Post-bisulfite Adaptor Taggingプロトコールリビジョン 12
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- たみえ たけくま
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1 試 薬 類 Qubit dsdna BR Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q32850) Qubit dsdna HS Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q32851) Qubit ssdna Assay Kit (ライフテクノロジーズ, # Q10212) Agencourt AMPure XP (ベックマンコールター, # A63880) 一 般 的 な 10 PCR buffer (100 mm Tris-HCl (ph 8.3), 500 mm KCl, 15 mm MgCl2) アジレント RNA 6000 Pico Kit (アジレント, # ) 10 mm Tris-acetate, ph mm Tris-HCl, ph 7.5 Klenow Fragment (3 5 exo ) (NEB, #M0212M) 一 般 的 な 濃 度 の 酵 素 (5,000 U/ml:NEB, #M0212S や#M0212L)ではなくて 必 ず 10 倍 濃 度 標 品 (50,000 U/ml: #M0212M)を 使 用 すること Bst DNA polymerase large fragment (NEB, #M0275S) Exonuclease I (NEB, #M0293S) Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes, #F-540S) EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO Research, #D5005) Dynabeads M-280 Streptavidin (ライフテクノロジーズ, #112-05D) 2 BW(Li) Solution (50 ml) LiCl * 6.3 g 1 M Tris-HCl, ph ml 500 mm EDTA 0.1 ml * LiCl の 溶 解 は 発 熱 を 伴 う 溶 液 の 突 沸 を 防 ぐため 秤 量 した LiCl の 粉 末 を 50ml の 遠 沈 管 に 移 した 後 これを 40ml の 水 で 一 気 に 溶 解 すると 良 い 完 全 に LiCl の 粉 が 溶 けた 後 に Tris と EDTA を 加 え 水 で 50ml にメスアップする 0.1 N NaOH 溶 液 10N の NaOH 溶 液 を 使 用 直 前 に 希 釈 する KAPA Library Quantification Kit for Illumina (KAPA, # KK4824 あるいは qpcr のプラットフォーム 専 用 の 相 当 品 でも 良 い) Hybridization Buffer A (50 ml) 1
2 5 M NaCl 9 ml ( 最 終 濃 度 900 mm) 1 M Tris-HCl, ph ml ( 最 終 濃 度 180 mm) ddh2o 32 ml オリゴヌクレオチド (OPC グレード 品 で 良 い) Bio-PEA2-N4 (100 µm) 5 -biotin-aca CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT NNN N-3 PE-reverse-N4 (100 µm) 5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN N-3 PBAT-PE-iX-N4 (いずれも 100 µm) 5 -CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT XXX XXX GTA AAA CGA CGG CCA GCA GGA AAC AGC TAT GAC NNN N-3 下 線 を 引 いた6 塩 基 を 以 下 のインデックス 配 列 で 置 換 したオリゴヌクレオチドを 用 意 する これらの 配 列 はイルミナ 社 TruSeq DNA LT Sample Prep Kit で 用 いられているインデック ス 配 列 の 相 補 鎖 に 相 当 するので これらを 用 いることによって 上 記 キットと 同 一 インデッ クス 番 号 をそのまま 利 用 することが 出 来 る なおインデックス 番 号 および 26 は 上 記 キットでも 欠 番 である インデックス 配 列 インデックス 配 列 インデックス 配 列 1 CGTGAT 9 CTGATC 18 GCGGAC 2 ACATCG 10 AAGCTA 19 TTTCAC 3 GCCTAA 11 GTAGCC 20 GGCCAC 2
3 4 TGGTCA 12 TACAAG 21 CGAAAC 5 CACTGT 13 TTGACT 22 CGTACG 6 ATTGGC 14 GGAACT 23 CCACTC 7 GATCTG 15 TGACAT 25 ATCAGT 8 TCAAGT 16 GGACGG 27 AGGAAT Primer 3 (100 µm) 5 -AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3 PBAT-PE-Seq (100 µm) 5 -GTA AAA CGA CGG CCA GCA GGA AAC AGC TAT GAC-3 PBAT-PE-Idx (100 µm) 5 -GTC ATA GCT GTT TCC TGC TGG CCG TCG TTT TAC-3 プラスチック 消 耗 品 チューブ 全 てのステップにおいて 低 吸 着 タイプの 1.5-ml および 0.2-ml のチューブを 使 用 する チップ ストレプトアビジンビーズをチップ 内 に 吸 い 込 む 操 作 では 低 吸 着 タイプのチ ップを 使 用 する 3
