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たしろうふくだ
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1 7 消費者に向けた家畜保健衛生所のアプローチ県央家畜保健衛生所田村みず穂牧野敬久末修司前田卓也はじめに家畜保健衛生所 ( 以下家保 ) の主要業務は畜産農家を対象にした家畜伝染病の発生予防及びまん延防止や家畜の飼養衛生管理の指導であり家畜衛生の向上を図り畜産の振興に努めてきたさらに平成 8 年度の O157 による食中毒や平成 13 年度の牛海綿状脳症 ( 以下 BSE) 平成 15 年度の高病原性鳥インフルエンザ ( 以下 HPAI) の国内発生などにより生産現場における食の安全安心確保の取り組みとして死亡牛の BSE 検査や飼料の安全性確保対策の指導農場 HACCP の指導などを実施してきたこのような取り組みを実施する背景には食に関する様々な問題が顕在化する中で消費者の食の安全安心への関心が高まっていることがあげられる 1) 神奈川県県民局が行っている県民ニーズ調査では県民の約 6 割が農業に安全安心な食料の供給を期待している ( 図 1) 平成 13 年度以降畜産分野では BSEやHPAI 口蹄疫などの国内発生が続いておりこの期待は畜産業へも向けられている畜産物の安全安心の確保は消費者と生産者が互いの状況を理解し協その他食料の安定供給 18.2% 安全安心な食料の供給 58.9% 力して取り組むことが重要であるそのため畜産農家だけでなく消費者にも家畜衛生に対して平成 22 年度県民ニーズ調査より図 1 農業にどのような役割を期待しますか理解を深めてもらう必要がある特に神奈川県は農場周囲で都市化が進んでいることや農家が直売やイベント等を通して消費者と接する機会が多い環境にあり消費者にとって農家は身近な存在で

あるそこで家保が畜産農家で行っている衛生対策について家保から消費者へ情報提供し家畜衛生について理解してもらうことにより畜産物の安全安心へとつなげてもらおうと情報提供消費者畜産物の安全安心農場周囲の都市化直売イベント等考え ( 図 2) 県央家畜保健衛生所施設公開と家畜保健衛生所畜産農家かながわ食の安全安心基礎講座を実施したので紹介する生産段階での衛生対策図 2

2 あるそこで家保が畜産農家で行っている衛生対策について家保から消費者へ情報提供し家畜衛生について理解してもらうことにより畜産物の安全安心へとつなげてもらおうと情報提供消費者畜産物の安全安心農場周囲の都市化直売イベント等考え ( 図 2) 県央家畜保健衛生所施設公開と家畜保健衛生所畜産農家かながわ食の安全安心基礎講座を実施したので紹介する生産段階での衛生対策図 2 消費者へのアプローチ県央家畜保健衛生所施設公開家保の施設公開は平成 21 年度の家保再編整備を契機に県農業技術センター畜産技術所とともに家畜に親しむつどいの一部として消費者へ向けて年 1 回開催している ( 写真 1) 施設公開の来所者は平成 21 年度 319 名平成 22 年度 51 3 名平成 23 年 467 名と天候の影響もあり年度間でばらつきはあるものの 3 年間で約 1,300 名近写真 1 県央家畜保健衛生所施設公開くであった 1 公開内容施設公開の内容は家保業務を理解してもらうことを目的として毎年内容を変更及び追加しているが平成 23 年度は所内の入り口に近いところに県の畜産や家畜伝染病予防法にかかわる検査などについて業務説明パネルを展示しその前の机に実際に業務で使用する注射器や保定器シャーレやピペットなどの器具器材を並べ自由に触れられるコーナーを設けた ( 写真 2 左上) また牛のおいたちを調べようと題しパソコンや携帯電話を使用して実際に牛の個体識別情報を検索してもらいトレーサビリティ制度について知ってもらった顕微鏡をのぞいてみようではグラム染色した大腸菌とブドウ球菌を顕微鏡で観察してもらった身近で一般的な細菌に興味をもった人が多く特に大人に人気が高かった ( 写真 2 右上) その他獣医師体験ができる催しでは牛の直腸検査を体験してみようとして牛の模型を用いた直腸検査の体験 ( 写真 2 左

