CFX Manager クイックガイド version 3.1 注意 製品をご使用になる前に リアルタイム PCR 解析システム取扱説明書をよくお読みください 本書の注意事項は必ずお守りください 本クイックガイドは 必要な時にすぐに取り出して読めるように大切に保管してください

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1 CFX Manager クイックガイド version 3. 注意 製品をご使用になる前に リアルタイム PCR 解析システム取扱説明書をよくお読みください 本書の注意事項は必ずお守りください 本クイックガイドは 必要な時にすぐに取り出して読めるように大切に保管してください

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3 準備 4 Protocol 設定 5 Plate 設定 0 Start Run 設定 Status 4 測定後解析 5 Gene Expression 解析 9 データを出力するには? 3 PCRランデータファイルを呼び出すには? 3 再度同じプロトコールでランを実行したい場合には? 3 温度グラジェント機能を使用するには? 33 データ ( 蛍光曲線 ) をTarget 別に色分けするには? 34 検量線とThreshold lineの色を変更するには? 35 データポイントを一時的に除外するには? 36 Threshold lineをマニュアルで変更するには? 37 Gene ExpressionのBar Chart 以外にはどういうグラフがありますか? 38 Gene Expressionの複数のデータを統合して表示させるには? 39 Gene Expressionでサンプルグループ間の比較を行うには?( 群比較 ) 40 ユーザー設定 (User Preferences) を変更するには? 4 装置本体に保存されているデータを回収するには? 4 ( 当ガイドでは SYBR Green 検出系での発現解析を前提として 実際の操作の手順を示しています その他のアプリケーションについては 当ガイドと日本語取扱説明書を合わせてご参照ください )

4 準備 電源スイッチ. CFX 装置本体と PC が USB ケーブルで接続されていることを確認します. CFX 装置本体の電源を投入します ( 電源スイッチは本体背面右下にあります ) 3. PC の電源を投入します 4. PC のデスクトップ上にある Bio-Rad CFX Manager のショートカットアイコンをダブルクリックして起動します 5. メインウインドウ ( 下図 ) が開きます ( 複数ユーザーの設定がされている場合 ユーザーを選択した後にメインウインドウが開きます ) アイコン確認 Select Instrument Detected Instrument ペインに接続された装置のアイコンが表示されることを確認します アイコンが表示されていない場合 装置との通信ができていないので 電源等を確認してください User-defined. Startup Wizard ウインドウ内の Selected Instrument から使用する装置を選択します 例 : CFX96. Startup Wizard ウインドウ内の Select run type では User-defined ボタンをクリックします 注 : PrimePCR ボタンは日本国内では使用いたしません ) Run Setup ウインドウが開きます Protocol Plate Start Run Run Setup ウインドウは - Protocol タブ - Plate タブ - Start Run タブの三つのタブにより構成されています 左のタブより順に進めていくことで ランを実行できます Protocol では温度条件を設定します Plate ではサンプル情報や蛍光色素を設定します 4

5 Create New Select Existing Express Load Edit Selected Protocol タブ Protocol タブでは温度条件やデータ取得の設定を行います Protocol タブの説明 - Create New: 新規作成 - Select Existing: 過去に作成したプロトコールの呼出 - Express Load: プリセットプロトコールの呼出 - Edit Selected: 表示されているプロトコールの編集 当ガイドでは 左図のプロトコールを例 ( 下記参照 ) として作成していきます 初期熱変性 熱変性 アニーリング伸長反応 融解曲線 (Melt Curve) 初期熱変性 ( 酵素活性 ): 95.0 C, 0:30 熱変性 : 95.0 C, 0:0 アニーリング 伸長反応 : 60.0 C, 0:0 ( データ取得 ) 40 リピート 融解曲線 : C, 0.5 C 刻み, 0:05 Protocol タブでプロトコールを設定します Create New 新しくプロトコールを作成するために Protocol タブ内の Create New ボタンをクリックします 5

