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- さみら かわらい
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1 写 食 安 監 発 0515 第 1 号 平 成 24 年 5 月 15 日 都 道 府 県 各 保 健 所 設 置 市 特 別 区 衛 生 主 管 部 ( 局 ) 長 殿 厚 生 労 働 省 医 薬 食 品 局 食 品 安 全 部 監 視 安 全 課 長 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 について 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O157 及 び O26 の 検 査 法 については 平 成 18 年 11 月 2 日 付 け 食 安 監 発 第 号 により 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O111 の 検 査 法 につ いては 平 成 23 年 6 月 3 日 付 け 食 安 監 発 0603 第 2 号 ( 最 終 改 正 : 平 成 23 年 10 月 3 日 )により 通 知 しているところです 今 般 一 斉 試 験 法 について 検 討 を 行 った 結 果 別 添 のとおり 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 を 定 めたので 検 査 を 行 う 場 合 は この 方 法 により 実 施 されるようお 願 いします 平 成 18 年 11 月 2 日 付 け 食 安 監 発 第 号 及 び 平 成 23 年 6 月 3 日 付 け 食 安 監 発 0603 第 2 号 は 廃 止 します なお VT 遺 伝 子 検 出 法 によるスクリーニング 法 については 引 き 続 き 検 討 中 であり 確 認 でき 次 第 改 めて 通 知 することとしています
2 ( 別 添 ) 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 検 査 法 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26 O111 及 び O157 の 試 験 を 以 下 の 方 法 によって 行 う ベロ 毒 素 (VT) 遺 伝 子 検 出 法 を 行 うための 設 備 を 整 えることができない 場 合 については 培 養 法 のみを 行 って 差 し 支 えない 1. 検 体 の 採 取 食 品 検 体 200g 以 上 を 採 取 する なお 表 面 汚 染 が 考 えられる 食 品 は 表 面 部 を 厚 さ cm に 削 り これを 検 体 とする 2. 試 料 の 調 製 採 取 した 検 体 の 全 体 を 細 切 混 和 後 その 25gをストマッカー 袋 に 秤 量 して これを 試 料 とする 3. 増 菌 培 養 以 下 の 増 菌 培 養 液 を 培 養 法 及 び VT 遺 伝 子 検 出 法 に 供 試 する ただし VT 遺 伝 子 検 出 法 の 場 合 は 別 に 10 ml を 分 離 培 養 用 として 試 験 が 終 了 するまで 冷 蔵 保 存 する ストマッカー 袋 中 の 試 料 に 225 ml の 増 菌 培 地 ( 室 温 程 度 )を 加 え1 分 間 以 内 のストマッカー 処 理 などを 行 った 後 42±1 で 22±2 時 間 培 養 する 4. 増 菌 用 培 地 1)mEC 培 地 ( 日 水 製 薬 オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 極 東 製 薬 工 業 栄 研 化 学 メルク 等 ) ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.12 g ラクトース 5.0 g K 2 HPO g KH 2 PO g NaCl 5.0 g ph 6.9±0.1 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 冷 却 し そのまま 使 用 する 2)mEC 培 地 (USDA 法 )( 自 家 調 製 ) トリプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 (Bile salts No.3) 1.12 g - 1 -
3 ラクトース 5.0 g K 2 HPO g KH 2 PO g NaCl 5.0 g ph 6.9±0.1 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 冷 却 し そのまま 使 用 する ただし 凍 結 等 によって 菌 の 損 傷 が 考 えられる 場 合 は 各 試 験 検 査 機 関 において 本 通 知 法 に 示 す 増 菌 培 養 法 と 同 等 であると 判 断 した 上 で mec 培 地 において 36±1 培 養 など 選 択 性 を 弱 めた 増 菌 培 養 法 の 使 用 を 推 奨 する その 他 の 培 地 についても 各 試 験 検 査 機 関 で 同 等 性 について 評 価 を 行 い 使 用 しても 良 い また 検 体 中 の 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 以 外 の 菌 の 増 殖 が 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 の 増 殖 を 妨 げると 考 えら れる 場 合 は ノボビオシン 加 mec 培 地 において 42±1 培 養 など 選 択 性 を 高 めた 増 菌 培 養 法 も 考 慮 する 5.DNA 抽 出 法 (VT 遺 伝 子 検 出 法 を 行 わない 場 合 は7へ) 使 用 する DNA 抽 出 法 に 必 要 な 培 養 液 量 から DNA 抽 出 を 行 ない それを 試 料 として6の VT 遺 伝 子 検 出 を 行 う DNA 抽 出 法 としては 以 下 のものが 利 用 できる キットについては 各 添 付 文 書 を 参 照 すること 抽 出 DNA は 氷 上 で 取 り 扱 い 保 存 は 凍 結 が 望 ましい なお 培 養 液 の 加 熱 による 単 純 な DNA 抽 出 法 は 検 出 感 度 が 優 れないため 使 用 しない 可 能 