下鶏の心拍数を調べようとして生きた鶏の聴診を実施したほか写真２右下防疫服や白衣面布を着て写真撮影できる

を作成し入り口で来所者に配布し展示物にも興味をもって参加してもらえるようにした写真２実施内容２

アンケートは来所者の項目および催しものや家保業務について選択式の問いを設けた図３アンケート用紙は

なお来所者に関する項目以外はそれぞれのグループの代表者の意見を回答してもらったアンケート調査の結果

3 下鶏の心拍数を調べようとして生きた鶏の聴診を実施したほか写真２右下防疫服や白衣面布を着て写真撮影できるフォトポイントを設置し子供も楽しみながら参加できるよう工夫したまた展示物全体を題材とした家保探検クイズを作成し入り口で来所者に配布し展示物にも興味をもって参加してもらえるようにした写真２実施内容２アンケート調査の実施今年度からの取り組みとして来所者に施設公開の内容の理解度を把握するためアンケート調査を実施したアンケートは来所者の項目および催しものや家保業務について選択式の問いを設けた図３アンケート用紙は来所者のグループごとに150枚配布し 138枚を回収した回収率は92 だったなお来所者に関する項目以外はそれぞれのグループの代表者の意見を回答してもらったアンケート調査の結果平成23年度の来所者の年齢別構成は 40代男女が87名と最も多く 10 歳未満が76名 30代が70名となり家族づれが多く訪れていた図４催し物の中で良かったものは家保探検クイズが25.8 と最も多く続いて顕微鏡を

4 のぞいてみようが 23.7% 鶏の心拍数を調べようが 15.9% だった楽しみながら参加できるものや実際に体験できるものが人気を集めた ( 図 5) 図 3 アンケート調査用紙 60 代男性 50 代女性 87 名家保探検クイズ顕微鏡をのぞいてみよう 23.7% 25.8% 40 代 30 代 20 代 10 代 10 歳未満 52 名 35 名 21 名 49 名 70 名 76 名 30 名 46 名 ( 名 ) 鶏の心拍数を調べよう器具器材などの展示物牛のおいたちを調べようフォトポイント牛の直腸検査を体験してみようその他 15.9% 0 % 10 % 20 % 30 % 図 4 来所者の年齢構成図 5 人気のあった催し家保については来所者の45.7% が家保の存在を知っていたと答えそのきっかけとして多くの人が口蹄疫や鳥インフルエンザ BSEの報道をあげた家保を知らなかった人に対して来所する前と比べると家保の業務について理解は深まりましたかと聞いたところ 97.9% が家保の業務について理解が深まったと答えたその中でも家畜伝染病予防のための検査が38.5% と最も理解が得られたことが分かった ( 図 6) 今後家保についてどのようなことを知りたいですかという問いには 20.7% が食の安全安心と答え消費者の関心の高さが伺えたついで鳥インフルエンザ対策が15.7% で

5 あった ( 図 7) 家畜保健衛生所の存在を知っていましたか知らなかった知っていた 35.5% 45.7% 口蹄疫鳥インフルエンザ BSE の報道報道を通して無回答 18.8% 業務について理解は深まりましたかとても深まった 36.7% ある程度深まった 61.2% 無回答 2.1% 何について理解が深まりましたか家畜伝染病予防のためののための検査 38.5% 神奈川の畜産 22.1% 獣医事薬事薬事の畜産環境の対策指導 19.2% 19.2% その他 1.0% 0% 50% 100% 図 6 家畜保健衛生所について食の安全安心鳥インフルエンザ対策家畜の伝染病予防のための検査 ( 牛 ) 家畜の伝染病予防のための検査 ( 豚 ) 家畜の伝染病予防のための検査 ( 鶏 ) 口蹄疫対策 BSE 対策家畜の伝染病予防のための検査 ( 蜜蜂 ) 畜産環境の対策獣医事薬事の指導その他 20.7% 15.7% 0% 10% 20% 30% 図 7 今後知りたいことかながわ食の安全安心基礎講座平成 22 年度はかながわ食の安全安心基礎講座を開催したこれは神奈川県食の安全安心推進会議と連携した全庁的な取り組みの一環で実施したもので消費者へ向けて食の安全安心に関する基礎的な情報を発信し情報の共有化を図る講座である 2) 家保職員が健康な家畜の生産と家畜保健衛生所の仕事と題し家保業務および口蹄疫についての講義や家保の施設見学質疑応答を行った ( 写真 3) 終了後のアンケート調査結果から30 代 40 代 60 代がそれぞれ25% ずつ参加して

