TitleDA オリガミを使ってできること Author(s) 板東, 俊和 ; 杉山, 弘 ; 朴, 昭映 ; 山本, 清義 ; 谷口, 純 Citation 京都大学アカデミックデイ2014 : ポスター / 展示 (2014) Issue Date 2014-09-28 URL http://hdl.handle.net/2433/196011 Right Type Presentation Textversion author Kyoto University
分子科学的アプローチによる遺伝子発現の制御と機構の解明 京都大学大学院理学研究科化学専攻生物化学研究室 研究目的 : 2 つの分子化学的アプローチを駆使して研究を進めている 11) エピジェネティクな遺伝子発現の特異的な制御機構について DDAA フレームを利用して 直接可視化し解析する手法の開発 ~100 nm DA フレーム エピジェネティクな変化を 1 分子観測 22) エピジェネティクな遺伝子発現の活性化能を付与した DDAA 配列特異的結合分子による細胞の初期化 分化の制御 5'-WWCCWW-3' I (+ 3'-WWGGWW-5' SAA ヒト皮膚線維芽細胞 (DF) において ct 3/4, anog の発現上昇
細胞 生物の構造 機能における基本単位 人体 = 約 60 の細胞で構成される核 = 細胞内小器官 内部に46 本の染色体を持っている染色体 = 細胞の遺伝情報の保存と伝達を担う (Chromosome) クロマチン=DAとヒストン ( タンパク質 ) で構成される構造体 (Chroma4n) 細胞膜 核 遺伝子発現タンパク質 ( 遺伝子 ) 翻訳 mra リボゾーム クロマチンヒストン 転写 ~50nm DA 染色体
DDAA 塩基配列情報が保存されている生体分子 5' 塩基対 (base pair): A- T, G- C 塩基間で対を形成する 3' major groove 5 シトシン (C) 右巻き二重らせん構造 8 7 G 3 minor groove C グアニン (G) base pair B-DA minor groove major groove 1.1 nm 2.2 nm 3' 2 nm 5' 8 7 major groove A 3 minor groove T 5 チミン (T) アデニン (A) 1122 塩基対からなる二本鎖 DDAA の二重らせん構造モデル主溝 ((mmaajjoorr ggrroooovvee)) と副溝 ((mmiinnoorr ggrroooovvee)) が交互に現れている塩基対 ((bbaassee ppaaiirr)) はらせん内部に存在している (( 実際に分子モデルで確認!)
ナノテクノロジー研究において魅力的な素材! DA は任意に形状を設計することができる! DA の良い所 1. 塩基対 を利用して配列特異的に分子を構築することができる点 (program) 2. 空間的に 二重らせん構造体 として考えて設計することができる点 (geometry) DA 折り紙 法 Rothemund, ature, 2006, 440, 297. 数百 nm スケールで様々な 2D, 3D のナノ構造体を望むように設計 合成することができる
AFM (Atomic Force Microscope) : 原子間力顕微鏡 カンチレバーの先についた針と試料の間に働く力 ( 原子間力 ) レーザーで検出しながら 試料の表面を針でなぞる ( 走査する ) レーザー 検出器 カンチレバー 試料の表面の凹凸情報を画像 ( 動画 ) として得る 試料
DDAAナノ構造の設計と構築 機能化 可視化する技術 DA ナノテクノロジー DAと酵素の反応を 可視化する技術 DAナノ構造の設計と構築 ~100 nm 京都大学 大学院理学研究科 化学専攻 生物化学研究室 DA 折り紙技術 J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010) Rewiew: Angew. Chem. Int. Ed. 51, 874 (2012) 40 nm 40 nm J. Am. Chem. Soc. 132, 16311 (2010) Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9412 (2010) 新規二次元構造体 DA フレーム igh- speed AFM imaging system 多様なDAピースを任意に 構成する技術 ~300 nm DA ジグソウ ~300 nm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ACS ano, 5, 665 (2011) Chem. Eur. J. 16, 5362 (2010) J. Am. Chem. Soc. 133, 14488 (2011) 特異的な機能を付与した単分子 DAの挙動を観察する技術 DA トランスポーター ature anotechnology, 6, 166 (2011) ature anotechnology, 7, 169 (2012)
