4. 新技術説明会について ( 実施後フォローアップ 来年度の実施 ) 産連展開部 ( 産学連携支援 G) 1 Epstein-Barr ウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤 島根大学医学部微生物学講座 教授 吉山裕規

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1 4. 新技術説明会について ( 実施後フォローアップ 来年度の実施 ) 産連展開部 ( 産学連携支援 G) 1 Epstein-Barr ウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤 島根大学医学部微生物学講座 教授 吉山裕規

2 要約 l Epstein-Barrウイルス (EBV) はヘルペスウイルスに属し 潜伏持続感染した細胞の増殖を促進して腫瘍化する l EBVに有効な抗ウイルス薬やワクチンの開発は遅れている l EBVのBART mirnasの転写を抑制することで EBV 感染上皮性腫瘍細胞をアポトーシスに導く抗がん剤を発明した l 例として YK などの化合物は ETS 転写因子に結 合し EBV 感染上皮性腫瘍細胞にアポトーシスを誘導した 2

3 3 ヘルペスウイルス科 外被糖蛋白 ヌクレオカプシドカプシドコアゲノム HSV-1 EEBBVV 亜科種通称 アルファヘルペスウイルス ベータヘルペスウイルス HHV1 HHV2 HHV3 HHV5 HHV6A HHV6A HHV6B HHV6B HHV7 ガンマヘルペスウイルス HHV4 HHV8 単純ヘルペスウイルス 1 型 単純ヘルペスウイルス 2 型 水痘単純疱疹ヘルペスウイルス ヒトサイトメガロウイルス HHV7 エプスタイン バーウイルス (EBV) カポジ肉腫ウイルス

4 4 ヘルペスウイルスは二つの感染様式をとる 潜伏持続感染 免疫の勝利利 免疫の敗北北 溶解感染 ( 水痘 ) 潜伏感染 溶解感染 ( 帯状疱疹 )

5 5 EB ウイルスも二つの感染様式をとる EBV 再活性化 BZLF1 BRLF1 潜伏感染遺伝子 EBNA1 EBERs BARTs LMP2A など 細胞はアポトーシスにより死滅

6 6 EB ウイルスは腫瘍ウイルスである 全人口の 95% が EB ウイルスに感染 世界の感染症に起因するがん患者数 (2012 年 ) 非感染者 5% 感染者 95% C T Lancet Glob Health 9: e (2016)

7 7 免疫機能が EBV 感染細胞の増殖を抑制している 生体外での EBV 感染 B リンパ球の増殖 EBV copies/100000cells 生体肝移植 リンパ節腫脹 免疫抑制剤減量量 0 date

8 EBウイルス関連癌 移植後リンパ腫 EBV関連胃がん バーキットリンパ腫 上咽頭がん ホジキンリンパ腫 鼻腔Tリンパ腫 8

9 9 潜伏持続感染細胞から癌が生じる EBV 潜伏持続感染細胞 EBV 関連がん

10 10 EBV 感染症は予防 治療法がない 抗ウイルス剤 : 核酸誘導体アシクロビルバラシクロビル ガンシクロビルバルガンシクロビルフォスカルネット 抗水痘ガンマグロブリン剤 水痘ワクチン 単純ヘルペスウイルス水痘帯状疱疹ウイルス サイトメガロウイルス 水痘帯状疱疹ウイルス

11 11 EB ウイルス感染細胞が産生する mirnas orip LMP2 EBV ゲノム EBNA2 EBNA1 LMP1 クラスター 1 クラスター , 1-3 BHRF1 mirnas 1, 3, 4, 15,5,16,17,6 21,18, 7, 8, 9, 22,10,11,12,19,20,13,14 2 BART mirnas (BARTs) Pre-miRNA Dicer RISC 5' mirna 3' mrna 5' リボソーム 抑制 3 UTR RISC 3'

12 12 mirna mrna 5 UTR Cap タンパク質コード領域 3 UTR AAAAAAAA 抑制 RNA-induced silencing complex PolyA の分解 Cap タンパク質コード領域 AA mirna mirna mrna 3 UTR

13 13 BART mirnas(barts) が アポトーシス mirna mir-bart3 mir-bart4-5p mir-bart16 mir-bart22 mir-bart20-5p Target DICE1 FEM1B CASZ1a BID OCT1 CREBBP SH2B3 PPP3R1 PAK2 TP53INP1 BAD 溶解感染 mirna mir-bart20-5p mir-bart6-5p Target BZLF1/BRLF1 DICER1

14 14 EBV mirna(barts) の 新しい転写調節機構を明らかにした

15 15 プロモーター活性の測定法 プロモーター 細胞抽出液 発光

16 16 BARTs P2 P1 BART mirnas (BARTs) P2 P1 調節領領域 P1 AGS (-) 細胞 AGS EBV(+) 細胞 pgl4 * pgl4 pgl4 pgl4 pgl4 * pgl4 エンハンサー Enhancer リプレッサー Repressor Relative ルシフェラーゼ活性 Luciferase Activity

17 17 BARTs 上皮細胞 Bリンパ球 EBV Epithelial cell lines B cell lines 高発現中度発現低発現 ETS A ETS B P1 pgl4 ETS C ETS D pgl4 pgl4 sicont. siets A siets B siets C siets D Relative Luciferase Activity ルシフェラーゼ活性 P1 Ets A 転写調節領域 BARTs

18 18 ETS A BARTs 野 生型 宿主ゲノム BARTs クラスター 1 クラスター 2 A mir-bart-1-5p mir-bart-7-3p P1 相対的な発現 * * クラスター 1 ETS A 欠損 EBV ゲノム BARTs クラスター 2 P1 BARTs