いることが分かった家畜保健衛生所についてご存じでしたかとの問いに対しては約40 が知らなかったと答えたが全ての人がこの講座を受講し健康な家畜の生産について理解が深まったと答えた写真３かながわ食の安全安心基礎講座まとめ家保は畜産物の安全性を確保するため畜

消費者に施設公開や講座を通して生産段階で畜産物の安全安心の衛生対策について情報提供したその結果図８まとめ消費者に畜産農家や家畜衛生の正しい知識を知ってもらうとともに家保業務について理解を深めてもらうことができ畜産物の安全安心の理解へとつなげることができた図８一方消費者が

6 いることが分かった家畜保健衛生所についてご存じでしたかとの問いに対しては約40 が知らなかったと答えたが全ての人がこの講座を受講し健康な家畜の生産について理解が深まったと答えた写真３かながわ食の安全安心基礎講座まとめ家保は畜産物の安全性を確保するため畜家畜保健衛生所畜産農家における衛生対策産農家とともに家畜衛生対策に取り組んできたしかし家畜衛生をとりまく情勢の変化施設公開講座を通した情報提供から消費者へ視点を移した畜産物の安全安生産現場への理解消費者心の確保も重要になっている今回家保が家畜衛生の正しい情報の認識消費者に施設公開や講座を通して生産段階で畜産物の安全安心の衛生対策について情報提供したその結果図８まとめ消費者に畜産農家や家畜衛生の正しい知識を知ってもらうとともに家保業務について理解を深めてもらうことができ畜産物の安全安心の理解へとつなげることができた図８一方消費者が今後消費者が知りたいこととして食の安全安心を最も多くあげられたことから引き続き消費者との意見交換の場を設けるなど情報の共有化を図り畜産農家が行っている飼養衛生管理基準の遵守や農場ＨＡＣＣＰへの取り組みが食の安全安心につながっていることを施設公開などを通じて理解してもらえるよう努めていきたい

7 引用文献 1) 神奈川県環境農政局企画調整部 : わたしたちのくらしと神奈川の農林水産業 ( 平成 23 年度版 ) 2) 神奈川県保健福祉局生活衛生部 : かながわ食の安全安心行動計画 ( 平成 22 年度版 )

8 8 管内一養豚場で確認された豚皮膚炎腎症症候群 (PDNS) 湘南家畜保健衛生所平野幸子荒木悦子和泉屋公一稲垣靖子はじめに豚皮膚炎腎症症候群 ( 以下 PDNS) は主に育成豚及び肥育豚に発生し発症率は1% 以下死亡率は90 日齢以上で100% 近いが 45~90 日齢では30% 程度である重症例では発症後数日以内に死亡する特徴的症状は皮膚における不定形な赤紫色斑または丘疹の形成で解剖所見では腎臓の腫大褪色及び点状出血や全身リンパ節の腫脹が認められる病理組織学的には全身性の壊死性血管炎と線維素性糸球体腎炎を特徴としこれらの組織所見をもってPDNSと診断される本病は臨床及び解剖所見が豚コレラのそれと類似することから防疫上重要な疾病とされている PDNSは免疫複合体が関与したⅢ 型アレルギーによる疾病と考えられており原因抗原として豚サーコウイルス2 型 ( 以下 PCV2) 豚繁殖呼吸障害症候群( 以下 PRRS) 等の関与が疑われているが未だに明らかにされていない 1)3) 平成 23 年 11 月に皮膚病変と発育不良を呈した豚に遭遇し病性鑑定の結果 PDNSと診断した症例についてその概要を報告する発生の概要管内の繁殖雌豚 360 頭規模一貫経営農場で平成 22 年 4 月から皮膚に赤紫色斑が認められる発育不良の個体が90~180 日齢の肥育豚に年間 6 頭程度確認されていた稟告によるとこの皮膚病変は痂皮化し徐々に消失して発育は遅れるものの死亡せず経過するとのことであった平成 23 年 11 月皮膚病変が認められる個体が3 頭確認されうち2 頭は痂皮化進んでおりうち1 頭は赤紫色斑が顕著に認められたため PDNSを疑い病性鑑定を実施したなお肥育豚へのワクチンはマイコプラズマ (7 21 日齢 ) PCV2(50 日齢 ) 豚丹毒 (60 90 日齢 ) 豚胸膜肺炎 ( 日齢 ) を接種していた