6 Protocol Editor Step Plate Read GOTO Protocol Editor が開きます Protocol Editor の説明 - Step: 青でハイライトされた部分がクリックして選択されたステップを示します - Plate Read: データ取得するステップを示しています - GOTO: 繰り返し ( サイクル ) を行う部分 ( 赤矢印 ) を設定します - Control Button: ステップ追加 / 削除などの各種ボタン Control Button Control Button の説明 - Insert Step: ステップ追加 - Insert Gradient: 温度グラジェントステップ追加 - Insert GOTO: GOTO ステップ追加 - Insert Melt Curve: Melt Curve ステップ追加 - Add Plate Read to Step: Plate Read( データ取得 ) をステップに追加および削除が可能 - Step Options: 温度制御の詳細設定 - Delete Step: ステップ削除 温度グラジェント機能については 33 ページをご参照ください Sample Volume の設定 Sample Volume に ウェルあたりの溶液量を入力します Sample Volume 例 : 0 推奨ボリューム CFX96/Connect:0uL-5uL CFX384:5uL-0uL CFX96 Deep:5uL-00uL 6

7 温度ステップの設定 グラフの上段に温度 下段に時間を入力します 例 : 最初の 95 ステップの時間を 0:30 に変更します 例 : アニーリング / エクステンションステップの温度を 60 に 時間を 0:0 に変更します GOTO ステップの設定 PCR の繰り返し ( サイクル ) を設定ために GOTO ステップをクリックします 何番目のステップに戻るか ( 赤矢印上段 ) 何回戻るか ( 赤矢印下段 ) を数値として入力します 戻る回数はサイクル数 - を入力します 赤矢印の範囲が繰り返し範囲を示します 例 : 番目のステップに戻って 39 回戻る設定になっていることを確認します 7

8 Melt Curve ステップの設定. Melt Curve ステップを追加するために まず最終ステップ ( この場合 GOTO ステップ ) をクリックします. Insert Melt Curve ボタンをクリックします Insert Melt Curve Melt Curve ステップが追加されます 例 : 65 から 95 まで 0.5 刻みで 5 秒保持した後データ取得を繰り返す設定になっていることを確認します Melt Curve Melt Curve は SYBR Green 等のインターカレーションダイ系の検証 ( 副産物の有無確認など ) に用います Melt Curve ステップは最小 0. 刻みの設定ができますが 副産物の有無確認には 0.5 刻みで行います プロトコールの編集終了と保存 プロトコール編集が終了したら OK ボタンをクリックします OK 8

9 プロトコールファイルを保存するかどうかを聞いてきます Yes をクリックして プロトコールファイルを保存します Yes プロトコールファイル (.prcl) のファイル名を入力して 保存場所を指定して Save ボタンをクリックします 例 : demo_br と入力して そのまま admin フォルダ内に保存します Save Run Setup ウインドウに戻ります Next ボタンをクリックして Plate タブ ( プレートの設定 ) へ移動します Next 9

10 Create New Select Existing Express Load Edit Selected Plate タブ Plate タブでは プレートでのサンプル配置 サンプルタイプ 遺伝子名 サンプル名の入力 測定する蛍光色素の設定等を行います Plate タブの説明 - Create New: 新規作成 - Select Existing: 過去に作成したプレート設定の呼出 - Express Load: プリセットプレート設定の呼出 - Edit Selected: 表示されているプレート設定の編集 Express Load 簡易プレート設定 CFX システムは常に全ウェルのデータを取得しますので 簡易プレート設定を行なって ラン終了後に詳細設定を行うことも可能です ( 注 : Scan Mode は変更不可 ページ参照 ) 簡易プレート設定を行う方法は 左図のように Express Load から Quick Plate で始まるプリセットの設定を選択して Next ボタンをクリックして進めます 具体的には下記の表をご参照ください ラン終了後 ~ ページを参考に詳細プレート設定を行ってください CFX96 Touch/CFX96 Deep CFX384 Touch CFX Connect SYBR Green 系の測定 Quick Plate_96 wells_sybronly.pltd 5 波長すべての測定 Quick Plate_96 wells_allchannels.pltd SYBRGreen 系の測定 Quick_Plate_384 wells_sybronly.pltd 4 波長すべての測定 Quick_Plate_384wells_AllChannels.pltd SYBR Green 系の測定 Quick Plate_96 wells_sybronly.pltd 波長すべての測定 注 ( 下記参照 ) 注 : CFX Connect で Quick_Plate_96 wells_all Channels.pltd を選択して ランを実行するとエラーが表示されます CFX Connect では 波長測定システムのため チャンネル 3 4,5 番目の色素が選ばれているプレート設定をランすることができません CFX Connect で 波長測定を行う場合には Express Load から Quick_Pkate_96 wells_all_channels.pltd を選択した後 Edit Selected をクリックして Plate Editor に入って Select Fluorophores でチャンネル 3 4,5 番目の色素のチェックを外します (3 ページ参照 ) Plate Editor を閉じて プレート設定を保存した後 ランを実行します 0