であれば1 検 体 につき2 本 のマイクロチューブを 用 いて DNA を 抽 出 する 1)アルカリ 熱 抽 出 法 培 養 液 0.1 ml をマイクロチューブにとり 10,000Xg 10 分 間 遠 心 し 上 清 を 取 り 除 いた 沈 渣 に 滅 菌 した 50 mm NaOH 85 l を 添 加 して 100 で 10 分 間 加 熱 処 理 する その 処 理 液 に 滅 菌 した1 M Tris-HCl(pH 7.0)15 l を 加 えて 中 和 し 遠 心 上 清 (2,000~10,000Xg 10 分 間 )を 検 体 とす る また VT 遺 伝 子 検 出 キットに 含 まれる DNA アルカリ 抽 出 試 薬 を 使 用 できる(ただし 上 記 と 同 等 のアルカリ 液 及 び 中 和 液 の 組 成 及 び 容 量 に 限 る) 抽 出 後 は 氷 上 で 静 置 し 直 ちに(60 分 以 内 ) 検 出 試 験 に 使 用 する 直 ちに 使 用 しない 場 合 には0~4 で 保 存 し 4 時 間 以 内 に 使 用 する 2)PrepMan Ultra Sample Preparation Regent(アプライド バイオシステムズジャパン) 3)DNeasy Tissue Kit(キアゲン) 4)High Pure PCR Template Preparation Kit(ロシュ ダイアグノスティックス) その 他 同 等 品 も 使 用 できる ただし 脂 肪 の 多 い 食 品 については 食 品 成 分 が 遺 伝 子 増 幅 に 影 響 を 及 ぼすため 1)に 示 すア ルカリ 熱 抽 出 法 を 使 用 する 6.VT 遺 伝 子 検 出 法 - 2 -
4 抽 出 した DNA テンプレートを 用 いて VT 遺 伝 子 の 検 出 試 験 を 実 施 する VT 遺 伝 子 検 出 の 結 果 陰 性 であった 場 合 は 試 験 を 終 了 する 陽 性 であった 場 合 は 当 日 中 に 血 清 群 O26 O111 及 び O157 を 対 象 とした 分 離 培 養 を 行 う VT 遺 伝 子 検 出 法 では 感 度 が 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )より 優 れるものを 使 用 すること とし 方 法 として 以 下 のものがあげられる なお 感 度 の 確 認 が 必 要 な 場 合 には 各 機 関 にて 後 述 の 方 法 を 参 照 し 行 う 試 験 には 陽 性 コントロールを 設 定 する 1)PCR 法 市 販 の VT 遺 伝 子 検 出 キット 又 は 公 表 されているプライマーを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の 遺 伝 子 増 幅 酵 素 にてリアクションを 行 う これについては 以 下 のものが 利 用 できる また PCR 産 物 の 電 気 泳 動 においては 1,000 bp 以 下 の 核 酸 分 離 に 対 応 した 低 分 子 用 アガロースゲルを 使 用 する (1) 市 販 のキットを 使 用 する 場 合 1 O-157(ベロ 毒 素 遺 伝 子 )PCR Screening Set(タカラバイオ) 94 で1 分 55 で 1 分 72 で 1 分 を 35 サイクル 72 で 10 分 を1サイクル 行 う 増 幅 DNA の 大 きさは 171 bp である (2) 公 表 されているプライマーを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の 遺 伝 子 増 幅 酵 素 を 使 用 す る 場 合 下 記 に 示 す 例 以 外 にも 反 応 条 件 を 検 討 し 同 等 であると 判 断 されたプライマー 及 び PCR 酵 素 が 使 用 できる 1 Lin et al. Microbiol. Immunol. 37: , ( 使 用 方 法 例 ) 表 1に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 表 1 反 応 液 の 調 製 試 薬 容 量 Template 滅 菌 精 製 水 5.0 l l 10 X Ex Taq Buffer 5.0 l dntp mixture ( 各 2.5 mm) Takara Ex Taq (5U/ l) 5pmol/ l プライマー 4.0 l 0.25 l Sense: 0.5 l Antisense: 0.5 l 計 50.0 l Sense: 5 -GAA CGA AAT AAT TTA TAT GT-3 Antisense: 5 -TTT GAT TGT TAC AGT CAT-3-3 -
5 94 で1 分 43 で 1.5 分 72 で 1.5 分 を 40 サイクル 行 う 増 幅 DNA の 大 きさは 905 bp である 2)Loop mediated isothermal amplification(lamp) 法 以 下 のキットが 利 用 できる (1)Loopamp 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 検 出 試 薬 キット( 栄 研 化 学 ) 対 応 機 種 :Loopamp リアルタイム 濁 度 測 定 装 置 (LA-320C 及 び RT-160C: 栄 研 化 学 販 売 ) その 他 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる 付 属 の DNA 抽 出 試 薬 の 他 に 5.に 示 した DNA 抽 出 方 法 による DNA 抽 出 液 も 使 用 できる 3)Real-time PCR 法 市 販 の VT 遺 伝 子 検 出 キット 又 は 公 表 されているプライマー 及 びプローブを 各 試 験 検 査 機 関 で 合 成 調 製 し 市 販 の Master Mix にてリアクションを 行 う これについて 下 記 のものが 利 用 できる (1) 市 販 キットを 使 用 する 場 合 1 CycleavePCR O-157(VT gene) Screening Kit(タカラバイオ) 対 応 機 種 : Thermal Cycler Dice Real Time System(タカラバイオ) ABI PRISM 及 び 7900(アプライド バイオシステムズ ジャパン) LightCycler Ver その 他 同 等 の 機 能 を 有 する 機 器 が 使 用 できる (2) 公 表 されているプライマー 及 びプローブを 合 成 調 製 し 市 販 の Master Mix を 使 用 する 場 合 下 記 に 示 す 例 以 外 にも 反 応 条 件 を 検 討 し 同 等 であると 判 断 されたプライマー プローブ Master Mix Real-time PCR 機 器 が 使 用 できる 1 Nielsen et al. J. Clin. Microbiol. 