9 材料と方法 1 材料雑種去勢 180 日齢の肥育豚 1 頭を放血殺後病性鑑定に供した 2 方法 (1) ウイルス学的検査肝臓脾臓腎臓肺扁桃肺門リンパ節肝門リンパ節脳の乳剤を材料にCPK 細胞を用いてウイルス分離を実施した肺扁桃肺門リンパ節鼠径リンパ節浅頚リンパ節の乳剤を材料にPCRにより PRRSウイルス遺伝子検索 PCV2 遺伝子検索及びPCV2 遺伝子型判別を実施したまた扁桃を用いて豚コレラFA 法を実施した (2) 細菌学的検査肝臓脾臓腎臓肺腹水浅頚リンパ節腸間膜リンパ節脳についてβ-NAD 加めん羊血液寒天培地馬血液寒天培地 DHL 寒天培地を用いた好気及び微培養を 37 にて48 時間実施した (3) 血液生化学的検査自動血球計数装置により赤血球白血球 Ht 値を測定したまた生化学自動分析測定装置によりBUN CREを測定した (4) 病理組織学的検査大脳小脳脊髄肺心臓膵臓肝臓脾臓腎臓副腎消化管皮膚扁桃リンパ節を10% 中性緩衝ホルマリン液で固定パラフィン包埋後薄切し常法に従いHE 染色 PTAH 染色を実施したまた免疫組織化学的染色をPCV2について実施した

10 成績 1 外貌剖検所見発育不良で全身の皮膚に主に1cm以下の不定形の赤紫色斑や丘疹が多数みられ一部痂皮を認めたまた耳翼及び臀部から後肢では融合した赤紫色斑がみられ一部黒褐色を呈していた ( 写真 1) 主要リンパ節は腫大し ( 写真 2) 腎臓は腫大し点状出血も認められた ( 写真 3) また胃においては粘膜が容易に剥離し噴門部で出血が認められ盲腸では粘膜に点状出血がみられた ( 写真 4) 2 ウイルス学的検査 PCR 検査で鼠頚浅頚及び肺門リンパ節肺扁桃からPCV2 特異遺伝子が検出され遺伝子型はGenotyp e2b-2e 型と確認されたまた PRR Sウイルス特異遺伝子については陰性豚コレラはFA( 蛍光抗体法 ) 法で陰性であった 3 細菌学的検査た脳肝臓脾臓腎臓肺腹水浅頚リンパ節腸間膜リンパ節から有意な菌は分離されなかっ

11 血液生化学的検査血液検査では赤血球 480 万/μｌ白血球 20,100/μｌＨｔ値 30.0 であった生化学的検査ではＢＵＮ /dl ＣＲＥ 18.8 /dl と高値であった 4 病理組織学的検査表皮から真皮にかけて出血壊死炎症性細胞の浸潤がみられた写真5 腎臓ではボーマン嚢への線維素の析出が瀰漫性に観察され出血がみられた写真6 脾臓では中心動脈に壊死がみられ周囲にマクロファージや好酸球の軽度の浸潤がみられた写真7 肺門リンパ節ではリンパ球が中程度減数し多核巨細胞がみられマクロファージや好酸球の浸潤がみられた写真8 またＰＣＶ２の免疫組織学的染色を実施したところＰＣＶ２陽性抗原が検出された写真9 この他腸間膜リンパ節鼠頚リンパ節でリンパ球が軽度減数し多核巨細胞が散見されたＰＣＶ２抗原は他に腸間膜リンパ節でもみられた

