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1 405 日 本 機 械 学 会 論 文 集 (B 編 ) 78 巻 787 号 (2012-3) ノート No.2011-JBN-0728 乾 式 微 粉 砕 した 杉 材 の 酵 素 糖 変 換 エタノール 変 換 の 研 究 * 梅 澤 俊 策 *1, 高 橋 武 彦 *2 *2, 伊 藤 一 志 小 林 淳 一 *3 *4 *5, 伊 藤 新, 進 藤 昌 A Study on Saccharification and Fermentation of Dry-Pulverized Ligoncellulosic Biomass Shunsaku UMEZAWA *1, Takehiko TAKAHASHI, Kazushi ITO Junichi KOBAYASHI, Arata ITO and Sho SHINDO *1 Akita Prefectural University Graduate School of Systems Science and Technology 84-4 Tsuchiya-Ebinokuchi, Yurihonjo, Akita, Japan Bio-ethanol production from Japanese cedarwood using an enzyme and yeast cells was investigated. Japanese cedarwood was pulverized into powder by a high impact-pulverizing mill called inner power ring mill. The enzymatic saccharification examinations were carried out on solids concentrations of 13.5, 18, 22.5 and 27w/v% using acetic buffer solution of 200ml, a powder pulverized into 20μm in average diameter and an enzyme dosage of 5wt% per solids of powder. Ethanol fermentations with three fermentation states as fermentation without residual solids, fermentation with residual solids and simultaneous saccharification and fermentation (SSF) were carried out by yeast of Saccharomyces cerevisiae on the enzymatic saccharification. As the results, the bio-ethanol yield of SSF was reached a high yield in a short time in this study. Key Words : Bio-Ethanol, Enzymatic Saccharification, Yeast Cells, Japanese Cedarwood, Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) 1. 緒 言 地 球 温 暖 化 防 止 策 として, 植 物 由 来 の 再 生 可 能 な 資 源 を 用 いてエネルギーを 供 給 することができるバイオマス エネルギーが 注 目 を 浴 び (1), 間 伐 材 製 材 廃 材 籾 稲 藁 などの 木 質 草 本 系 のバイオマスからバイオエタノー ルを 製 造 する 技 術 が 研 究 されている. 木 質 系 バイオマスはセルロース,ヘミセルロースおよびリグニンからなる. 木 質 系 バイオマスからバイオエタノールを 製 造 する 際, 木 材 の 構 成 要 素 であるセルロース,ヘミセルロース,リ グニンの 中 で,セルロースやヘミセルロースを 構 成 単 糖 にまで 加 水 分 解 し, 得 られた 糖 を 発 酵 によりエタノール (1) に 変 換 する 必 要 がある.セルロース,ヘミセルロースを 単 糖 に 変 換 する 方 法 として 各 種 加 水 分 解 方 法 が 実 用 化 されているが, 環 境 に 配 慮 した 酵 素 を 用 いる 酵 素 加 水 分 解 ( 酵 素 糖 化 )の 実 用 化 が 求 められている.