11 HK TG 当ガイドでは 左図に示すプレート設定を例として作成していきます 遺伝子 ( プライマーセット ) について リファレンス遺伝子 (HK)x ターゲット遺伝子 (TG)x サンプルタイプについて スタンダード (0^6~0^ pg 0 倍希釈 5 段階 ) テンプレート無しコントロール 比較サンプル A, B の二種類 リプリケートについて N=3(Triplicate) 詳細プレート設定 Create New 新しくプレートの作成を行うために Plate タブ内の Create New ボタンをクリックします plate Well Loading Control Plate Editor Plate Editor ウインドウが開きます Plate Editor の説明 - plate: サンプルのプレート上での配置を示します - Well Loading Control: 各ウェルの蛍光色素 ( 遺伝子名 ) サンプル名などの設定を行います

12 Plate Editor Plate Type プレートタイプの設定 Settings メニューから Plate Type で使用するプレートを選択します BR White: 白色プレート / チューブ BR Clear: 透明プレート / チューブ 例 : BR White 白色プレートは透明プレートよりも蛍光の反射が大きいため 高い蛍光値が得られることと プレートの汚れなどの影響を受けない利点があります 注 : CFX384 システムでは BR White のみです スタンダード単位の設定 スタンダードの濃度の単位を Settings メニューの Units から選択します 例 : picograms Units Scan Mode( 測定方式 ) の設定 3 種類の Scan Mode から測定方式を設定します Scan Mode SYBR/FAM only: SYBR Green 系または FAM 色だけの測定 (Channel のみ使用 ) All Channels: 全波長測定 FRET: FRET ケミストリー用 ( 核酸検出には使用しません ) 例 : SYBR/FAM only 注 : Scan Mode はラン開始後変更することはできません SYBR/FAM only で測定すると 他のチャンネルのデータは取得されないので ご注意ください

13 Select Fluorophores 蛍光色素の設定. 使用する蛍光色素を選択するため Select Fluorophores ボタンをクリックします. 使用する蛍光色素にチェックを付けます 例 : SYBR Scan Mode で SYBR/FAM only 設定にしている場合 Channel の蛍光色素情報しか表示されません Scan Mode で All Channel に設定すると 左図のように全チャンネルの蛍光色素が表示されます 下記の表は各チャンネルの励起波長 (Ex) 測定波長 (Em) 測定可能な蛍光色素名 CFX システムでの測定チャンネルの有無を示します 注 : 出荷時期により 一部の蛍光色素が登録されておりませんので ご注意ください Channel Ex (nm) Em(nm) Fluorophore CFX96 Touch CFX96 Deep CFX384 Touch CFX Connect FAM,SYBR HEX,TET,Cal Gold 540,VIC,Cal Orange ROX,Texas Red,Cal Red 60,TEX Cy5,Quasar Quasar705,Cy5.5 3

14 Sample Type の設定 Sample Type を設定します Unknown Standard NTC から選択します Standard. Standard に設定したいウェル領域をドラッグにて指定します 例 : A から E6 をドラッグ. Sample Type から Standard を選択します Sample Type は以下の選択肢があります - Unknown: 未知サンプル - Standard: 検量線用の標準サンプル - NTC: テンプレート無しコントロール - Positive Control: 陽性コントロール - Negative Control: 陰性コントロール - NRT: 逆転写無しコントロール. NTC に設定したいウェル領域をドラッグにて指定します 例 : F から F6 をドラッグ. Sample Type から NTC(No Template Control) を選択します NTC. Unknown に設定したいウェル領域をドラッグにて指定します 例 : G から H6 をドラッグ. Sample Type から Unknown を選択します Unknown 4

15 遺伝子名 ( プライマー名 ) の設定 遺伝子名 ( プライマー名 ) を割り当てるために Target Name の設定を行います Target Name 遺伝子名を設定すると遺伝子名毎にデータ解析できるようになります. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : A から H3 をドラッグ. Target Name 欄に遺伝子名を入力して Enter キーで確定します 例 : HK 同様に他の遺伝子名も設定していきます Target Name. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : A4 から H6 をドラッグ. Target Name 欄に遺伝子名を入力して Enter キーで確定します 例 : TG リプリケートの設定 (Standard) Standard のリプリケート (N 数 ) 設定を行います. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : A から E3 をドラッグ. Replicate Series ボタンをクリックします Replicate Series リプリケート設定を行うと数値データの平均値 SD 値が自動計算されます 5