12 病性鑑定結果本症例は全身の皮膚に不定形の赤紫色斑や丘疹腎臓に点状出血がみられ組織学的に出血性壊死性皮膚炎線維素性糸球体腎炎脾臓において壊死性血管炎がみられたことから PDNS と診断した

13 本農場の日齢別検査本農場のPCV2 及びPRRSの状況を把握するため病性鑑定を実施した2 週間前に採血した保存血を用いて 30 日齢 60 日齢 90 日齢 120 日齢 150 日齢の各 5 頭についてPCR 検査抗体検査を実施した PCV2は50 90 日齢で 5 頭中 1 頭 PCR 陽性を確認し PRRSは120 日齢でPCR 陽性 150 日齢で5 頭とも抗体陽性を確認した ( 表 1) まとめ管内の繁殖雌豚 360 頭規模一貫経営農場で平成 22 年 4 月から皮膚に赤紫色斑が認められる発育不良の個体が散発的に発生稟告によるとこの皮膚病変は痂皮化し徐々に消失して発育は遅れるものの死亡せず経過するとのことであった平成 23 年 11 月皮膚病変が認められる個体が 3 頭確認され PDNSを疑い病性鑑定を実施したところ全身の皮膚に不定形の赤紫色斑や丘疹腎臓に点状出血がみられ組織学的に出血性壊死性皮膚炎線維素性糸球体腎炎脾臓において壊死性血管炎がみられたことからPDNSと診断した農場のPCV2 及びPRRSの状況を調べたところ PCV2は日齢の一部の豚にPCR 陽性を確認 PRRSは120 日齢でPCR 陽性 150 日齢で抗体陽性を確認した考察 PDNS は一般的に PCV2 の関与が疑われており今回 PDNS と診断した病性鑑定豚においてもリンパ組織に PCV2 に特徴的な病変 2) 特異遺伝子及び抗原が確認されたことから PCV2 の関与が考えられたまた本農場では PCV2 ワクチンを約 50 日齢で接種してるが日齢別の検

14 査で50 日齢と90 日齢の一部の豚にPCV2PCR 陽性が確認されていること今回 PDNSと診断された豚と同様の皮膚病変が散発的に発生していることから PCV2ワクチンの適切な接種時期 1 頭 1 頭への確実な接種が必要であると考えるなお PDNSは一般的に 90 日齢以上での死亡率が高いといわれているが稟告によると本農場のPDNS 疑う皮膚病変発症豚は徐々に皮膚病変が消失し発育は遅れるも死亡せずに経過するとのことであったまた過去に本農場の死亡豚で実施した病性鑑定ではPDNSを疑う皮膚病変や腎症は認められなかったこのことから本農場における皮膚病変とPDNSの関連について今後検証していきたい引用文献 1) 播谷亮ら : 豚病会報,No.38,18-20(2001) 2) 川嶌健司ら : 豚病会報,No.52,17-21(2008) 3) 曽我万里子ら : 平成 20 年度新潟県家畜保健衛生業績発表会集録, 演題 17 番 (2008)