また, 木 材 の 構 成 要 素 の 一 つであるリグニンは, 酵 素 糖 化 に 対 して 阻 害 因 子 となるためリグニンの 影 響 を 排 除 しながら 木 材 中 のホロセルロースを 糖 変 換 する 必 要 がある. 遠 田 ら (2) は, 高 衝 撃 力 を 付 加 できる 歯 車 型 粉 砕 媒 体 利 用 高 衝 撃 粉 砕 機 を 開 発 し,100 分 粉 砕 で 得 られた 平 均 粒 径 20μm 程 度 で 低 結 晶 化 度 の 杉 材 微 粉 末 を 酵 素 糖 化 し,リグニンの 阻 害 が 無 いことを 明 らかにし,80%を 超 す 糖 化 率 を 得 ている. 発 酵 法 でバイオエタノールを 製 造 する 際 に 従 来 から 採 用 されている Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 酵 母 は, 発 酵 可 能 な 炭 素 源 がグルコース,マンノース,ガラクトースなどの6 炭 糖 のみであり,ヘミセルロース 由 来 * *1 *2 *3 *4 *5 原 稿 受 付 2011 年 9 月 1 日 学 生 員, 秋 田 県 立 大 学 システム 科 学 技 術 研 究 科 ( 秋 田 県 由 利 本 荘 市 土 谷 字 海 老 ノ 口 84-4) 正 員, 秋 田 県 立 大 学 システム 科 学 技 術 学 部 正 員,フェロー, 秋 田 県 立 大 学 秋 田 県 立 大 学 システム 科 学 技 術 学 部 秋 田 県 総 合 食 品 研 究 センター takehiko_takahashi@akita-pu.ac.jp 33

2 406 のキシロースやアラビノースなどの5 炭 糖 はエタノールに 変 換 できない. 進 藤 ら (3) は, 天 然 由 来 の5 炭 糖 発 酵 酵 母 をスクリーニングし,その 特 性 を 生 かした2 段 階 発 酵 法 や, 糖 化 から 発 酵 までの 一 連 の 流 れを 効 率 的 に 行 う 同 時 糖 化 発 酵 に 関 する 研 究 を 行 っている.しかし, 木 質 系 バイオマスを 対 象 とした 糖 化 発 酵 では, 酵 素 糖 化 に 対 す る 生 成 グルコースの 阻 害 や,リグニン 主 体 の 固 体 によるエタノール 発 酵 の 阻 害 が 報 告 されている (4)-(6). 本 研 究 では, 歯 車 型 粉 砕 媒 体 利 用 高 衝 撃 粉 砕 機 を 用 いて 乾 式 微 粉 砕 し 結 晶 化 度 を 低 下 させた 杉 材 微 粉 末 を 用 い て, 酵 素 糖 化 とエタノール 発 酵 の 組 み 合 わせを 検 討 した. 酵 素 糖 化 後 に 糖 化 液 を 分 離 した 場 合 と, 非 分 離 で 糖 化 液 とリグニン 主 体 の 固 体 の 混 合 した 場 合 でのエタノール 発 酵 試 験 を 行 い,さらに 糖 化 と 発 酵 を 同 時 に 行 う 同 時 糖 化 発 酵 試 験 も 実 施 した.その 結 果, 同 時 糖 化 発 酵 試 験 において, 短 い 反 応 時 間 で 高 収 率 のエタノールが 得 られた. 2. 実 験 方 法 2 1 杉 材 微 粉 末 本 研 究 では 杉 材 を 歯 車 型 粉 砕 媒 体 利 用 高 衝 撃 粉 砕 機 で 100 分 粉 砕 し 得 られた 杉 材 微 粉 末 を 用 いて, 各 種 糖 化 発 酵 試 験 を 実 施 した. 本 研 究 で 用 いた 杉 材 微 粉 末 の 粒 度 分 布 を 図 1に, 粉 砕 時 間 に 伴 う 結 晶 化 度 の 変 化 を 図 2に 示 す. 杉 材 微 粉 末 は, 粒 径 45μm 程 度 にピークを 有 したシャープな 分 布 であり,その 平 均 粒 径 は 20μm である. また, 結 晶 化 度 は,100 分 粉 砕 で 20% 以 下 に 低 下 している. 2 2 酵 素 糖 化 試 験 酵 素 糖 化 試 験 の 流 れを 図 3に, 試 験 条 件 を 表 1に 示 す. 酵 素 糖 化 試 験 は,まず,500ml フラスコに 酢 酸 緩 衝 液 180ml を 入 れ,さらに 緩 衝 液 200ml において 13.5,18,22.5,27% 濃 度 となる 杉 材 微 粉 末 を 混 合 した.その 後,フ ラスコを 121,5 分 間 の 加 圧 滅 菌 処 理 を 施 した. 次 に, 酢 酸 緩 衝 液 20ml にセルラーゼ,ヘミセルラーゼを 杉 材 微 粉 末 に 対 して 各 々5%となる 量 を 加 えたものを 準 備 した.