41: , ( 使 用 方 法 例 ) 機 器 ABI PRISM 及 び 7900 が 使 用 できる 試 薬 TaqMan Environmental Mater Mix 2.0 (アプライド バイオシステムズ Product No ) TaqMan プローブ プライマー 滅 菌 精 製 水 反 応 液 の 準 備 表 2に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 反 応 プレートのウェル 又 は 反 応 チューブに 45.0 l ずつ 反 応 液 を 入 れる 検 体 DNA 5 l を 加 えて 試 験 を 行 う 増 幅 反 応 は 50 で2 分 95 で 10 分 を1サイクル 次 いで 95 で 15 秒 60 で 1 分 を 40 サイクルに 設 定 し ランを 開 始 する - 4 -
6 ランが 終 了 したら データ 解 析 をする Auto 解 析 又 は Threshold を 0.2 に 設 定 して 解 析 する Baseline については 安 定 した 部 分 ( 目 安 として 3-10 cycle)に 手 動 設 定 による 解 析 を 行 う 各 検 体 につき Ct 値 が 得 られている 場 合 を 陽 性 とする 表 2 反 応 液 の 調 製 試 薬 VT 滅 菌 精 製 水 TaqMan Environmental Mater Mix l 25.0 l 10 pmol/ l プライマー VT1-F 3.0 l VT1-R VT2-F VT2-R 3.0 l 3.0 l 3.0 l 5pmol/ l プローブ VT1-P 2.0 l VT2-P 2.0 l 計 45.0 l VT1-F: 5 -GGA TAA TTT GTT TGC AGT TGA TGT C-3 VT1-R: 5 -CAA ATC CTG TCA CAT ATA AAT TAT TTC GT-3 VT1-P: 5 -FAM-CCG TAG ATT ATT AAA CCG CCC TTC CTC TGG A-TAMRA-3 VT2-F: 5 -GGG CAG TTA TTT TGC TGT GGA-3 VT2-R: 5 -GAA AGT ATT TGT TGC CGT ATT AAC GA-3 VT2-P: 5 -FAM-ATG TCT ATC AGG CGC GTT TTG ACC ATC TT-TAMRA-3 2 Bellin et al. J. Clin. Microbiol. 39: , ( 使 用 方 法 例 ) 機 器 LightCycler Ver. 2.0(LightCycler Capillaries 100 l 用 )が 使 用 できる 試 薬 LightCycler FastStart DNA Master HybProbe プローブ プライマー 滅 菌 精 製 水 反 応 液 表 3に 示 した 反 応 液 を 調 製 する 反 応 液 45.0 l と 検 体 DNA 5 l をキャピラリーにアプライする 増 幅 反 応 は 95 で 10 分 を 1 サイクル 次 いで 95 で 10 秒 60 で5 秒 (55 まで 0.5 ずつタッチダウン) 72 で20 秒 を45サイクル 40 で 30 秒 を 1 サイクル 行 う - 5 -
7 ランを 開 始 する ランが 終 了 したら データ 解 析 をする 表 3 反 応 液 の 調 製 試 薬 容 量 滅 菌 精 製 水 10 LC-DNA Master 25mM MgCl l 5.0 l 6.0 l 10 pmol/ l プライマー VT1 StxA l StxA l VT2 StxA l StxA l 3pmol/ l プローブ VT1 StxA1 FL l StxA1 LC l VT2 StxA2 FL l StxA2 LC l 計 45.0 l StxA1 598: 5 -AGT CGT ACG GGG ATG CAG ATA AAT-3 StxA1 1015: 5 -CCG GAC ACA TAG AAG GAA ACT CAT-3 StxA1 FL724: 5 -CTG TCA CAG TAA CAA ACC GTA ACA TCG CTC-FITC-3 StxA1 LC693: 5 -Red705-TGC CAC AGA CTG CGT CAG TGA GGT-3 StxA2 679: 5 -TTC CGG AAT GCA AAT CAG TC-3 StxA2 942: 5 -CGA TAC TCC GGA AGC ACA TTG-3 StxA2 FL769: 5 -MAG AGC AGT TCT GCG TTT TGT CAC TGT CA-FITC-3 StxA2 LC799: 5 -Red640-AGC AGA AGC CTT ACG CTT CAG GC-3 その 他 同 等 品 も 使 用 できる VT 遺 伝 子 検 出 法 の 感 度 確 認 が 必 要 な 場 合 は 血 清 群 O26 O111 又 は O157(VT 陽 性 株 )の 菌 濃 度 が 約 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )を 作 製 し 試 験 する 血 清 群 O26 O111 又 は O157(VT 陽 性 株 )を Tryptic soy broth( 栄 研 化 学 日 水 製 薬 オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )(10 ml)に 接 種 し 36±1 で 18±1 時 間 培 養 する( 約 5X10 8 cfu/ml) この 培 養 液 を 対 象 検 体 の mec 培 養 液 9ml を 用 いて 10-4 倍 希 釈 する この 10-4 倍 希 釈 液 1ml を さらに4 ml の 対 象 検 体 の mec 培 養 液 で 希 釈 した 菌 液 を 試 料 とする この 希 釈 菌 液 は 約 1X10 4 cfu/ml( 検 体 の 増 菌 培 養 液 )とし 試 験 に 用 いる 菌 液 調 製 について 各 機 関 であらかじめ 菌 株 の 増 殖 程 度 を 確 認 - 6 -