16 3 Replicate Size Starting Replicate # Horizontal / Vertical 4 Apply リプリケートの設定を行います. Replicate Size に N 数を入力します 例 : 3. Starting Replicate # に割り振る最初の番号を入力します 例 : 3. リプリケートの割り振り方向を選択します 例 : Horizontal 4. Apply ボタンをクリックします 濃度の設定 (Standard) スタンダードの濃度の割り振りを設定します ( 希釈系列の場合 Dilution Series を使用するのが便利です ) リプリケート設定に続いて Dilution Series ボタンをクリックします Concentration で.00E+06 という指数表記は,000,000 と同じです Dilution Series 濃度の割り当てを行います 4 3 Starting Concentration Replicate from to Dilution Factor Increasing / Decreasing 5 Apply 6. Starting Concentration に最初の濃度を入力します 例 :,000,000. Replicate from と to に設定したい Replicate 番号を入力します 例 : (from) (to) 5 3. 希釈率を Dilution Factor に入力します 例 : 0 4. 増加させる場合は Increasing を 減少させる場合は Decreasing を選択します 例 : Decreasing 5. Apply ボタンをクリックします

17 同様に他の遺伝子 (Target) についてもリプリケート設定 (Replicate Series) や濃度割り当て (Dilution Series) を行います 設定範囲をドラッグします 例 : A4 から E6 をドラッグします 3 Replicate Size Starting Replicate # Horizontal / Vertical 4 Apply Replicate Series. Replicate Size に N 数を入力します 例 : 3. Starting Replicate # に割り振る最初の番号を入力します 例 : 6 3. リプリケートの割り振り方向を選択します 例 : Horizontal 4. Apply ボタンをクリックします Starting Replicate # は遺伝子別で違う番号を割り振りしないとアラートが表示されます Dilution Series 4 3 Starting Concentration Replicate from to Dilution Factor Increasing / Decreasing 5 Apply 7. Starting Concentration に最初の濃度を入力します 例 :,000,000. Replicate from と to に設定したい Replicate 番号を入力します 例 : (from) 6 (to) 0 3. 希釈率を Dilution Factor に入力します 例 : 0 4. 増加させる場合は Increasing を 減少させる場合は Decreasing を選択します 例 : Decreasing 5. Apply ボタンをクリックします

18 リプリケートの設定 (NTC) NTC のリプリケート設定を行います (NTC のリプリケート設定は省略しても問題はありません ) Replicate Series. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : F から F6 をドラッグ. Replicate Series ボタンをクリックします Replicate Series 3 Replicate Size Starting Replicate # Horizontal / Vertical 4 Apply. Replicate Size に N 数を入力します 例 : 3. Starting Replicate # に割り振る最初の番号を入力します 例 : 3. リプリケートの割り振り方向を選択します 例 : Horizontal 4. Apply ボタンをクリックします リプリケートの設定 (Unknown) Unknown(HK 側 ) のリプリケート設定を行います. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : G から H3 をドラッグ. Replicate Series ボタンをクリックします Replicate Series 8

19 3 Replicate Size Starting Replicate # Horizontal / Vertical 4 Apply Replicate Series. Replicate Size に N 数を入力します 例 : 3. Starting Replicate # に割り振る最初の番号を入力します 例 : 3. リプリケートの割り振り方向を選択します 例 : Horizontal 4. Apply ボタンをクリックします Unknown(TG 側 ) のリプリケート設定を行います. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : G4 から H6 をドラッグ. Replicate Series ボタンをクリックします Replicate Series 3 Replicate Size Starting Replicate # Horizontal / Vertical 4 Apply Replicate Series. Replicate Size に N 数を入力します 例 : 3. Starting Replicate # に割り振る最初の番号を入力します 例 : 3 3. リプリケートの割り振り方向を選択します 例 : Horizontal 4. Apply ボタンをクリックします 9

20 サンプル名の設定 (Unknown) Unknown についてサンプル名 (Sample Name) を入力します Sample Name. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : G から G6 をドラッグ. Sample Name に名称を入力して Enter キーで確定します 例 : SampleA 他の Unknown についてもサンプル名 (Sample Name) を入力します Sample Name. 設定したい領域をドラッグにて選択します 例 : H から H6 をドラッグ. Sample Name に名称を入力して Enter キーで確定します 例 : SampleB プレート設定の保存 プレート設定が完了したら OK ボタンをクリックします OK 0