そして, 杉 材 微 粉 末 を 混 合 した 酢 酸 緩 衝 液 のフラスコ にセルラーゼとヘミセルラーゼを 加 えた 酢 酸 緩 衝 液 を 混 合 して 懸 濁 液 とした 後, 恒 温 振 盪 槽 で 温 度 50, 撹 拌 回 転 数 80rpm, 糖 化 時 間 48 時 間 として 酵 素 糖 化 試 験 を 実 施 した. 酵 素 糖 化 終 了 後 に, 糖 化 液 の 懸 濁 液 と,10,000rpm, 20 分 間 の 遠 心 分 離 で 固 液 分 離 し 糖 化 液 としたものの 2 種 類 を 準 備 しエタノール 発 酵 試 験 に 用 いた. Fig.1 Particle size distribution of powder during pulverizing. 500ml Erlenmeyer flask Acetate buffer 180ml Powder concentration 13.5~27w/v% sterilize min Enzyme into slurry, Acetate buffer 20ml 50 80rpm 48hours later Collected residual solids Separated Solid- Solid- Fig.3 Saccharification examination procedure. Fig.2 Crystallinity index of powder during pulverization. Table 1 Saccharification condition. Temperature 50 48hours Saccharification Powder concentration 13.5~ 27w/v% Acetate buffer 200ml ( ph5.0, 0.02M ) Cellulase 5w/w% Hemicellulase 5w/w% Revolution 80rpm 34

3 エタノール 発 酵 試 験 酵 母 培 養 からエタノール 発 酵 試 験 の 流 れを 図 4に,その 際 の 試 験 条 件 を 表 2に 示 す.エタノール 発 酵 試 験 に 用 いる 酵 母 は,S. cerevisiae とした.また, 酵 母 の 種 母 培 養 は 200mlYPD 液 体 培 地 (1% 酵 母 エキス,2%ポリペプト ン,2%グルコース)に 酵 母 を 無 菌 的 に 一 白 金 耳 植 菌 し, 温 度 28, 撹 拌 回 転 数 120rpm で 24 時 間 振 盪 培 養 した. エタノール 発 酵 試 験 は, 固 液 分 離 した 糖 化 液 に 酵 母 を 混 合 して 行 う 固 液 分 離 発 酵 と, 酵 素 糖 化 試 験 で 得 られた 糖 化 液 とリグニン 主 体 の 固 体 の 懸 濁 液 に 酵 母 を 混 合 して 行 う 非 分 離 発 酵 により 実 施 した.その 際, 酵 母 は cells/ml を 添 加 し, 温 度 28, 撹 拌 回 転 数 120rpm にて 最 大 150 時 間 まで 発 酵 を 行 った. 2 4 同 時 糖 化 発 酵 試 験 酵 母 培 養 から 酵 素 糖 化 とエタノール 発 酵 を 同 時 に 行 う 同 時 糖 化 発 酵 試 験 の 流 れを 図 4に,その 試 験 条 件 を 表 3 に 示 す.まず,500ml フラスコに 酢 酸 緩 衝 液 180ml および, 緩 衝 液 200ml に 対 して 13.5% 濃 度 となる 杉 材 微 粉 末 を 混 合 し,121 で 加 圧 滅 菌 処 理 を 15 分 間 施 したものを 準 備 する. 次 に, 酢 酸 緩 衝 液 20ml にセルラーゼ,ヘミ セルラーゼを 杉 材 微 粉 末 に 対 して 各 々5%もしくは 10%となる 量 を 加 えたものを 準 備 する.