8 し 必 要 ならば 希 釈 倍 率 の 変 更 を 行 う 7. 免 疫 磁 気 ビーズ 法 血 清 群 O26 O111 又 は O157 の 分 離 を 目 的 に 増 菌 培 養 液 を 免 疫 磁 気 ビーズ 法 に 供 試 する 免 疫 磁 気 ビーズとしては 以 下 のものが 利 用 できる 各 社 ビーズの 仕 様 に 合 わせた 各 ビーズ 液 量 を 別 々の 1.5 ml チューブに 入 れ 各 々に1ml ずつ 培 養 液 を 加 え 濃 縮 する この 際 異 なる 血 清 群 のビーズを 混 合 して 用 いてはならない また 濃 縮 操 作 は 各 社 製 ビーズの 仕 様 に 合 わせ 0.05% Tween20 加 PBS 又 は 滅 菌 生 理 食 塩 水 を 使 用 し 最 終 的 に 0.1 ml に 懸 濁 する 詳 細 な 試 験 方 法 は 各 仕 様 書 を 参 照 する 交 差 汚 染 を 避 けるためにマイクロチューブの 蓋 をあける 際 は 固 く 絞 ったアルコール 綿 で 蓋 を 覆 うな どの 配 慮 が 必 要 である また ビーズ 吸 着 操 作 後 の 培 養 液 や 洗 浄 液 を 取 り 除 く 際 には ディスポー サブルのスポイトの 使 用 やマイクロピペットの 汚 染 防 止 などを 配 慮 する 1) 血 清 群 O26 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O26 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads EPEC/VTEC O26(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) 2) 血 清 群 O111 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O111 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads EPEC/VTEC O111(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) 3) 血 清 群 O157 (1) 免 疫 磁 気 ビーズ O157 生 研 (デンカ 生 研 ) (2)Dynabeads anti-e.coli O157(ダイナル 製 造 ;ベリタス 販 売 ) その 他 同 等 品 も 使 用 できる 8. 分 離 培 養 法 分 離 培 養 は 増 菌 培 養 液 の 直 接 塗 抹 及 び 免 疫 磁 気 ビーズ 濃 縮 液 の 塗 抹 によって 行 う 直 接 塗 抹 法 につ いては 増 菌 培 養 液 10 l 免 疫 磁 気 ビーズ 法 については 免 疫 磁 気 ビーズ 濃 縮 液 10~20 l を 各 種 分 離 平 板 培 地 1 枚 あたりに 画 線 塗 抹 し 36±1 で 18~24 時 間 培 養 後 疑 われるコロニーを 分 離 する 多 く の 単 離 コロニーが 出 現 するように 1 種 類 につき2 枚 以 上 の 分 離 平 板 培 地 を 用 いる 二 分 画 培 地 の 場 合 は 相 当 の 面 積 に 塗 抹 する また 増 菌 培 養 液 を 希 釈 したものを 塗 抹 するなどの 操 作 を 必 要 に 応 じて 行 う 1 検 体 につき 典 型 的 コロニーをできる 限 り5 個 以 上 釣 菌 する なお 凍 結 等 によって 菌 の 損 傷 が 考 えられる 場 合 は セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム(CT)に 感 受 性 が 高 いことが 考 えられるの で CT 非 添 加 の 分 離 平 板 培 地 も 使 用 する 1) 直 接 塗 抹 法 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルビトールマッコンキー(CT-SMAC) 寒 天 培 地 及 び 2) 免 疫 磁 気 ビーズ 塗 抹 法 に 示 す 血 清 群 O111 用 の 酵 素 基 質 培 地 を1 種 類 について 各 1 枚 ずつ を 使 用 する CT-SMAC 寒 天 培 地 では O157 はソルビトール 非 分 解 又 は 遅 分 解 の 無 色 透 明 コロニー - 7 -
9 O26 及 び O111 は ソルビトール 分 解 の 赤 色 コロニーを 形 成 する それぞれの 典 型 的 コロニーを 釣 菌 して 血 清 凝 集 にて 血 清 群 O26 O111 及 び O157 の 確 定 を 行 う 酵 素 基 質 培 地 では それぞれの 培 地 での 典 型 的 な 血 清 群 O111 のコロニー また 血 清 群 O26 及 びO157については 大 腸 菌 コ ロニーを 各 培 地 上 での 特 徴 に 従 って 釣 菌 し 9.の 方 法 に 従 い 血 清 凝 集 反 応 にて 血 清 群 O 及 び O157 の 確 定 を 行 う 2) 免 疫 磁 気 ビーズ 塗 抹 法 (1) 血 清 群 O26 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ラムノースマッコンキー(CT-RMAC) 寒 天 培 地 を 必 ず 使 用 し CT-Vi RX O26 寒 天 培 地 CT-クロモアガーO26/0157 培 地 CT-SMAC 寒 天 培 地 CT-ColiID 寒 天 培 地 等 の 大 腸 菌 が 鑑 別 できる 培 地 を1 種 類 以 上 併 用 することとする セフィキシム 及 び 亜 テ ルル 酸 カリウム 等 の 添 加 によって 選 択 性 の 高 まることが 期 待 できるため 分 離 平 板 培 地 にはこれ らを 添 加 する 1 CT-RMAC 寒 天 培 地 ( 自 家 調 製 MacConkey Agar Base( 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )の 使 用 又 は 市 販 生 培 地 :デンカ 生 研 日 水 製 薬 ) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 (Bile salts No.3) 1.5 g ラムノース 10.0 g NaCl 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O26 はラムノース 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する ラムノース 分 解 性 の 他 の 大 腸 菌 は 赤 色 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 CT-Vi RX O26 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 ) 基 礎 培 地 ペプトン 15.0 g NaCl 5.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g - 8 -