21 プレートファイルを保存するかどうかを聞いてきます Yes をクリックして プレートファイルを保存します Yes プレートファイル (.pltd) のファイル名を入力して 保存場所を指定して Save ボタンをクリックします 例 : demo_br と入力して そのまま admin フォルダ内に保存します Save Run Setup ウインドウに戻ります Next ボタンをクリックして Start Run タブ ( ラン実行 ) へ移動します Next

22 Start Run 設定 Start Run タブで接続されている装置の確認をして Open Lid ボタンをクリックして 装置のリッドを開きます 装置の確認 Open Lid CFX 装置本体の前面にあるボタン ( 左図参照 ) を押すことで リッドの開閉を行うこともできます リッド開ボタン リッド閉ボタン プレートもしくは 8 連チューブをブロックにセットして Close Lid ボタンをクリックして 装置のリッドを閉じます 8 連チューブをブロックにセットする場合 上下左右均等に配置します 下図のように 左端にサンプル 8 連チューブを置いた場合には 反対側の右端にダミー 8 連チューブをセットします Close Lid

23 Start Run ボタンをクリックして ランを開始します Start Run PCR ランデータファイル (.pcrd) のファイル名を入力して 保存場所を指定して Save ボタンをクリックします 例 : demo_br と入力して そのまま admin フォルダ内に保存します Save ランが開始されます 3

24 Run Status Status Add Repeats Skip Step Stop Realtime Status Run Status ランのプロトコール状況は Run Status タブにて確認できます ラン状況によって リピート数の調整や強制終了を行うことができます Add Repeats: リピート数を増やすことができます Skip Step: 次のステップへ進めることができ GOTO ループから抜け出すこともできます Stop: 強制的にランを終了させることができます データは終了させた時点まで保存されます Realtime Status ラン中の蛍光強度変化を確認できます Plate Setup ドロップダウンから View/Edit Plate を選択することでプレートの編集ができます Plate Setup Time Status Time Status ランの残り時間は Time Status タブでも確認できます 4

25 Amplification Well Selector Standard Curve spread sheet Quantification タブ 測定後解析 ランが終了すると 自動的に解析画面 (Data Analysis ウインドウ ) が開きます 通常 Quantification タブが表示されます Amplification: 蛍光増幅曲線グラフ Standard Curve: 検量線グラフ Well Selector: ウェル情報 spread sheet: 結果表 ( 簡易 ) いずれかのデータにカーソルを合わせると連動して他のデータもハイライトされます Analysis Mode 解析モードの変更 解析モード (Analysis Mode) を Flurophore から Target に変更します Target に変更することにより SYBR Green などの 色測定ではターゲット ( 遺伝子 ) 別で解析が可能になります Fluorophore は多波長測定時に使用します Target モードに変更すると Amplification で Target 別に Threshold Line が引かれ Standard Curve で Target 別に検量線が表示されます Target 別検量線 Threshold line は自動で設定されますが 手動での設定は 3 ページをご参照ください Target 別 Threshold line Target Name Amplification 下部のチェックボックスに Target Name が表示されます チェックボックスにチェックを入れると 目的の Target 遺伝子のデータのみを表示することができます 5

26 Well Selector( ウェル表示選択 ) 非選択 ( 灰色 ): データ非表示未設定 ( 濃い灰色 ) ウェルを選択 ( 水色 ) することで Amplification などにデータ表示されます 選択状態のウェルをクリックすると 非選択状態 ( 灰色 ) になり データが表示されません 非選択ウェルは表示がされていないだけで 解析から除外はされていません 解析から除外する場合には 34 ページをご参照ください 選択 ( 水色 ): データ表示 Standard Curve( 検量線 ) Target 毎または Fluorophore 毎に検量線が作成されます : Standard : Unknown(Unknown は Well Selector で選択されているウェルのみグラフに表示されます ) 解析時のプレート編集 View/Edit Plate 解析時にプレートの編集を行いたい場合には Plate Setup から View/Edit Plate を選択して Plate Editor ウインドウを呼び出します Plate 設定法は ~ ページをご参照ください Scan Mode 以外すべての設定を変更できます 6