そして, 杉 材 微 粉 末 を 混 合 した 酢 酸 緩 衝 液 とエタノール 発 酵 試 験 と 同 じ 方 法 で 培 養 した.S. cerevisiae 酵 母 ( cells/ml)を 混 合 し たのち 恒 温 振 盪 槽 に 設 置 し, 温 度 28, 攪 拌 回 転 数 120rpm にて 72 時 間 の 同 時 糖 化 発 酵 を 実 施 した. Table 2 Fermentation condition. Temperature ml Erlenmeyer flask Max 150hours YPD Liquid media Fermentation Saccharification (1% Yeast extract, 2% polypeptone, 2% Glucose ) Yeast: S.cerevisiae sterilize min Revolution 120rpm Yeast: S. cerevisiae Table 3 Saccharification and fermentation condition rpm 24hours Collected yeast cells Temperature 28 72hours Saccharification Powder concentration 13.5w/v% Acetate buffer (200ml) Separated Solid- and fermentation Acetate buffer 200ml ( ph5.0, Wood flour 13.5w/v% Enzyme 5, 10wt% 0.02M ) Yeast Cellulase 5, 10w/w% Hemicellulase 5, 10w/w% Collected max 150 hours later Collected 72 hours later Revolution Yeast: S.cerevisiae 120rpm Fig.4 Yeast cultivation process and fermentation examination procedure. 3. 実 験 結 果 及 び 考 察 3 1 固 液 分 離 発 酵 試 験 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 を 変 えて 酵 素 糖 化 した 際 のグルコース 濃 度,それに 続 く 固 液 分 離 発 酵 におけるグルコース 濃 度 およびエタノール 濃 度 の 変 化 を 図 5に 示 す. 酵 素 糖 化 48 時 間 後 におけるグルコース 濃 度 は, 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 が 13.5%で 44.1(g/l),18%で 54.4(g/l),22.5%で 70.1(g/l),27%で 80.4(g/l)となり, 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 の 増 加 ととも に 徐 々に 増 加 している.しかし, 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 に 比 例 したグルコース 濃 度 は 得 られておらず, 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 が 増 加 することで 糖 化 率 は 減 少 傾 向 になることが 確 認 できる.これは, 杉 材 微 粉 末 が 増 加 することで 懸 濁 液 の 流 動 性 が 悪 くなり, 酵 素 の 移 動 が 妨 げられたためと 考 える.その 後,エタノール 発 酵 によりグルコースが 減 少 し, 酵 素 糖 化 により 生 成 したグルコースの 量 に 応 じてエタノール 濃 度 が 増 加 することが 分 かる. 3 2 非 分 離 発 酵 試 験 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 を 変 えて 酵 素 糖 化 した 際 のグルコース 濃 度,それに 続 く 非 分 離 発 酵 におけるグルコース 濃 度 およびエタノール 濃 度 の 変 化 を 図 6に 示 す. 酵 素 糖 化 は, 固 液 分 離 発 酵 における 酵 素 糖 化 と 同 じ 工 程 であり,48 時 間 後 におけるグルコース 濃 度 は, 固 液 分 離 発 酵 における 酵 素 糖 化 と 同 様 に 増 加 している.しかし,その 後 のエ タノール 発 酵 では, 試 験 を 行 った 全 ての 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 において 固 液 分 離 発 酵 のエタノール 濃 度 より 高 い 値 が 35