10 L-ラムノース 10.0 g フェノールレッド 0.03 g 発 色 基 質 0.3 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50~60 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O26 は 青 紫 ~ 黒 色 コロニーを 形 成 する O26 以 外 の 血 清 群 の 大 腸 菌 は 黄 緑 ~ 青 緑 色 を また 大 腸 菌 以 外 の 腸 内 細 菌 は 緑 黄 色 又 は 赤 色 のコロニーを 形 成 する ブドウ 球 菌 などの 腸 内 細 菌 以 外 の 菌 はほとんど 発 育 しない 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 3 CT-クロモアガーO26/0157 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 及 び 酵 母 エキス 8.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 23.0 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 とし て 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O26 は 緑 色 コロニーを 血 清 群 O157 は 赤 色 コロニーを 形 成 す る その 他 の 大 腸 菌 は 赤 紫 ~ 紫 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 4 CT-ColiID 寒 天 培 地 (ボトル 培 地 ; 日 本 ビオメリュー) 基 礎 培 地 ゼラチンペプトン 7.0 g NaCl 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 活 性 化 剤 混 合 物 0.3 g - 9 -
11 発 色 基 質 混 合 物 0.3 g 寒 天 15.0 g ph 7.2 備 考 : 加 温 溶 解 後 50 以 下 に 冷 却 し 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが,その 保 存 期 間 は2~ 8 で7 日 以 内 とする 典 型 的 な O26 及 びその 他 の 血 清 群 (O157 を 除 く)はピンク~ 赤 紫 色 のコロニーを 形 成 する 血 清 群 O157 及 び 大 腸 菌 群 は 灰 色 ~ 青 色 を また 他 のグラ ム 陰 性 菌 は 無 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 日 本 ビオメリュー(200 ml 培 地 用 ) 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 5 CT-SMAC 寒 天 培 地 ( 前 述 ) その 他 同 等 の 大 腸 菌 が 鑑 別 できる 培 地 も 使 用 できる (2) 血 清 群 O111 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルボースマッコンキー(CT-SBMAC) 寒 天 培 地 又 は CT-SMAC のうち 1 種 類 を 必 ず 使 用 する CT-SBMAC 寒 天 培 地 では 典 型 的 な 血 清 群 O111 の 形 成 す るソルボース 非 分 解 又 は 遅 分 解 の 無 色 透 明 コロニー CT-SMAC 寒 天 培 地 では 典 型 的 な 大 腸 菌 コ ロニーを 釣 菌 して O111 血 清 凝 集 にて 血 清 群 O111 の 確 定 を 行 う また 酵 素 基 質 培 地 として ク ロモアガー STEC 培 地 CIX 寒 天 培 地 Vi EHEC 培 地 XM-EHEC 寒 天 培 地 等 のうち1 種 類 以 上 を 併 用 することとする 1 CT-SBMAC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 日 水 製 薬 極 東 製 薬 工 業 等 ; 自 家 調 製 又 は 基 礎 培 地 使 用 (マッ コンキー 基 礎 培 地 を 用 いる 場 合 : 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 )) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g ソルボース 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 又 は マッコンキー 基 礎 培 地 40.0 g
12 ソルボース 10.0 g ph 7.1±0.2 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O111 はソルボース 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 クロモアガーSTEC 培 地 ( 市 販 生 培 地 又 は 粉 末 培 地 使 用 :クロモアガー 社 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) 基 礎 培 地 ペプトン 及 び 酵 母 エキス 8.0 g 塩 化 ナトリウム 5.2 g 特 殊 酵 素 基 質 混 合 物 2.6 g 寒 天 15.0 g ph 7.0±0.2 備 考 : 基 礎 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 添 付 のクロモアガーSTEC サプリメント( 選 択 剤 