27 Quantification Data Quantification Data タブ 詳細な数値データを確認したい場合には Quantification Data タブを開きます Plate で Replicates の設定を行っていると各ウェルの数値情報に加え 平均値 SD 値が自動算出されます データシート情報のエクスポートはシート上で右クリックして表示されるメニューで行います 詳細は 3 ページをご参照ください Melt Curve Melt Curve タブ Melt Curve の結果を確認します Custom Data View Customer Data View タブ Custom Data View タブはいくつかのグラフや結果シートをまとめて 画面に表示させることができます 一覧表示の行数 列数を増減 ( 最大 3) することが可能 データ一覧の表示状態をプリセットとして保存や呼出のためのメニュー 各データの上部のプルダウンメニューから表示させたいデータを選択 7

28 End Point End Point タブ 最終サイクル付近での蛍光値についての解析を行うタブです 最終サイクルから特定設定のサイクル数での平均蛍光値でポジティブ ネガティブの判定を行うことが可能です ( 定量判定ではないのでご注意ください ) QC QC タブ ランのデータが正常とする基準をクリアしているかどうかを確認することができます 基準値は自由に変更することができるので 実験の目的に沿った基準を設けることができます Run Information Run Information タブ 実行したランのプロトコールを確認することができます 8

29 Gene Expression 解析 Gene Expression Experiment Settings 遺伝子発現解析を行うには Gene Expression タブを使用します. Gene Expression タブをクリックします. リファレンス ( 一般にハウスキーピング遺伝子が選択されます ) やコントロール ( 基準となるサンプル ) の指定をするために Experimental Settings ボタンをクリックします Experimental Setting ウインドウが開きます Target タブの説明 Name: Target Name と同じ表示 Full Name: 略称ではない遺伝子名を入力可能 Reference: 下記参照 Color: グラフの色を変更可能 Show Chart: グラフ表示の有無 Auto Efficiency: チェックがついているとプレート上にある検量線の増幅効率 (E) が自動的に反映 Efficiency: 増幅効率 ( 数値の変更も可能 ) Targets タブにプレートにて設定した Target Name のリストが表示されています. リファレンスとして設定したい Target Name の Reference 欄にチェックを付けます Reference OK 例 : HK の Reference 欄にチェックを付けます. OK ボタンをクリックし 設定を保存して Experiment Settings ウインドウを閉じます 9

30 Bar Chart にグラフが表示されますが これはコントロールサンプルを基準としていない状態です コントロールサンプルの設定はグラフの右側にある Control Sample から選択します Control Sample 例 : Control Sample から SampleA を選択します Control Sample で選択したサンプルを基準として Bar Chart に発現量比較グラフが表示されます 発現量比較グラフ グラフの並びはグラフ上で右クリックして表示されるメニューから Sort を選んで変更ができます Mode: Cq はリファレンス遺伝子で補正する設定 Cq は補正しない設定 Graph Data: Relative to zero は 0 からグラフが伸びる表示 Relative to control は からグラフが伸びる表示 発現量数値データ Bar Chart の下には発現解析の発現量数値データが表示されます Expression: 発現量比 Expression SEM: 発現量比での標準誤差 Mean Cq: Cq 値の平均値 Cq SEM: Cq 値での標準誤差 注 : もし Bar Chart にグラフが表示されない場合 Unknown の Sample Name や Target Name の入力が間違っている場合があります 再度 Plate Editor を呼び出して (Plate Setup > View/Edit Plate) Unknown の Sample Name や Target Name を確認してください 特に Sample Name は Target が違う場合でも同じサンプルであれば 全く同じ Sample Name にする必要があります 30

31 データを出力するには? データの出力方法はいくつかあります レポートの作成 Data Analysis ウインドウの Tools メニューから Report を選択して Report ウインドウを呼び出します レポート形式で直接印刷も可能ですが PDF ファイルとして保存も可能です Report 数値情報の出力 spread sheet になっているデータは全て右クリックして表示されるメニューから形式を選んで Export が可能です 右クリック Export to Excel グラフの出力 グラフも右クリックして表示されるメニューから Save Image As を選ぶと画像ファイルとして保存が可能です 右クリック Save Image As 3

32 PCR ランデータファイルを呼び出すには? メインメニューの File > Open > Data Files を選択します Data Files. 該当ファイルを選択します. Open ボタンをクリックします 該当ファイルの解析画面が開きます Open 再度同じプロトコールでランを実行したい場合には? PCR ランデータファイル (.pcrd) を開いた状態で Data Analysis ウインドウのメニューから File > Repeat Run を選択します Repeat Run Run Setup が開き 全く同じ Protocol と Plate でランが可能です また Protocol や Plate の各タブをクリックして編集を行うことも可能です 3