4 408 Fig.5 Results of saccharificaton and fermentation without Fig.6 Results of saccharificaton and fermentation with Fig.7 Relations of theory ethanol value and yield with Fig.8 Relation of avicel saccharification and density of sugar. 得 られている.6 炭 糖 からエタノールに 変 換 する 際 の 分 子 式 から 算 出 したエタノール 収 量 の 理 論 値 1) を(1) 式 に 示 す.それぞれ 分 子 量 は,C 6 H 12 O 6 が ,C 2 H 5 OH が 46.07, CO 2 が となる. C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 (1) ここで,6 炭 糖 を 100g とすると,エタノール 発 酵 によりエタノール 51.14g, 二 酸 化 炭 素 48.86g が 生 成 される. この 理 論 値 より 与 えられる 理 論 収 率 と 固 液 分 離 発 酵 で 得 られたエタノール 収 率 と 非 分 離 発 酵 で 得 られたエタノー ル 収 率 の 比 較 を 図 7に 示 す. 固 液 分 離 発 酵 では 理 論 収 率 に 対 して 杉 材 粉 末 濃 度 13.5%で 59%,18%で 67%,22.5% で60%,27%で58%のエタノールを 得 ることができた. 一 方, 非 分 離 発 酵 では 理 論 収 率 に 対 して 杉 材 粉 末 濃 度 13.5% で 92%,18%で 81%,22.5%で 77%,27%で 77%のエタノールを 得 ることができた. 特 に 杉 材 微 粉 末 の 濃 度 13.5% では, 糖 化 から 発 酵 完 了 までの 時 間 が 96 時 間 であり,その 収 率 も 非 常 に 良 く 92%となり, 固 液 分 離 発 酵 に 対 し て 34 ポイントの 増 加 となった.この 要 因 を 検 討 するためリグニンを 含 まずセルロースのみで 構 成 されるアビセル の 酵 素 糖 化 を, 初 期 グルコース 濃 度 を 変 更 して 実 施 した.その 結 果 を 図 8に 示 す. 横 軸 に 示 す 初 期 グルコースが 高 くなると,アビセルの 酵 素 糖 化 で 生 じるグルコースが 減 少 することが 確 認 でき, 酵 素 は 糖 濃 度 が 高 くなると 活 性 が 低 くなると 考 えられる.したがって, 非 分 離 発 酵 におけるエタノール 収 率 が 固 液 分 離 発 酵 に 比 べて 増 加 した のは,グルコースがエタノールに 変 換 されることで 糖 濃 度 が 低 下 し,28 の 温 度 下 でも 酵 素 の 活 性 が 高 くなりリ グニン 主 体 の 固 体 中 に 含 まれる 未 糖 化 セルロースの 糖 化 が 進 み, 最 終 的 なエタノール 収 率 が 増 加 したものと 考 え る. 一 方 で, 非 分 離 発 酵 では 酵 母 を 加 えてから 発 酵 を 開 始 するまでに 時 間 を 要 している.これは 糖 液 中 にリグニ ン 主 体 の 固 体 が 含 まれることで, 糖 液 の 流 動 性 が 低 下 し 阻 害 につながったと 考 える. 3 3 同 時 糖 化 発 酵 試 験 酵 素 糖 化 とエタノール 発 酵 を 同 時 に 行 う 同 時 糖 化 発 酵 試 験 における,グルコース 濃 度 とエタノール 濃 度 の 変 化 を 図 9に 示 す.なお, 杉 材 微 粉 末 濃 度 は 13.5% 濃 度 であり, 酵 素 5%は 杉 材 微 粉 末 量 に 対 してセルラーゼ 5%とヘ 36

5 409 ミセルラーゼ 5%を 添 加 した 場 合, 酵 素 10%はセルラーゼ 10%とヘミセルラーゼ 10%を 添 加 した 場 合 である.エ タノールの 最 終 収 率 は, 非 分 離 発 酵 における 粉 末 濃 度 13.5%と 同 等 であり,エタノール 発 酵 の 立 ち 上 がりにおけ る 阻 害 も 認 められず,さらに 同 時 糖 化 発 酵 は 24 時 間 以 内 で 完 了 している.これは, 非 分 離 発 酵 における 酵 素 糖 化 から 発 酵 完 了 までの 96 時 間 の 1/4 である.したがって, 酵 素 と 酵 母 を 同 時 に 加 えることで, 酵 素 糖 化 で 生 成 され た 糖 がただちに 発 酵 されてエタノールとなることで 反 応 時 間 の 短 縮 につながり,なおかつ 糖 濃 度 が 高 くならない ため 酵 素 の 活 性 が 保 たれ, 高 いエタノール 収 率 が 得 られたと 考 える. Fig.9 Results of production of glucose and bioethanol by simultaneous saccharification and fermentation. 