19 19 EBV ノックアウト ETS A BARTs EBV 野生型 EBER 欠損 LMP2A 欠損 相対的な発現 LMP2A mirna ノックイン AGS(-) 細胞 AGS EBV (+) 細胞 P1 ETS A x 相対的な発現 ETS A BARTs EBV genome BARTs LMP2A (ng) LMP2A (ng)

20 溶解感染が進行すると 感染細胞はアポトーシスに陥る LMP2A BZLF1 BRLF1 BARTs EBNA1 EBERs 腫瘍細胞増殖 アポトーシスで細胞死 より 20

21 相対的な発現 相対的な発現 BARTs 5 LMP2A 欠損またはETS A 破壊は溶解感染を進行させる 4 AGS 細胞 野生型 野生型 ETS A 破壊 3 EBV 野生型 LMP2A 破壊 野生型 LMP2A Control TPA+SB 溶解感染遺伝子発現 12 BZLF1 8 4 mirna ETS A P1 x BARTs EBV genome 0 Control TPA+SB 21

22 22 LMP2A 欠損または ETS A 破壊 でアポトーシスが進行する AGS 細胞野生型野生型 ETS A 破壊 EBV 野生型 LMP2A 欠損野生型 7AAD Annexin V

23 23 mirna EBV LMP2A P1 A x 溶解感染 腫瘍形成促進 EBV genome BARTs アポトーシス EBV 感染上皮細胞では LMP2A が ETS A の発現を促進する ETS A が BARTs の発現を促進する BARTs の発現は溶解感染とアポトーシスの進行を抑制する

24 24 EBV mirna(barts) の 発現抑制に働く抗腫瘍薬の開発

25 YK BARTs 相対的な発現 * * * P <0.01 * µm YK Ewing 肉腫 前立腺癌や一部の白血病に有効な抗腫瘍剤 マウス投与実験 (1.5 mg) で EWS-FLI1 の機能が亢進する癌の増殖を抑制 Nature Medicine 15, ,

26 26 YK は EBV 非感染 AGS(-) AGS(+) EBV BZLF1 AGS(+) BZLF1 欠損 KO EBV AAD DMSO YK YK Annexin V Annexin V

27 YK EBV EBV ETS A YK ETS A BART mirnas BART mirnas BZLF1 BZLF1 腫瘍細胞増殖 腫瘍細胞死 27

28 28

29 29 類似特許との相違 類似特許 (United States Patent ) は 多数ある EB ウイルス mirna のうち mir- BART20-5p の活性を核酸薬により阻害し ウイルス溶解感染を誘導することでウイルス感染細胞を破壊させる それに対して 我々の提案は 1) 1 つの mirna だけに着 目せず 30 個以上の EBV mirna の発現を同時に抑制する 2) 特定の ETS ファミリー遺伝 子を対象とし 化合物を 用いてウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導することで 抗腫瘍作 用を発揮する

30 30 新技術の特徴 l ETSファミリー遺伝子の阻害はEBV 潜伏感染細胞に特異的にアポトーシスを引き起こした l US A: 核酸誘導体を用いたDNA ウイルス由来 mirna 阻害剤 は 転写を抑制できない ( 転写抑制の方が効果的 ) l ユーイング肉腫の治療薬として前臨床試験が終了したYK-4-279が EBV 感染細胞にアポトーシスを誘導できた

31 31 想定される用途 l Epstein-Barrウイルス関連胃癌や上咽頭癌 口腔がんなどのEBV 関連上皮性腫瘍の治療薬 l 腫瘍以外に 慢性活動性 EBウイルス増殖症などの重篤感染症の治療への応用も期待される l YK-4-279がユーイング肉腫以外に前立腺癌にも有効である ( リポジショニング ) ことから 新規化合物は EBV 関連腫瘍以外にも適応拡大できる可能性がある

32 32 実用化に向けた課題 l YK-4-279は 転写活性化因子 EWS-FLI1とRNAヘリカーゼの結合の阻害薬である EtsAの活性も抑制するが さらなる至適化が可能だと考えられる l 現在 効果確認が試験管レベルに留まっている l 今後 SCIDマウス移植モデルを用いて有効性を確認し 臨床試験に適用するための条件設定を行う必要がある

33 33 企業への期待 l 創薬候補となるライブラリーの提供 l 実験モデルマウスを用いた薬効の評価と毒性 試験の共同研究を希望 l mirna の標的薬剤開発にご興味がある場合 は 核酸薬と 本発明との組み合わせを希望

34 34 本技術に関する知的財産権 発明の名称 :Epstein-Barr ウイルス関連癌に 特異的な抗腫瘍剤 出願番号 : 特願 (2017 年 8 月 23 日 ) 出願人 発明者 : 島根大学 : 吉山裕規 飯笹久 キムヒョジ

35 35 産学連携の経歴 1998 年 ピロリ菌に特異的な抗菌治療薬の開発 代表 : 吉山裕規 ( 山口大学微生物 ) : 加守田修 ( 帝国化学産業 ナガセケムテックス ) 2002 年 6 月日経バイオビジネス EB ウイルスベクター 2003 年 1 月 10 日大学発ベンチャー イーベック 設立に参加 2003 年 年平成 年度経済産業省 : 地域新生コンソーシアム研究開発事業 医薬素材としての完全ヒト抗体の作製と大量産生システムの確立 研究開発委員会委員 分担研究開発項目 : 完全ヒト抗体作製法の開発 平成 15 年度 ( 総額 5,500 万円中配分額 157 万 6,550 円 ) 平成 16 年度 ( 総額 966,3 千円中配分額 210 万円 )

36 36 お問い合わせ先 島根 大学産学連携コーディネーター 中村守彦 TEL FAX e- mail u.ac.jp 松下幸之助 TEL FAX e- mail u.ac.jp

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