混 合 物 25 mg/バイアル) を2 本 加 え 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 藤 色 コロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 O157 O121 などの 一 部 血 清 群 の 大 腸 菌 も 藤 色 コロニーを 形 成 する 3 CIX 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 極 東 製 薬 工 業 ) カゼインペプトン 9.7 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 糖 類 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 寒 天 15.0 g 酵 素 基 質 2 種 0.2 g 選 択 剤 混 合 物 2.55 mg ph 指 示 薬 0.03 g ph 7.5±0.1 備 考 : 保 存 期 間 は 2~10 で3ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 群 青 色 ~ 濃 紫 色 コ
13 ロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 も 群 青 色 ~ 濃 紫 色 コロニーを 形 成 する 血 清 群 O157 は 青 ~ 青 緑 色 のコロニーを 形 成 する 4 Vi EHEC 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 栄 研 化 学 ) ペプトン 13.5 g 胆 汁 酸 塩 1.2 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 酵 素 基 質 混 合 物 6.1 g 選 択 剤 g 寒 天 19.0g ph 7.2±0.2 備 考 : 保 存 期 間 は 2~10 で2ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 はえんじ 色 コロニー を 形 成 する また 血 清 群 O26 は 緑 色 O157 は 無 色 透 明 で 中 心 部 褐 色 のコロニーを 形 成 する 5 XM-EHEC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 : 日 水 製 薬 ) ペプトン 15.0 g 塩 化 ナトリウム 3.0 g 胆 汁 酸 塩 1.8 g ソルビトール 15.0 g 発 色 酵 素 基 質 混 合 物 0.24 g 選 択 剤 5.05 mg 寒 天 13.0 g ph 7.2±0.2 備 考 : 保 存 期 間 は4~10 で 2.5 ヶ 月 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O111 は 白 濁 した 赤 紫 ~ 紫 色 コロニーを 形 成 する また 血 清 群 O26 は 青 紫 色 コロニーを 血 清 群 O157 は 赤 紫 ~ 紫 色 コロニーを 形 成 する その 他 血 清 群 O111 を 鑑 別 できる 酵 素 基 質 培 地 同 等 品 も 使 用 できる (3) 血 清 群 O157 セフィキシム 亜 テルル 酸 カリウム 添 加 ソルビトールマッコンキー(CT-SMAC) 寒 天 培 地 を 必 ず 使 用 し 酵 素 基 質 培 地 として BCM O157 寒 天 培 地 クロモアガー O157 培 地 クロモアガー O157TAM 培 地 CT-O157:H7ID 寒 天 培 地 レインボーアガー0157 培 地 のうち1 種 類 以 上 を 併 用 することと する
14 1 CT-SMAC 寒 天 培 地 ( 市 販 生 培 地 自 家 調 製 又 は 基 礎 培 地 使 用 :オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 日 水 製 薬 メルク 栄 研 化 学 日 本 ベクトン ディッキンソン 等 ) 基 礎 培 地 ペプトン 20.0 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g ソルビトール 10.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g ニュートラルレッド 0.03 g クリスタルバイオレット g 寒 天 15.0 g ph 7.2±0.1 備 考 :121 で 15 分 間 滅 菌 後 50 以 下 に 冷 却 し 以 下 に 示 す 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたの ち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 典 型 的 な 血 清 群 O157 はソルビトー ル 非 分 解 又 は 遅 分 解 コロニーであり 無 色 透 明 コロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 2 BCM O157 寒 天 培 地 ( 栄 研 化 学 ) 基 礎 培 地 トリプトン 6.0 g ポリペプトン 12.0 g 糖 類 ( 単 糖 類 二 糖 類 )40.0 g 発 色 基 質 0.4 g グラム 陽 性 菌 抑 制 剤 1.5 g フェノールレッド 0.1 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 寒 天 15.0 g 添 加 剤 亜 テルル 酸 カリウム 0.5 mg ph 6.8±0.1 備 考 : 基 礎 培 地 を 加 熱 溶 解 する(オートクレーブ 不 可 ) これを 50 以 下 に 冷 却 した 後 亜 テルル 酸 カリウムを 加 えてから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお, 選 択 性 を 高 めるには ノボビオシンナトリウムを 目 的 にあわせて(10 mg/1,000 ml) 添 加 す るとよい 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~10 で 90 日 以 内 と する 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 黒 ~ 濃 緑 色 コロニーを 形 成 する