33 温度グラジェント機能を使用するには?. Protocol Editor ウインドウで設定したいステップをクリックして 選択します. Step Options ボタンをクリックします Step Options. Step Options ウインドの Gradient フィールドに温度グラジェント幅を入力します. A から H 列の各列の予想温度が表示されます 列に直接温度を入力して 修正することもできます 3. 設定が終了したら OK ボタンをクリックします Gradient 3 OK 設定したステップで 上限と下限の温度が表示されて 温度グラジェント機能が適用されていることを示しています Insert Gradient ボタンをクリックすることで 温度グラジェント設定のステップを追加することもできます Insert Gradient 33

34 データ ( 蛍光曲線 ) を Target 別に色分けするには? 右クリック Amplification で蛍光曲線をターゲット別で色分けするために Trace Styles を呼び出します. Amplification のグラフ上で右クリックします. 表示されるメニューから Trace Styles.. を選択します Trace Styles Trace Styles ウインドウが開きます. Use Target Colors ボタンをクリックします. OK ボタンをクリックして閉じます Trace Styles では個別のウェルの色を変更したり ランダムに色を割り当てることもできます OK Use Target Colors Amplification の蛍光増幅曲線の色が Threshold line と同じ色に変更されます その他のデータ (Melt Curve など ) についても同時に曲線の色が変更されます Threshold line の色の変更は 35 ページをご参照ください 蛍光増幅曲線が Target 別色分け 34

35 検量線と Threshold line の色を変更するには? Plate Editor を呼び出し (6 ページ参照 ) Plate Editor ウインドウ内の Experimental Settings ボタンをクリックします Experimental Settings. Experimental Settings ウインドウ内の Show Analysis Settings にチェックを付けます. Color 欄が表示されて 各 Target の色を変更できます 3. 色を変更した後 OK ボタンをクリックします 3 OK Show Analysis Settings. Plate Editor ウインドウを閉じる際に OK ボタンをクリックします. Apply Change? と聞いてくるので Yes ボタンをクリックして適用します 色変更の適用がされると 検量線 (Standard curve) と Amplification の Threshold line の色が変更されています Yes OK 35

36 データポイントを一時的に除外するには? Quantification タブで解析から除外したいデータポイントがある場合 Amplification グラフの除外したい蛍光増幅曲線の上で右クリックすると 表示されるメニューに Exclude from Analysis が表示されます それを選択すると一時的に解析から除外されます 右クリック Exclude from Analysis Well Selector でも除外したいウェルの上で右クリックすると 表示されるメニューに Exclude from Analysis が表示されます 右クリック Exclude from Analysis 除外したデータポイントを戻すには Well Selector の該当ウェル上で右クリックして表示されるメニューから Include in Analysis を選択します 選択すると 解析に含まれるようになります 右クリック Include in Analysis 36

37 Threshold line をマニュアルで変更するには? Threshold line はマニュアルで変更する場合には つの方法があります Threshold line 直接 Threshold line をドラッグ. Log Scale にチェックをつけて 縦軸を Log に変更します. 検量線がない場合 Threshold line を増幅曲線が並行に立ち上がる領域の中心に設定します 検量線がある場合 検量線の相関係数 (R^) が最も高くなるように Threshold line をドラッグして決定します Log Scale 並行に立ち上がっている領域 数値での指定 (Baseline Threshold). Amplification グラフの下にある Target で設定したい つの Target のみ残して他のチェックは外します. Amplification グラフ上で右クリックします 3. 表示されるメニューから Baseline Threshold を選択します 右クリック 3 Baseline Threshold Target Baseline Threshold ウインドウの下部にある Single Threshold の User Defined を選択して 数値を入力します 元の Auto に戻すには Auto Calculated を選択します User Defined 37