Template ( 鋳型 )DA DA オリガミの折り方 :2 次元 DA ナノ構造体の構築方法 Staple ( かすがい ホッチキス )DA 一本鎖 DA テンプレート (M13mp18 DA: 7249 bases) 相補的な塩基配列を持つ DA (226 種類 ) プログラム化された DA 構築 85 o C- 15 o C (- 1 o C/min) ~100 nm (288 塩基 ) 一本鎖 DA M13mp18 TTCAGGGT AAGTCCCA AGCCTTCA ACCGCACT TCGGAAGT TGGCGTGA TGAATGCC ACTTACGG 32- mer staple 一本鎖 DA ~70 nm (12 回の折り返し ) 高解像度 AFM イメージ
DA Box 構造形成と 開箱プロセスのリアルタイム観測 動的光散乱法 (DLS) による分析 folding +Staple 375 x 500 nm 2D opened Box Side I 750 x 1000 nm 3D Box 観測値 : 直径 68 nm (89%) ( 計算値 : 直径 67 nm) 開箱プロセスの AFM イメージ Box folding Top Side IV BoMom Side II Side III opened Box II III IV bottom II I top 2s- 3s 11s- 12s II bottom I 4s- 9s III bottom II 10s I DA Box 構造が段階的に開いていく様子をリアルタイムで観察することに成功した 1 image / sec rg. Biomol. Chem. 9, 2075-2077 (2011).
複数の DA パスルピースからプログラム化された自己集合によって 文字を表示させる パスルピース monomer I G F E D A 自己集合 自己集合 200 x 200 nm D A 500 x 500 nm 525 x 525 nm DA ナノ構造体が優れた ナノマテリアル になる可能性を示している
複数の 2 次元 DA ジグソウピースを用いるプログラム化した 2 次元自己集合 D A J I G S A W ACS ano o. 5 Vol. 1, 2011 ( 表紙に採用された ) D A J I G S A W 450 X 450 nm 2 次元 DA ジグソウピースによる自己集合技術は 水平と垂直 両方向へ応用が広がっていくだろう ACS ano, 5, 665-671 (2011).
2 次元 DA フレームの開発 : 一分子観察を可能にする有用な観測技術として 4 種の連結部を内包した DA フレーム構造体の設計 25nm (80 bp) 40 nm (128 bp) 25nm (80 bp) 18 nm (7 duplexes) 20 nm (64 bp) 80 nm (32 duplexes) 10 nm (4 duplexes) 40 nm (16 duplexes) 23 nm (9 duplexes) 90 nm (288 bp) 連結部には任意の配列 長さをもった DA 鎖を組み込むことが可能
我々の開発技術 DAフレーム技術によってDAの構造変化や酵素反応を単分子観測する 高速AFM測定技術 DA オリガミ技術 DAフレーム単分子観察技術 G- ４重鎖構造 40nmx40nmのナノ観察空間 DAの構造変化 G- ４重鎖構造の形成 酵素反応 DA メチル化転移酵素 DA 再構成酵素
40 nm C A 酵素 (EcoRI) の結合と反応の様子をリアルタイムで 1 分子観察する 40 nm 64 bp dsda 74 bp dsda B D CTGTAGCTCATCATGT GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT C A Sequence- specific M. Eco RI CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA TCAATTAAGAGGGCAG tensed duplex strand 64 bp dsda 張った状態 TTGCCTGAGAGTCTGG CGAGC GGAGACTCTA GAGTGTTCCT GATGGCCGT GAATTC AAGGCGGTG GGTGCGCGTT GCTCCTCACT TCCTC GCTCG CCTCTGAGAT CTCACAAGGA CTACCGGCA CTTAAG TTCCGCCAC CCACGCGCAA CGAGGAGTGA AGGAG TACAACAA ATAACAGC relaxed duplex strand 74 bp dsda 緩んだ状態 B D EcoRI メチル化転移酵素 DA 鎖を折り曲げてアデニンの 6 位をメチル化するメチル転移酵素 40x40 nm のナノ空間内の単一の酵素分子の挙動をリアルタイム観察 DA フレーム内で起きているメチル化反応の数をカウントする Eco RI on the tensed 64mer dsda 1 frame / sec メチル化観測数 : 74 塩基対 ( 緩んだ状態 )=43%, 64 塩基対 ( 張った状態 )=13% (118 フレーム中 ) J. Am. Chem. Soc. 132, 1592 (2010).