4 装 置 DynaMag-2 Magnet (ライフテクノロジーズ) あるいは 相 当 品 SPRIPlate 96R 磁 石 プレート(ベックマンコールター)あるいは 相 当 品 トミーMX-301 冷 却 微 量 遠 心 機 あるいは 相 当 品 アジレント Bioanalyzer 2100 Qubit Fluorometer or Qubit 2.0 Fluorometer (ライフテクノロジーズ) TOMY PMC-060 小 型 遠 心 機 あるいは 相 当 品 ABI9700 サーマルサイクラーあるいは 相 当 品 StepOnePlus リアルタイム PCR システム (アプライドバイオシステムズ) あるい は 相 当 品 XCell SureLock Mini-Gel (ライフテクノロジーズ)あるいは 相 当 品 電 気 泳 動 用 のパワーサプライ 4
5 サーマルサイクラーで 使 用 するプログラム プログラム 1 (バイサルファイト 処 理 用 セクション II) C で 10 分 C で 2 時 間 30 分 3. 4 C でソーク プログラム 2 ( 第 1 鎖 合 成 用 セクション III) C で 5 分 2. 4 C で 20 分 3. 4 C から 37 C まで 1 C/ 分 で 温 度 を 上 げる* C で 1 時 間 30 分 C で 10 分 6. 4 C でソーク プログラム 3 ( 第 2 鎖 合 成 用 セクション VI) C で 5 分 2. 4 C で 20 分 3. 4 C から 37 C まで 1 C/ 分 で 温 度 を 上 げる* C で 30 分 C で 10 分 6. 4 C でソーク プログラム 4 ( 溶 出 用 セクション VII) C で 5 分 C で 15 分 C で 30 分 4. 4 C でソーク *サーマルサイクラーで+1 / 分 での 温 度 変 化 の 制 御 が 難 しい 場 合 は 2ステップのサイクルプロ グラムを 使 用 してこれを 実 現 することが 可 能 である 最 初 のサイクルでは 秒 と 秒 の2ステップを 実 施 し 以 降 のサイクルではサイクル 毎 に 1 ずつそれぞれのステップの 温 度 を 上 昇 させれば 33 サイクル 後 には 37 に 到 達 する 5
6 I. DNA 濃 度 の 測 定 (1 日 目 ) DNA 濃 度 の 正 確 な 算 出 は 非 常 に 重 要 である Qubit dsdna BR Assay Kit を 用 いた 定 量 が 手 軽 で 十 分 な 精 度 がある OD260 の 測 定 は この 波 長 領 域 に 他 の 生 体 物 質 の 吸 収 帯 が 重 なり DNA 量 を 過 大 に 見 積 もってしまうため 避 けること 1. サンプル DNA の 濃 度 を Qubit dsdna BR Assay Kit と Qubit Fluorometer を 使 用 して 定 量 する II. バイサルファイト 処 理 (1 日 目 ) 操 作 が 容 易 であることから ルーチンワークでは 100ng 程 度 の DNA を 開 始 量 にすると 良 い しかし 鋳 型 調 製 は~1ng 程 度 から 始 めるのが 最 も 効 率 的 であるため より 効 率 的 な 調 製 を 行 う 必 要 がある 場 合 は バイサルファイト 処 理 後 の DNA をいくつかのチューブに 分 けたうえで 第 1 鎖 合 成 (ステップ III)に 取 りかかると 良 いだろう 以 下 のプロトコールは ZYMO Research 社 の EZ DNA Methylation-Gold Kit に 基 づくが 一 部 変 更 箇 所 がある µl のミリ Q 水 50 µl の M-Dissolving Buffer および 300 µl の M-Dilution Buffer を CT Conversion Reagent のチューブに 加 え 混 合 する 高 収 率 で 効 率 的 なバイサルファイト 処 理 を 行 うためには CT Conversion Reagent は 用 時 調 製 すべきである 2. CT Conversion Reagent のチューブを 室 温 で 10 分 間 ローテーターに 設 置 して 十 分 溶 解 させる 3. 以 下 の 内 容 を 混 合 する CT Conversion Reagent 130 µl ミリ Q 水 (20 x) µl サンプル DNA x µl 4. 上 記 溶 液 を 50 µl ずつ 3 本 の 0.2-ml チューブに 分 注 する 5. サーマルサイクラーにセットしプログラム 1 を 開 始 する 6. キット 付 属 のスピンカラムをコレクションチューブに 乗 せ 600 µl の M-Binding Buffer をカラムに 分 注 する 6