15 3 クロモアガーO157 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 1.0 g 寒 天 15.0 g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるには 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 藤 色 コロニーを 形 成 する 4 クロモアガーO157 TAM 培 地 (クロモアガー 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) ペプトン 5.0 g 酵 母 エキス 3.0 g 塩 化 ナトリウム 5.0 g 選 択 剤 発 色 基 質 混 合 物 1.0 g チオ 硫 酸 ナトリウム 鉄 混 合 物 5.0 g 寒 天 12.0g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 後 (オートクレーブ 不 可 過 度 の 加 熱 も 避 けること)50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるには 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 える 添 加 剤 は 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は 2~8 で 30 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 藤 色 コロニーを 形 成 する 5 CT-O157:H7ID 寒 天 培 地 (ボトル 培 地 ; 日 本 ビオメリュー) 基 礎 培 地 ゼラチンペプトン 7.0 g NaCl 5.0 g
16 酵 母 エキス 6.0 g 炭 酸 ナトリウム 0.13 g ニュートラルレッド 0.01 g 胆 汁 酸 塩 1.5 g 炭 水 化 物 混 合 物 24.0 g 活 性 混 合 物 0.25 g 発 色 基 質 混 合 物 0.25 g 寒 天 12.5 g ph 7.1 備 考 : 加 温 溶 解 後 50 以 下 に 冷 却 し 添 加 剤 を 無 菌 的 に 加 えたのち 滅 菌 シャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 として 使 用 する 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが,その 保 存 期 間 は2~ 8 で7 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 青 緑 色 その 他 の 血 清 群 の 大 腸 菌 は 紫 色 のコロニーを 形 成 する 添 加 剤 : 培 地 1,000 ml に 対 し セフィキシム 0.05 mg 亜 テルル 酸 カリウム 2.5 mg を 加 え る 添 加 剤 は 日 本 ビオメリュー(200 ml 培 地 用 ) 関 東 化 学 メルク ベリタス 等 で 購 入 することができる 6 レインボーアガーO157 培 地 (バイオログ 製 造 ;GSI クレオス 販 売 ) ペプトン 6.0 g 糖 類 g 発 色 基 質 0.4 g 3-indoxyl-β-D-galactoside 0.25 g 3-indoxyl-β-D-glucuronide 0.12 g 寒 天 14.0 g ph 6.8±0.1 備 考 : 培 地 は 加 熱 溶 解 又 は 121 で5 分 間 滅 菌 した 後 50 以 下 に 冷 却 してから 滅 菌 シ ャーレに 分 注 し 寒 天 平 板 を 作 製 する なお 選 択 性 を 高 めるためには ノボビオシンナ トリウムを 目 的 にあわせて 培 地 1,000 ml あたり 100 mg 添 加 するとよい ただし 血 清 群 O157 以 外 の 大 腸 菌 も 生 育 させる 場 合 は 10 mg の 添 加 とする 作 製 した 寒 天 平 板 は 冷 蔵 保 存 するが その 保 存 期 間 は2~8 で 14 日 以 内 とする 典 型 的 な 血 清 群 O157 は 黒 ~ 灰 色 コロニーを 形 成 する 9. 血 清 型 別 試 験
17 各 分 離 平 板 培 地 から 血 清 群 O26 O111 及 び O157 と 疑 われるコロニーを 釣 菌 し 普 通 寒 天 培 地 等 にて 純 培 養 する( 培 養 条 件 :36±1 で 18~24 時 間 ) 免 疫 血 清 及 び 抗 体 を 感 作 したラテックスを 使 用 した 凝 集 試 薬 が 市 販 されている 試 験 方 法 は 仕 様 書 を 参 照 する 生 菌 を 用 いた 場 合 は 誤 判 定 となる 場 合 が あるため 最 終 判 定 には 加 熱 死 菌 を 用 いる 1) 血 清 群 O26 (1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O26 (デンカ 生 研 ) (2) E. coli O26-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 2) 血 清 群 O111 1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O111 (デンカ 生 研 ) 2)E. coli O111-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 3) 血 清 群 O157 (1) 病 原 大 腸 菌 免 疫 血 清 O157 (デンカ 生 研 ) (2) 大 腸 菌 O157 検 出 試 薬 UNI (オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 ) (3)E. coli O157-F 生 研 (デンカ 生 研 ) 各 血 清 群 につき その 他 同 等 品 も 使 用 できる 10. 生 化 学 的 性 状 試 験 血 清 群 O26 O111 及 び O157 と 疑 われるコロニーについては 生 化 学 的 性 状 を 確 認 する TSI 寒 天 培 地 LIM 培 地 CLIG 培 地 各 種 キット 等 から 選 択 して 使 用 できる( 培 地 使 用 における 培 養 条 件 : 36±1 で 18~24 時 間 ) 1)TSI 寒 天 培 地 ( 日 水 製 薬 栄 研 化 学 メルク オキソイド 製 造 ; 関 東 化 学 販 売 他 ) ペプトン 20.0 g 肉 エキス 3.0 g 酵 母 エキス 3.0 g NaCl 5.0 g 乳 糖 10.0 g ショ 糖 10.0 g ブドウ 糖 1.0 g クエン 酸 鉄 アンモニウム 0.2 g チオ 硫 酸 ナトリウム 0.2 g フェノールレッド 24 mg 寒 天 12.0 g ph 7.4±