15 9 遺伝子の塩基配列の解析により分離菌の同定確認を行った病性鑑定例県央家畜保健衛生所小菅千恵子山本和明前田卓也はじめに病性鑑定における細菌検査の基本は迅速な原因菌の分離と有効な薬剤を選定することであるしかし伝染性疾病の対策には疫学調査として過去の分離菌や他施設での分離菌との比較を行うことにより分離菌の特性を把握し予防対策に生かすことが重要となってきているそのためには分離菌の正確な菌種同定が不可欠である当所における細菌学的検査 ( 菌種同定 ) は病性鑑定指針を参照に分離培養形態観察生化学的性状検査により行い一部の検査に遺伝子検査である PCR 検査を併用している最近では細菌分野で菌種同定や疫学調査などに活用されている検査法に 16SrRNA 遺伝子の塩基配列解析 ( 以下 16SrRNA 遺伝子解析 ) があり今回菌種同定及び菌種確認に16SrRNA 遺伝子解析を行ったので報告する材料及び方法 1 検査材料 2010~2011 年に実施した病性鑑定症例において疾病の主原因が細菌と診断した症例のうち分離菌の菌種同定ができなかった症例と同定したが更なる確認が必要と考えられる症例の計 5 症例各 1 株について次のグループ分けにより 16SrRNA 遺伝子解析を実施し菌種同定及び確認を試みた (1) 生化学的性状検査だけでは菌種を同定できなかった症例 ( 症例 1-(1~3)) (2) 生化学的性状検査で菌種を同定したが菌株の遺伝子解析が必要な症例 ( 症例 2) (3) 市販キットによる生化学的性状検査では誤同定の可能性があり再確認が必要な症例 ( 症例 3)

2 検査方法 (1) 分離培養形態観察生化学的性状検査 β-nad 加めん羊血液加寒天培地馬血液寒天培地 DHL 寒天培地さらに症例 1ではGAM 寒天培地症例 3ではチョコレート寒天培地を用い好気微好気嫌気にて 37 48 時間培養し分離培養を行ったグラム染色オキシダーゼテストカタラーゼテスト及び分離菌の生化学的性状検査には市販キットを用い症例 1はシスメックス社製

遺伝子解析分離菌をバイオラッド社製インスタジーンマトリックスを用いてDNAを抽出し検査キット (MicroSEQR R 500 16SrDNA PCR /Sequencing Kits,Applied Biosystems) を用いて分離菌の16SrRNA 遺伝子領域約 500bpについて増幅およびシーケンス反応を行った反応産物の塩基配列約 500bpを遺伝子解析装置 (Genetic

16 2 検査方法 (1) 分離培養形態観察生化学的性状検査 β-nad 加めん羊血液加寒天培地馬血液寒天培地 DHL 寒天培地さらに症例 1ではGAM 寒天培地症例 3ではチョコレート寒天培地を用い好気微好気嫌気にて時間培養し分離培養を行ったグラム染色オキシダーゼテストカタラーゼテスト及び分離菌の生化学的性状検査には市販キットを用い症例 1はシスメックス社製 API 20A 症例 2はAPI Strep 症例 3はAPI Staph 症例 4 5は日水製薬 IDテストHN-20ラピッドを用いたさらに症例 1はFus- obacterium 属菌を区別する生化学的性状検査症例 3はActinobacillus 2)5) 属を区別する生化学的 1)4) 性状検査を追加し実施した (2) 16SrRNA 遺伝子解析分離菌をバイオラッド社製インスタジーンマトリックスを用いてDNAを抽出し検査キット (MicroSEQR R SrDNA PCR /Sequencing Kits,Applied Biosystems) を用いて分離菌の16SrRNA 遺伝子領域約 500bpについて増幅およびシーケンス反応を行った反応産物の塩基配列約 500bpを遺伝子解析装置 (Genetic Analyzer3130, 16SrRNA 遺伝子解析による菌種同定 DNA の抽出 PCR 増幅産物の確認精製サイクルシーケンス塩基配列の解析相同性検索判定基準塩基配列の相同性 ( 分離菌とデータベース登録菌との 97% 以下 : 別菌種塩基配列比較 ) 97% 以上 : 類縁関係あり BLAST 解析 99% 以上 : 同種の可能性他の検査結果も踏まえ菌種の同定 Applied Biosystems) を用いて解析し図 1 16srRNA 遺伝子解析による菌種同定 16SrRNA 遺伝子の塩基配列を決定したこの塩基配列を解析ソフト (MicroSEQR R ID ソフトウエア / 16SrDNA500 Library) により相同性解析し NCBI(National Center for Biotechnology I- nformation) から入手したGenBank データベースとBLAST 検索を実施し他の検査結果も踏まえ分離菌の同定を行った ( 図 1) 成績 1 生化学的性状検査だけでは菌種を同定できなかった症例症例 1-(1): 壊死性化膿性肺炎を呈した肺から分離されたFusobacterium sp. の菌種同定 4ヶ月の間に食欲不振と発熱を繰り返し数回の治療を実施後死亡した乳用牛 (32ヶ月齢) で剖検所見で後大静脈に隣接して被包化した膿瘍肺全葉で粟粒大の乳白色結節散在組織所