4. 結 言 本 研 究 では, 歯 車 型 粉 砕 媒 体 利 用 高 衝 撃 粉 砕 機 で 乾 式 微 粉 砕 により 結 晶 化 度 を 低 下 させた 木 材 微 粉 末 を 用 いて, 酵 素 糖 化 と 酵 母 によるエタノール 発 酵 を 検 討 した. 以 下 に 得 られた 知 見 をまとめる. (1) 杉 材 微 粉 末 濃 度 13.5~27%において 非 分 離 発 酵 が 可 能 であり, 杉 材 微 粉 末 濃 度 13.5%では 固 液 分 離 発 酵 に 比 べエタノール 収 率 が 34 ポイント 向 上 した.しかし,リグニン 主 体 の 固 体 を 含 んでいるため 流 動 性 が 低 下 し, 発 酵 の 立 ち 上 がりに 時 間 を 要 した. (2) 非 分 離 発 酵 では,エタノール 発 酵 により 糖 濃 度 が 低 下 することで,28 の 温 度 下 でも 酵 素 の 活 性 が 高 くな りリグニン 主 体 の 固 体 中 に 含 まれる 未 糖 化 セルロースの 糖 化 が 進 み, 最 終 的 なエタノール 収 率 に 寄 与 する. (3) 同 時 糖 化 発 酵 試 験 では, 非 分 離 発 酵 と 同 等 のエタノール 収 率 が 得 られるとともに, 発 酵 阻 害 が 現 れず 非 分 離 発 酵 の 1/4 の 24 時 間 で 発 酵 が 完 了 した. 謝 辞 本 研 究 の 一 部 は, 平 成 21,22 年 度 の NEDO の 委 託 研 究 新 エネルギー 技 術 研 究 開 発 / 新 エネルギーベンチャー 技 術 革 新 事 業 (バイオマス) の 成 果 である.ここに 記 して, 謝 意 を 表 する. 文 献 (1) 社 団 法 人 アルコール 協 会 編, 図 解 バイオエタノール 製 造 技 術,(2007), 工 業 調 査 会 (2) 遠 田 幸 生, 小 林 淳 一, 高 橋 武 彦, 伊 藤 一 志, 伊 藤 新, インナーパワーリング 粉 砕 機 を 利 用 した 杉 粉 末 の 高 濃 度 糖 液 への 糖 変 換 技 術 に 関 する 研 究, 第 4 回 バイオマス 科 学 会 議 発 表 論 文 集, (2009), pp (3) Sho Shindo and Tadanori Tachibana, Production of Bioethanol from Spent Grain A By-Product of Beer Production, Technical quarterly - Master Brewers Association of the Americas, Vol.43, No.3 (2006), pp (4) Zhilong Wang, Jian-He Xu, Hao Feng, Hanshi Qi, Fractal kinetic analysis of polymers/nonionic surfactants to eliminate lignin inhibition in enzymatic saccharification of cellulose, Bioresour Technol, Vol.102, Issue 3 (2011), pp (5) Zhizhuang Xiao, Xiao Zhang, Daivd J.Gregg, and John N. Saddler, Effects of sugar inhibition on Cellulases and β-glucosidase During Enzymatic Hydrolysis of Softwood Substrates, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.115, No.1-3 (2004), pp (6) H.Hidaka, T.Takizawa, H.Fujikawa, T.Ohneda and T. Fukuzumi, A study on the inhibition of cellulolytic activities by lignin, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol.9, No.4 (1984), p

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