DA フレーム内での酵素 (Cre) による再構成反応のリアルタイム観察 A separated dsdas DA 組換え酵素 Cre A 再構成 A double- loops C D C D C D 基質 DA- 酵素複合体の形成 再構成された生成物 Cre 四量体 5 s 10 s 15 s 20 s 25 s 30 s 35 s 40 s 45 s 50 s Cre 四量体による再構成反応プロセスを初めてリアルタイムで直接観察することに成功した Cre 四量体は再構成の後 4 つのモノマーに解離している 0.2 frame / sec (5 x speed)
DAフレーム技術によって様々な酵素のダイナミックな結合や反応過程をリアルタイムで観察する 40 nm Eco RI methyl transferase on the 74bp DA strand 40 nm 72bp 72bp 74bp 40 nm 64bp 40 x 40 nm の領域で 直接観察 40 nm 97 ). J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, Cre recombinase on the oliday Junc\on 4 s 張力による酵素の反応性の違い 64 塩基対 張った状態 と74 塩基対 緩んだ状態 観察結果 より折り曲げやすい 74 塩基対の配列が メチル化されやすい J. Am. Chem. Soc., 132, 1592-1597 (2010) 7 s Cre : DA組換え酵素 oliday Junc4on を経由して 鎖交換反応を触媒する 180 x 180 nm, Scan rate: 1.0 frame / sec 5 s 8 s 6 s 9 s oliday Junc\on : 4本の鎖の間で 形成される構造 ucleic Acids Res., 42, 7421-7428 (2014)
[3+1] ybrid 型の G- 四重鎖構造は T- loop 形成において安定な構造であることを提唱 (2008) [3+1] ybrid 型の G- 四重鎖構造 ゲルシフト解析 K + K + +KCl - KCl ヒトテロメア配列 [5 - (GGGTTA)n- 3 ] 1 5 - GGGTTAGGGTTAGGG(T) 21 GGGT- 3 2 5 - GAGTTAGGGTTAGGG(T) 21 GGGT- 3 3 5 - GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21 GGGT- 3 4 5 - GGGTTAGAGTTAGGG(T) 21 AGGT- 3 5 5 - AGGTTAGAGTTAGGA(T) 21 AGGT- 3 濃度依存的な Tm 値 T-loop J. Am. Chem. Soc. 130, 16470 (2008).
DAフレーム技術によって 単分子 のG 四重鎖構造への形成を確認する 5 -CTGTAGCTCAACATGT-GGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-----TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACT-GAACACCCTGAACAAA-3 3 -CCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-5 AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGA-5 64量体 二本鎖DA A 3 -TGGGTTT- B C A D B 3 -TGGGTTT K+ 5 -GGGTTAGGGTTAGGGTTT K+ C D 74量体二本鎖DA 5 -GGGTTAGGGTTAGGGTTT- 5 -CGAGCGGAGACTCTAGAGTGTTCCTGATGGCCGTGAA-3 TTCAAGGCGGTGGGTGCGCGTTGCTCCTCACTTCCTC-3 3 -CTAAGAGAACAAACGA-GCTCGCCTCTGAGATCTCACAAGGACTACCGGCACTT-----AAGTTCCGCCACCCACGCGCAACGAGGAGTGAAGGAG-TACAACAAATAACAGC-5 KClが入っていない時 100 mm KClを添加後 [ 3 + 1 ] G- 四重鎖構造 拡大 1000 x 750 nm 1000 x 750 nm 225 x 225 nm G- 四重鎖構造形成 : 44% (220 frames counted)
DAフレーム技術によってG 四重鎖構造へのダイナミックな形成過程をリアルタイムで観察する A C B D + KCl A C B D +"KCl" 20 mm Tris buffer (p 8.0) 10 mm MgCl2 100 mm KCl 20 mm Tris buffer (p 8.0) 10 mm MgCl2 単分子レベルのG 四重鎖構造の形成過程をDAフレーム内で確認 200 x 200 nm 10 sec / frame J. Am. Chem. Soc., 132, 16311-16313 (2010)