17 見で肺に壊死性化膿性肺炎肺膿瘍心臓等の複数臓器でのフィラメント状桿菌を認め肺膿瘍肺肝臓から Fusobacterium sp. が分離された分離菌は API 20A で Fusobacterium necrophorum/nucleatum (68.0%ID) と判定され追加検査等によりインドール (+) エスクリン加水分解 (-) 牛乳の凝固消化 (-) マンノース (-) ラクトース (-) グルコース (+) リパーゼ (+) 鶏血球凝集性 (+) 溶血野外分離株との相同性 99% 以上性 (+) を示したが菌種同定には至らなかった 16SrRNA 遺伝子解析を実施した結果 ( 図 2) データベース基準株との相同性 99% 登録株 Fusobacterium necrophorum との相同性が99% 以上であり分離菌はFusobacterium necrophorum と同定した図 2 BLAST 解析の結果症例 1-(2): 化膿性髄膜脳脊髄炎を呈した脳から分離されたグラム陽性菌の菌種同定突然死した肥育豚 ( 約 5ヶ月齢 ) で剖検所見で脳の血管充盈肺の一部肝変化組織所見で化膿性髄膜脳脊髄炎を認め脳主要臓器からグラム陽性菌が分離された分離菌は市販キットによる生化学的性状検査で同定に至らなかった 16SrRNA 遺伝子解析を実施した結果データベース登録株 Streptococcus suisとの相同性が99% であり分離菌はStreptococcus suis と同定した症例 1-(3): カタル性化膿性気管支肺炎を呈した肺から分離された Actinobacillus sp. の菌種同定突然死した肥育豚 ( 約 5 ヶ月齢 ) で剖検所見で肺の肝変化組織所見でカタル性化膿性気管支肺炎を認め肺から Actinobacillus sp. が分離された分離菌は ID テスト HN-20 ラピッドで相対確率の高い順に A.equiili A.pleuropneumoniae A.lignieresii A.suisと判定された追加検査でV 因子要求 (+) アラビノース (-) ソルビトール (-) セロビオース (-) エスクリン加水分解 (-) を示したが菌種同定に至らなかった 16SrRNA 遺伝子解析を実施した結果データベース登録株 A.pleuropneumoniaeとA.lignieresiiの2 菌種ともに相同性が99% であった併せて実施したA.pleuropneumoniae 血清型別検査によりⅡ 型に特異的なバンドを認めた事も併せて分離菌はA.pleuropneumoniaeと同定した 2 生化学的性状検査で菌種を同定したが菌株の遺伝子解析が必要な症例