18 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に3ml ずつ 分 注 し 121 で 15 分 間 滅 菌 後 斜 面 寒 天 ( 半 高 層 ) として 使 用 する また 市 販 品 を 使 用 してもよい TSI 寒 天 培 地 での 大 腸 菌 は 高 層 部 黄 変 斜 面 部 黄 変 硫 化 水 素 非 産 生 ガス 産 生 を 示 す 2)LIM 培 地 ( 日 水 製 薬 極 東 製 薬 工 業 栄 研 化 学 他 ) ペプトン 12.8 g 酵 母 エキス 3.0 g ブドウ 糖 1.0 g L-リジン 塩 酸 塩 10.0 g L-トリプトファン 0.5 g ブロムクレゾールパープル 0.02 g 寒 天 2.7 g ph 6.8 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 約 5ml ずつ 分 注 し 121 で 15 分 間 滅 菌 後 急 冷 し 高 層 培 地 とする 多 くの 大 腸 菌 は 高 層 部 紫 色 変 運 動 性 陽 性 インドール 産 生 を 示 すが 高 層 部 黄 色 変 ( 血 清 群 O111 の 多 くの 株 ) 運 動 性 陰 性 など 非 定 型 の 性 質 を 持 つ 場 合 もあることから これらにつ いても 大 腸 菌 の 性 状 として 検 査 する 3)CLIG 培 地 ( 極 東 製 薬 工 業 ) カゼインペプトン 7.5 g 肉 ペプトン 2.5 g ラクトース 1.0 g セロビオース 10.0 g トリプトファン 0.1 g MUG 0.02 g NaCl 5.0 g フェノールレッド g 寒 天 14.9 g ph 7.4 備 考 : 加 温 溶 解 後 小 試 験 管 に 約 3ml ずつ 分 注 し 115 で 15 分 間 滅 菌 後 斜 面 寒 天 ( 半 高 層 ) 培 地 とする 大 腸 菌 は 高 層 部 黄 変 斜 面 部 赤 変 を 示 す 典 型 的 な 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O157 は 紫 外 線 照 射 下 で 蛍 光 を 示 さないが それ 以 外 の 血 清 型 は 蛍 光 を 示 す
19 11.VT 確 認 試 験 血 清 群 O26 O111 又 は O157 と 疑 われるコロニーについては VT 遺 伝 子 又 は VT 産 生 性 を 以 下 の 方 法 で 確 認 する 1)PCR 法 (1)O-157(ベロ 毒 素 遺 伝 子 )PCR Screening Set(タカラバイオ) (2)O-157(ベロ 毒 素 1 型 2 型 遺 伝 子 )PCR Typing Set(タカラバイオ) その 他 6.VT 遺 伝 子 検 出 法 で 使 用 した VT 遺 伝 子 検 出 法 及 び 同 等 品 も 使 用 できる 2) 逆 受 身 ラッテクス 凝 集 反 応 (RPLA) 法 (1)VTEC-RPLA 生 研 (デンカ 生 研 ) その 他 同 等 品 も 使 用 できる なお 増 菌 培 養 液 での VT 遺 伝 子 検 出 試 験 の 代 替 には 使 用 でき ない 3)イムノクロマトグラフィー 法 等 (1)デュオパス ベロトキシン(メルク 製 造 : 極 東 製 薬 工 業 販 売 ) (2)キャピリア VT(タウンズ) (3)ラインジャッジ(タウンズ) (4)NH イムノクロマト VT1/2( 日 本 ハム 製 造 : 日 水 製 薬 和 光 純 薬 工 業 極 東 製 薬 工 業 コスモ バイオ 販 売 ) (5)RIDA スクリーン ベロトキシン(アヅマックス) その 他 同 等 品 も 使 用 できる なお 増 菌 培 養 液 での VT 遺 伝 子 検 出 試 験 の 代 替 には 使 用 で きない 12. 判 定 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 血 清 群 O26 O111 又 は O157 が 分 離 されたことをもって 陽 性 とする VT 遺 伝 子 検 出 法 によって 陽 性 であったが 血 清 群 O26 O111 又 は O157 の 分 離 ができなかった 場 合 は 陰 性 とする
20 食 品 からの 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 O26, O111, O157 検 査 法 ( 参 考 ) 食 品 検 体 25 g+mec 培 地 225 ml 増 菌 培 養 (42±1 22±2 時 間 ) 遺 伝 子 検 出 法 培 養 法 * 培 養 液 培 養 液 分 離 培 養 DNA 抽 出 直 接 法 免 疫 磁 気 ビーズ 法 (O26, O111, O157) VT 遺 伝 子 検 出 判 定 陰 性 終 了 VT 遺 伝 子 陽 性 CT-SMAC 1 枚 O111 用 酵 素 基 質 培 地 1 種 類 1 枚 O26 CT-RMAC 2 枚 O26 用 酵 素 基 質 培 地 など a 1 種 類 2 枚 O111 CT-SBMAC またはCT-SMAC 2 枚 O111 用 酵 素 基 質 培 地 b 1 種 類 2 枚 O157 CT-SMAC 2 枚 O157 用 酵 素 基 質 培 地 c 1 種 類 2 枚 a-c 培 地 の 詳 細 については 通 知 文 を 参 照 すること 普 通 寒 天 培 地, TSI, LIM 等 *ベロ 毒 素 (VT) 遺 伝 子 検 出 法 を 行 う ための 設 備 を 整 えることができない 等 諸 般 の 事 情 がある 場 合 について は 培 養 法 を 行 って 差 し 支 えない 血 清 型 別 試 験 生 化 学 的 性 状 試 験 VT 確 認 試 験 判 定 陰 性 陽 性
2
2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT
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