 先 ほど 登 録 した human_rna データベースを 選 択 し 18 Close ボタンを 押 して Blast Database Manager ダイアログを 閉 じて 下 さい 以 上 で Local Blast 検 索 用 データベースの 構 築 は 完 了 です 他 の 生 物 種 のシーケンスに 対 して Local Blast 検 索 を 行 いたい 場 合 は 対 象 となる 配 列 ファイルをダウンロードし 上 記 の 1~18の 手 順 を 繰 り 返 して 下 さい 図 9 Select Sequence Database ダイアログ 2.siRNA 設 計 19DNASIS Pro を 起 動 し Tutorial Data ディレ クトリから Tutorial4.fsa ファイルを 開 いて 下 さ い 図 12に 示 す 表 示 となり 16 右 下 の Make ボタンを 押 して 下 さい Blast Database Manager ダイアログ( 図 10)に human_rna が 追 加 されてい 図 12 DNASISPro メイン 画 面 DNA 配 列 データを 読 み 込 んだ 状 態 図 10 Blast Database Manager ダイアログ リストに human_rna が 追 加 された 状 態 17 右 の Update ボタンを 押 して 下 さい Blast Database Manager ダイアログの human_rna の Status が Empty から Updated に 更 新 されていれば 成 功 です 20 解 析 ボタンビューの 1 番 下 の DNA- 検 索 タブを 開 いて 下 さい 図 13に 示 す 解 析 ボタン が 含 まれてい 図 13 解 析 ボタンビュー の DNA- 検 索 タブ 1 番 下 に sirna 設 計 ボ タンがあり 図 11 human_rna の Status が Updated に 更 新
21 sirna 設 計 のボタンを 押 して 下 さい 図 14のようなダイアログが 表 示 され 今 回 は Local Blast 検 索 を 実 行 するため Use the Local Blast を 選 択 し 24 Use the Local Blast の 右 の Setting ボ タンを 押 して 下 さい 図 16に 示 すダイアログ ボックスが 表 示 され 図 14 Analysis ダイアログ 22 Parameter ボタンを 押 して 下 さい 図 15に 示 すダイアログボックスが 表 示 され パラメータ 設 定 領 域 図 16 Blast Parameters ダイアログ 25 Nucleotide Database で17で 作 成 した human_rna を 選 択 して 下 さい 26 設 定 が 終 了 しましたら OK ボタンを 押 し て Blast Parameters ダイアログを 閉 じて 下 さ い 設 定 を 破 棄 する 場 合 は Cancel ボタンを 押 して 下 さい 1つ 前 の Analysis ダイアログに 戻 り 23 Blast 検 索 設 定 領 域 図 15 sirna Design Parameter ダイアログ パラメータ 設 定 領 域 の Pick up top results チェックボックスをオンにし 取 得 したい 配 列 数 に10を 入 力 しまた Pick up all results with same score のチェッ クボックスをオフにし さらに Blast 検 索 設 定 領 域 の Blast Search(Optional) チェックボックスをオンにし の Analysis ダイアログで Execute ボ タンを 押 して 下 さい 解 析 が 実 行 され 結 果 が 図 17のように 別 ウィンドウで 表 示 され 解 析 に 利 用 する 配 列 の 長 さや 設 定 したパラメ ータによって 解 析 に 非 常 に 時 間 がかかるこ とがあり 27 21
図 17 sirna Design Results Viewer sirna Design Results Viewer は 4 つのフィー ルドに 分 かれており 上 からコメントビュー マ ップビュー グラフビュー リストビューと 呼 び コメントビューには 解 析 に 利 用 した 配 列 の 名 前 やヒットした sirna 数 が 表 示 され マップビューには 解 析 に 利 用 した 配 列 に 対 する 得 られた sirna のターゲット 領 域 の 位 置 が 表 示 され グラフビューには sirna ターゲット 領 域 の GC%および Tm 値 がグラフで 表 示 され リストビューには 得 られた sirna 設 計 結 果 が リストで 表 示 されBlast 検 索 を 実 行 した 場 合 は sirna ターゲット 領 域 の Blast 検 索 結 果 がリストの 右 側 に 表 示 され sirna Design Results Viewer のツールバーよ り View メニューから Show Blast Search Result を 選 択 すると リストビューで 選 択 され ている 全 ての sirna ターゲット 領 域 の Blast 検 索 結 果 が Homology Search Results Viewer で 表 示 され 3.siRNA 設 計 結 果 のエクスポート 注 意 :Trial 版 では 結 果 のエクスポートは 行 えません 28 sirna 設 計 の 結 果 は tab 区 切 りの text 形 式 のファイルでエクスポートすることができ sirna Design Results Viewer のツールバーよ り File メニューから Export list を 選 択 し すると 名 前 をつけて 保 存 ウィンドウが 開 き sirna 設 計 結 果 をエクスポートすることができ
ここまでは Local Blast を 用 いた sirna 設 計 の 方 法 を 紹 介 しましたが Local Blast 検 索 用 デ ータベースを 構 築 せず Internet Blast を 使 用 して sirna 設 計 を 行 うことも 可 能 です ただし 回 線 の 状 況 や 解 析 に 利 用 する 配 列 の 長 さに よって 解 析 に 非 常 に 時 間 がかかることがあり このマニュアルについてご 不 明 の 点 やご 要 望 に つきましては 下 記 までご 連 絡 下 さい 株 式 会 社 日 立 ソリューションズ ライフサイエンス 本 部 E-mail:info@dnasis.jp パラメータ 設 定 の 手 順 は[2.siRNA 設 計 ]19~ 23 をご 覧 下 さい Copyright(C)2010 Hitachi Solutions, Ltd. All Right Reserved. Ver.02-B20-00 手 順 23 において sirna Design Parameter 領 域 の 設 定 後 Blast 検 索 設 定 領 域 の Blast Search(Optional) チェックボックスをオンにし Use the Internet Blast を 選 択 し 図 18 sirna Design Results Viewer 設 定 が 終 了 しましたら OK ボタンを 押 して Blast Parameters ダイアログを 閉 じて 下 さい 解 析 実 行 手 順 は[2.siRNA 設 計 ] 26 ~ 27 をご 覧 下 さい