18 症例 2: 化膿性髄膜炎を呈した脳から分離された Staphylococcus hyicus の菌種確認 2 週間前からの皮膚症状及び神経症状を示し死亡した離乳豚 (22 日齢 ) で剖検所見で肺の一部肝変化耳下腺リンパ節の腫脹組織所見で脳脊髄の化膿性髄膜炎細菌性皮膚炎を認め脳肺耳翼部及び背部皮膚内側からStaphylococcus hyicus が分離された Staphylococcus hyicus によって神経症状を引き起こす症例は珍しいと考えられるため菌種確認に16SrRNA 遺伝子解析を実施した結果データベース登録株 Staphylococcus hyicus との相同性が 99% であり分離菌は Staphylococcus hyicus と確認した 3 市販キットによる生化学的性状検査では誤同定の可能性があり再確認が必要な症例同定症例 3: 化膿性気管支肺炎を呈した肺から分離された Mannheimia haemolytica complex の菌種呼吸速拍と起立困難を呈し死亡した乳用牛 (17ヶ月齢) で剖検所見で胸水貯留肺の肝変化胸壁との癒着組織所見で化膿性気管支肺炎を認め肺からMannheimia haemolytica complexが分離された市販キットで Mannheimia haemolytica complexとされた菌株については 16SrRNA 遺伝子解析を実施すると再同定される可能性生化学的性状により M.haemolytica complex としたなかには少なくとも 5 菌種が含まれている M.haemolytica M.glucosida M.granulomatis M.ruminalis M.varigena M.haemolytica 以外については病原性発生状況など詳細が明らかとなっていない M.haemolytica とした菌株 133 株について 16SrRNA 遺伝子解析を実施すると M. haemolytica 102 株 (76.7%) M.varigena 18 株 (13.5%) M.glucosida 2 株 ( 1.5%) M.spp. 11 株 ( 8.3%) のあることが報告されている 3) ( 図 3) 図 3 Mannheimia haemolytica complex について菌種確認に 16SrRNAlytica complexについて遺伝子解析を実施した結果データベース登録株 Mannheimia haemolyticaとの相同性 100% であり分離菌はMannheimia haemolytica と同定したまとめ及び今後の展望 2010~2011 年に病性鑑定を実施し疾病の主原因が細菌と診断した症例のうち原因菌の菌種同定に従来より実施している生化学的性状検査では同定できないもしくはさらなる確認が必要と考えられた症例の菌種同定及び確認のため 16SrRNA 遺伝子解析を用いた結果すべての症例の菌種同定

19 及び確認をすることが出来 16SrRNA 遺伝子解析が有効な検査法であることが認識できた 16Sr- RNA 遺伝子解析を実施するには機器の整備が必要であることまた外部委託にはコストがかかること菌種によっては今回実施したActinobacillus 属のようにその塩基配列の相同性に違いがみられず分類が出来ないものがあること等の問題点が挙げられるしかし 16SrRNA 遺伝子解析の利点である1 生化学的性状検査 ( 菌の代謝能力に依存する検査 ) で同定できない細菌を遺伝子検査で同定できること 2 機器の操作に馴れれば手法が簡便またDNAの抽出からBLAST 解析までが約 5 時間程度と短時間で判定出来ることさらに3 系統樹解析など疫学調査に有効であることなどの特徴を生かし今後は豚の常在菌でありながらレンサ球菌症を引き起こし養豚農家へ経済的被害を与え又人にも感染する人獣共通感染症として家畜衛生及び公衆衛生上重要であるStreptococcus suis 感染症の疫学調査に今回同定した菌や過去の病性鑑定症例から分離された菌を用い遺伝子解析を活用していきたい謝辞 16SrRNA 遺伝子解析の実施にあたり快く機材の使用提供及び御助言を頂いた農林水産省動物検疫所精密検査部に深謝します引用文献 1) G.L.Barrowら : 医学細菌同定の手引き第三版近代出版(1933) 2) Holdeman L.V and Moore W.E.C.:Anaerobe Lab Mannual (4th edition) 23-28(1977) 3) 勝田賢ら : 動衛研研究報告第 115 号 15-18(2009) 4) 佐々木幸治ら : 日獣会誌 58 号 186~189(2005) 5) 上野一恵 : 細菌学技術菌叢嫌気性菌の分離と同定法菜根出版 (1982)

20 神奈川県環境農政局農政部畜産課安全管理グループ横浜市中区日本大通 1 電話 (045) ( ダイヤルイン )

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< F2D BD96EC2E6A7464> 8 管内一養豚場で確認された豚皮膚炎腎症症候群 (PDNS) 湘南家畜保健衛生所平野幸子荒木悦子和泉屋公一稲垣靖子はじめに豚皮膚炎腎症症候群 ( 以下 PDNS) は主に育成豚及び肥育豚に発生し発症率は1% 以下死亡率は90 日齢以上で100% 近いが 45~90 日齢では30% 程度である重症例では発症後数日以内に死亡する特徴的症状は皮膚における不定形な赤紫色斑または丘疹の形成で