7 7. ステップ 5 の 処 理 が 終 わったサンプルをカラムに 添 加 した M-Binding Buffer に 全 量 加 えた 後 キャップを 閉 めて 数 回 転 倒 混 和 を 行 って 十 分 混 合 する 8. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 ( 10,000 g)で 30 秒 間 遠 心 する 9. フロースルーを 再 度 カラムに 乗 せる EZ DNA Methylation-Gold キットに 付 属 するシリカカラムでは 時 々 溶 液 がレジンと 接 触 し ないままにスッポ 抜 けることがある 確 実 に DNA を 回 収 するために カラムの 状 態 をよく 確 認 してから 操 作 を 始 めること 上 記 のようにフロースルーを 再 度 カラムに 乗 せて 遠 心 する 操 作 はこ のような 事 故 をなるべく 少 なくするための 工 夫 の 一 つである 10. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で( 10,000 g) 30 秒 間 遠 心 する 11. フロースルーを 捨 てる µl の M-Wash Buffer を 加 え 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フ ロースルーを 捨 てる µl の M-Desulphonation Buffer をカラムに 乗 せ 室 温 で 15 分 間 インキュベー ションを 行 う 14. 微 量 遠 心 機 の 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フロースルーを 捨 てる µl の M-Wash Buffer をカラムに 乗 せ 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 し フロー スルーを 捨 てる 16. ステップ 15 をもう 一 度 繰 り 返 し カラムを 空 の 新 しいチューブに 乗 せる µl の M-Elution Buffer を 直 接 レジンに 乗 せ 室 温 で 2 分 間 インキュベーション した 後 最 高 回 転 数 で 30 秒 間 遠 心 して DNA を 溶 出 する 溶 出 の 容 積 (22 µl) には Qubit ssdna Assay Kit での 定 量 のための 1 µl と RNA 6000 Pico Kit を 用 いたアジレント Bioanalyzer でのクオリティチェック(QC)のための 1 µl が 含 まれてい る 30 ng 以 下 の DNA から 鋳 型 調 製 を 開 始 した 場 合 には Qubit も Bioanalyzer も 検 出 限 界 以 下 になるなので これらの QC ステップは 省 き ステップ 16 の 溶 出 容 積 を 20 µl に 減 らす な お 上 記 操 作 による 通 常 の 収 率 は 開 始 DNA の 30%から 70%である また 得 られる DNA は 100~1,000 nt で 600 nt にピークを 有 するスメアーパターンの 分 布 を 示 す バイサルファイト 処 理 後 の DNA は 不 安 定 であることから このステップで 実 験 を 停 止 してはな らない 次 の 第 1 鎖 合 成 に 最 適 な 停 止 点 があるので そこまで 進 めること III. 第 1 鎖 合 成 (1 日 目 ) 1. 以 下 の 第 1 鎖 合 成 用 反 応 溶 液 を 準 備 する 7
8 10 NEBuffer 2 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ミリ Q 水 16 µl Bio-PEA2-N4 (100 µm) 4 µl バイサルファイト 処 理 済 DNA 20 µl 2. チューブをサーマルサイクラーに 乗 せプログラム 2 を 開 始 する 3. プログラム 2 のステップ2(4 C でのインキュベーションステップ)の 開 始 5 分 後 に プログラムをポーズさせ チューブをサーマルサイクラーから 取 り 出 し 1.5 µl の Klenow Fragment (3 5 exo )(10 倍 濃 度 品 )を 上 記 溶 液 に 添 加 し よく 混 合 す る 4. チューブをサーマルサイクラーに 再 び 乗 せ 停 止 していたプログラム 2 を 再 開 させ 第 1 鎖 合 成 を 進 める この 部 分 が 実 験 の 停 止 に 適 した 部 分 である 酵 素 を 加 えた 後 はサーマルサイクラーのプロ グラムに 任 せて 次 の 日 まで 鋳 型 調 製 のことは 忘 れてしまおう なお 反 応 後 のチューブは 4 C あるいは 20 C で 保 存 可 能 である これは このステップではバイサルファイト 処 理 DNA が 2 本 鎖 化 されており かつ 過 剰 量 のプライマーがチューブ 壁 への 吸 着 による 損 失 を 抑 えてくれる 効 果 によるものと 考 えられる IV. 過 剰 なプライマーの 除 去 (2 日 目 ) 1. 第 1 鎖 合 成 の 反 応 液 (~50 µl)を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 50 µl の AMPure XP を 添 加 してよく 混 合 する この 混 合 量 比 (つまり DNA 溶 液 : AMPure XP 比 = 1:1)では 200 bp 以 下 の DNA 断 片 が 効 率 的 に 除 かれる 第 1 鎖 合 成 で 合 成 された DNA は 200 bp 以 上 の 断 片 である 一 方 で プライマーダイ マー 等 のサイズは 100 bp 以 下 である 2. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 3. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 8