38 Gene Expression の Bar Chart 以外にはどういうグラフがありますか? Gene Expression のグラフには Bar Chart( 棒グラフ ) 以外に 4 種類のグラフがあります つのサンプル間で多くの遺伝子を比較する場合などに適しています Clustergram サンプル間で多数の遺伝子の発現 ( 促進 抑制と単純化 ) を比較して パターン別 ( 階層化 ) に分けて系統樹解析を行います 同じようなパターンを示す遺伝子群などを発見できやすくなります Clustergram 赤は発現促進 緑は発現抑制 Scatter Plot 赤は発現促進 Scatter Plot つのサンプル間で各遺伝子の発現量をプロットして比較します より発現が促進されている もしくは発現が抑制されている遺伝子を見つけやすくします 緑は発現抑制 Volcano Plot Volcano Plot つのサンプル間で各遺伝子の発現量と同時に有意差 (p 値 ) があるかどうかを同時に表示します 発現量の違いが統計的に有意差があるかどうかが確認できます 赤は発現促進 緑は発現抑制 Heat Map プレートマップ上で どこのウェルの発現量が多いか 少ないかを示します 色の濃さで発現の促進と抑制程度をウェル ( 遺伝子 ) 別に確認できます Heat Map 青線以上は有意差あり 赤は発現促進 緑は発現抑制 38

39 Gene Expression の複数のデータを統合して表示させるには? Gene Study 複数のデータファイルを統合して一つのグラフにまとめる機能を Gene Study と呼びます メインメニューから File > New > Gene Study を選択します 注 : Gene Study を利用するには 各データファイルで Gene Expression 解析の設定を事前に行なっておく必要があります Add Data Files ボタンをクリックして 統合したいデータファイル (.pcrd) を複数選択します 選択されたデータファイルはリスト表示されます Add Data Files Study Analysis タブをクリックすると 統合された結果が表示されます Study Analysis Control Sample を改めて設定し直します 39

40 Gene Expression でサンプルグループ間の比較を行うには?( 群比較 ) Gene Expression では Sample Name とは別に Biological Set Name を設定することで サンプルグループ間での遺伝子発現解析を行うことができます Biological Set Plate Editor を呼び出し (6 ページ参照 ) Plate Editor ウインドウの下部にある Biological Set にチェックを入れます Plate Editor ウインドウのプレート上のウェルを選択して Biological Set Name にサンプルグループの名称を入力します Biological Set Name 解析を行いたいサンプルグループ全てに名称を入力した後 OK ボタンをクリックして 設定を保存し Plate Editor ウインドウを閉じます Gene Expression の Experiment Settings を呼び出し (9 ページ参照 ) Experiment Settings ウインドウの下部の Biological Set Analysis Options ドロップダウンメニューから Target vs Biological Set を選択することで サンプルグループ間の発現量比較グラフが表示されます Biological Set Analysis Options Biological Set は Gene Study でも利用できます 40

41 ユーザー設定 (User Preferences) を変更するには? User Preferences にてデフォルトのユーザー設定を変更することができます User Preferences メインウインドウメニューの User から User Preferences を選択することで 呼び出します Protocol タブや Plate タブで設定を変更することで 新規での Protocol や Plate 作成を行なった時のデフォルト設定を規定できます Data Analysis タブでは Analysis Mode のデフォルト設定を Target モードに変更することも可能です Data Analysis デフォルト設定を変更すると ランが終了した時点で Target モードでの解析状態になりますので Fluorophore モードからの変更は必要無くなります Analysis Mode 4

42 装置本体に保存されているデータを回収するには? 右クリック ラン開始時にデータファイル ( 拡張子.pcrd) は PC 内に自動保存されますが 不測のトラブルでデータファイルが PC から紛失した場合 本体に保存されているデータを回収して解析することができます Retrieve Data Files 接続されている装置のアイコン上で右クリックして表示されるメニューから Retrieve Data Files を選択します PC 上にデータを保存する場所を指定するウインドウが表示されます 新しくフォルダを作って (Make New Folder) そのフォルダを指定して OK ボタンを押します Make New Folder 指定したファルダに 本体に保存されているデータ ( 直近の最大 0 ファイル ) が保存されます OK 保存されたデータ ( 拡張子.zpcr) はまだ解析用のデータファイルではないため 変換作業が必要です メインメニューから File > Open > Stand-alone Run を選択して 変換したい zpcr ファイル ( ランの日付と時間がファイル名になっている ) を選択して開くと 変換後の pcrd ファイルの保存場所を指定します Stand-alone Run 保存された後 データの解析画面が表示されます 4

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44 バイオ ラッドラボラトリーズ株式会社本社 東京都品川区東品川 --4 天王洲セントラルタワー 0F Tel : Fax : 大阪 大阪市淀川区新北野 -4- Tel : Fax : 福岡 福岡市博多区博多駅東 -5-8 Tel : Fax : 製品の学術的なお問い合わせは Tel : Fax : Mail : life_ps_jp@bio-rad.com M B