9 µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 えてボルテックスし ビーズをよく 分 散 させる 6. 軽 く 遠 心 した 後 チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 める 7. 上 清 を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 5 µl の 10 PCR Buffer と 50 µl の AMPure XP を 加 え よく 混 合 して 軽 くスピンダウンする 10 PCR Buffer を 加 えると AMPure XP による 精 製 の 再 現 性 と 回 収 率 が 良 くなる 8. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 え ボルテックスでよくビーズを 分 散 さ せ 軽 くスピンダウンして チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め る 12. 上 清 を 新 しい 1.5-ml チューブに 移 す 13. 上 清 を 1 µl 使 い Qubit dsdna HS Kit を 用 いて DNA の 量 を 定 量 する このステップの 典 型 的 な 収 率 は 開 始 DNA 量 の 40%~60%の 値 となる 30 ng 以 下 の DNA か ら 鋳 型 調 製 を 開 始 した 場 合 には Qubit の 定 量 限 界 以 下 になるのでこのステップを 省 略 し ステ ップ 11 における 溶 出 の 容 積 を 50 µl に 減 らす V. ビオチン 化 標 識 された DNA のストレプトアビジンビーズ 上 への キャプチャー (2 日 目 ) 1. よく 懸 濁 した Dynabeads M280 ストレプトアビジンビーズ 20 µl を 1.5-ml チュー ブに 取 り チューブをマグネットスタンドに 立 てる 2. 上 清 を 除 き 2 BW(Li) solution を 50 µl 加 えてビーズを 懸 濁 する 3. セクション IV の 溶 出 DNA に 対 して ビーズ 懸 濁 液 を 加 える 4. 室 温 でゆっくり 回 転 させながらインキュベーションする 5. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 9
10 µl の 2 BW(Li) solution をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピンダウン する 7. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く µl の 0.1 N NaOH 溶 液 を 加 えてボルテックスし 室 温 で2 分 間 インキュベー ションし 軽 くスピンダウンする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 10. ステップ 8 と 9 をもう 一 度 繰 り 返 す µl の 2x BW(Li) solution をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピンダウン する 12. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く µl の 10 mm Tris-HCl (ph 7.5) をビーズに 加 え ボルテックス 後 軽 くスピン ダウンする VI. 第 2 鎖 合 成 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 を 混 ぜ 第 2 鎖 合 成 用 反 応 溶 液 を 準 備 する 10 NEBuffer 2 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 36 µl PE-reverse-N4 (100 µm)(シングルエンド 用 ) 4 µl PBAT-PE-iX-N4 (100 µm)(インデックス 付 ペアエンド 用 ) 3. ビーズをボルテックスで 懸 濁 し ビーズ 懸 濁 液 を 新 しい 0.2-ml チューブに 移 す 4. サーマルサイクラーにチューブをセットしプログラム 3 を 開 始 する 5. プログラム 3 のステップ2(4 C でのインキュベーションステップ)の 開 始 5 分 後 にプログラムをポーズさせ チューブをサーマルサイクラーから 取 り 出 し 1.5 µl の Klenow Fragment (3 5 exo )(10 倍 濃 度 品 )を 上 記 溶 液 に 添 加 し よく 混 合 する 10
11 6. チューブをサーマルサイクラーに 再 び 乗 せ 停 止 していたプログラム 3 を 再 開 させ 第 2 鎖 合 成 を 進 める VII. 後 追 い 反 応 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 をまぜ 後 追 い 反 応 溶 液 を 調 製 し ビーズに 加 える 10 ThermoPol Buffer 5 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 40 µl Bst DNA polymerase large fragment 1 µl C で 30 分 間 インキュベーションする VIII. 鋳 型 DNA の 溶 出 / 二 本 鎖 化 (2 日 目 ) 1. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く 2. 以 下 の 試 薬 を 混 合 して 溶 出 / 二 本 鎖 化 反 応 液 を 調 製 する 5 Phusion HS Buffer 10.0 µl 2.5 mm dntps 5 µl ddh2o 35 µl Primer 3 (100 µm) 0.4 µl Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase 1 µl このステップには 溶 出 される DNA を 二 本 鎖 化 して SPRI ビーズによるサイズ 分 画 を 再 現 性 良 くするのみならず イルミナシークエンサでのブリッジ PCR に 必 要 なプライ マー 配 列 を 鋳 型 に 導 入 する 目 的 もある 3. プログラム 4 を 開 始 する 11
12 4. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 新 しい 1.5-ml チュ ーブに 移 す 5. Exonuclease I を µl 加 え 37 で 30 分 間 と 70 で 10 分 間 インキュベーション する 6. 溶 出 DNA の µl を Qubit dsdna HS Kit を 使 って 定 量 する IX. サイズ 分 画 (2 日 目 ) 1. 溶 出 した DNA (50 µl)に 50 µl の AMPure XP を 加 え 混 合 して 軽 くスピンダウン する 2. 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 3. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く µl の 10mM Tris-acetate (ph 8.0)を 加 えてボルテックスし ビーズをよく 分 散 させる 6. 軽 く 遠 心 した 後 チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 める 7. 上 清 を 新 しい 1.5-ml のチューブに 移 し 5 µl の 10 PCR Buffer と 50 µl の AMPure XP を 加 え よく 混 合 して 軽 くスピンダウンする 8. チューブを 室 温 で 10 分 間 インキュベーションする 9. チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め 上 清 を 除 く µl の 75%エタノールを 加 えてビーズを 洗 浄 し 再 び 除 く µl の 10 mm Tris-acetate (ph 8.0)を 加 え ボルテックスでよくビーズを 分 散 さ せ 軽 くスピンダウンして チューブをマグネットスタンドに 立 ててビーズを 集 め る 12. 上 清 を 新 しい 1.5-ml チューブに 移 す 13. 上 清 を 1 µl 使 って Qubit dsdna HS Kit を 用 いて DNA 量 を 定 量 する 通 常 このステップの 収 率 は 開 始 DNA の 20%~40%である 30 ng 以 下 の DNA から 開 始 した 場 合 には 定 量 の 限 界 以 下 になるのでこの QC のステップを 省 き ステップ 9 の 溶 出 容 積 を 21 µl に 減 らす 12
13 X. qpcr による 鋳 型 DNA の 定 量 (3 日 目 ) 1. 適 切 な qpcr 法 を 用 いて 鋳 型 中 の 有 効 鋳 型 分 子 のモル 量 を 正 確 に 測 定 する ステップ IX で 得 られる DNA 溶 液 中 には 鋳 型 分 子 の 他 に 10 倍 量 程 度 の 副 産 物 が 含 まれている したがって 蛍 光 法 ではなくて qpcr による 定 量 を 利 用 して 正 確 な 濃 度 を 求 めることが 非 常 に 重 要 である 我 々は 再 現 性 の 高 さと 簡 便 さから Library Quantification Kits for Illumina (KAPA biosystems)を 説 明 書 にしたがって 使 用 している この 時 の 収 量 は 通 常 開 始 DNA の 2~8% 程 度 である 100 ng の DNA から 開 始 した 場 合 通 常 20 fmol 程 度 の 鋳 型 分 子 に 相 当 す る 鋳 型 が 得 られることになる これは イルミナ HiSeq 2000 なら 20 レーン 分 MiSeq ならば 4 レーン 分 の 配 列 決 定 に 十 分 な 鋳 型 量 である 副 産 物 の 存 在 は 電 気 泳 動 による 鋳 型 DNA 分 子 のサイズ 決 定 も 困 難 にする そこで 鋳 型 そのも のではなくて その qpcr 産 物 を TBE-Urea 系 の 変 性 ポリアクリルアミドゲル 電 気 泳 動 で 分 析 すると 良 い 通 常 300 nt にピークを 有 する 200~500 nt のサイズ 分 布 を 示 す XI. 配 列 決 定 (3 日 目 ) インデックス 付 ペアエンドシーケンスを 行 う 際 には PBAT-PE-Seq をリード 2 用 プライマーミ ックスに PBAT-PE-Idx をインデックス 用 プライマーミックスに それぞれ 最 終 濃 度 0.5 µm になるように 添 加 すること 配 列 決 定 に 必 要 な 鋳 型 量 の 決 定 1. クラスター 形 成 に 必 要 な 鋳 型 量 を 以 下 の 式 とパラメータを 用 いて 計 算 する 装 置 名 HiSeq 2000 HiSeq 2500 High Output モード HiSeq 2500 cbot を 使 う Rapid Run モード 目 標 とする 鋳 型 の 最 終 濃 度 (pm) 10 * HiSeq 2500 cbot を 使 わ ない Rapid モ ード または MiSeq 13
14 目 標 とする 鋳 型 溶 液 の 体 積 (µl) 希 釈 前 の 鋳 型 のモル 濃 度 (pm) 加 える 鋳 型 の 体 積 = x (µl) y *10 pm から 鋳 型 濃 度 の 最 適 化 を 行 うのが 良 いだろう Y y y cbot を 用 いる HiSeq 2000 あるいは HiSeq 2500 High Output Mode 用 の プロトコール(1レーン 分 ) 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (19 x) µl 2 N NaOH 溶 液 1 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う バイサルファイト 変 換 された DNA では 極 端 に 偏 った 塩 基 組 成 のために 蛍 光 シグナルの 補 正 が うまくゆかないので フローセル 中 の1レーンを phix コントロールに 充 てねばならない cbot を 用 いる HiSeq 2500 Rapid Run Mode 用 のプロトコール(1レー ン 分 ) 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (11 x) µl 2 N NaOH 溶 液 0.6 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする 14
15 5. 58 µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 い 用 意 した 70 µl の 8 pm phix コントロール 溶 液 を 加 え 混 合 する HiSeq 2500 の Rapid Run Mode では 蛍 光 シグナル 補 正 のためのコントロールレーンが 無 いので コントロールとなる 鋳 型 (phix コントロール)をサンプルに 混 ぜて 配 列 決 定 せねばならない 7. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う cbot を 用 いない HiSeq 2500 Rapid Run Mode あるいは MiSeq 用 のプロ トコール 1. Hybridization Buffer A を 1.5-ml チューブに 分 注 し 氷 上 に 置 く 2. 2 N の NaOH 溶 液 を 10 N の NaOH 溶 液 を5 倍 希 釈 して 用 意 する 3. 配 列 決 定 用 の 鋳 型 を 以 下 の 組 成 で 混 ぜ 変 性 させる 鋳 型 DNA 溶 液 x µl ddh2o (76 x) µl 2 N NaOH 溶 液 4 µl 4. 室 温 で5 分 間 インキュベーションする µl の 氷 冷 した Hybridization Buffer A を 変 性 させた 鋳 型 に 加 え 混 合 して 氷 上 に 置 く 6. イルミナ 社 のプロトコールに 従 い 用 意 した 120 µl の 8 pm phix コントロール 溶 液 を 加 え 混 合 する HiSeq 2500 の Rapid Run Mode や MiSeq では 蛍 光 シグナル 補 正 のためのコントロールレーン が 無 いので コントロールとなる 鋳 型 (phix コントロール)をサンプルに 混 ぜて 配 列 決 定 せねば ならない 7. イルミナ 社 のプロトコールに 従 いクラスター 形 成 を 行 う 15
16 文 献 Miura, F., Enomoto, Y., Dairiki, R. & Ito, T. (2012) Amplification-free whole genome bisulfite sequencing by post-bisulfite adaptor tagging. Nucleic Acids Res. 40, e136. Kobayashi, H., Sakurai, T., Miura, F., Imai, M., Mochizuki, K., Yanagisawa, E., Sakashita, A., Wakai, T., Suzuki, Y., Ito, T., Matsui, Y. & Kono, T. (2013) High resolution DNA methylome analysis of primordial germ cells identifies gender-specific reprogramming in mice. Genome Res. 23, Shirane, K., Toh, H., Kobayashi, H., Miura, F., Chiba, H., Ito, T., Kono, T. & Sasaki, H. (2013) Mouse oocyte methylomes at base resolution reveal genome-wide accumulation of non-cpg methylation and role of DNA methyltransferases. PLoS Genet. 9, e
2
2 3 4 TTT TCT TAT TGT TTC TCC TAC TGC TTA TCA TAA TGA TTG TCG TAG TGG CTT CCT CAT CGT CTC CCC CAC CGC CTA CCA CAA CGA CTG CCG CAG CGG ATT ACT AAT AGT ATC ACC AAC AGC ATA ACA AAA AGA ATG ACG AAG AGG GTT
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