548BGeneSpring12.5

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1 GeneSpring12.5 ベーシックトレーニング資料 2013/01/16 GeneSpring ベーシックトレーニング向け日本語資料

2 内容 はじめに...5 GeneSpringについての各種情報...5 用語解説...6 GeneSpring12 で解析できるマイクロアレイデータ...7 インターフェイスの説明...8 データの準備 シグナルデータの準備 テクノロジーの作成 テクノロジーのダウンロード テクノロジーの更新 エクスペリメントの作成 Agilent Affymetrix Illumina ノーマライズとベースラインオプション ノーマライズの影響 ベースラインオプションの影響 Baseline to median of Control samplesの設定方法 基本的なグラフ 参考資料 Raw Signal valueとnormalized Signal value グループの設定 (Experiment Grouping) パラメーターをファイルからインポートする ( 必要なときのみ ) ブラウザでの表示順を変更する ( 必要なときのみ ) Quality control on sample のPCAや 2way 実験の表示順を変更 ( 必要なときのみ ) インタープリテーションの作成 (Create Interpretation) クオリティコントロール サンプルの品質管理 (Quality control on samples) D PCA Scores Correlation plot

3 Hybridization Controls サンプルの除外 発現量によるフィルタリング (Filter Probesets by Expression) フラグによるフィルタリング (Filter Probesets by Flags) シグナルデータのフィルタリング (Filter Probesets on Data files) 再現性によるフィルタリング (Filter Probesets by Error) 解析 1 遺伝子リストの絞込み 統計検定 (Statistical Analysis) 実験デザインと利用する検定の対応 t-testによる検定 統計検定 (t-test) の操作手順 ANOVAによる検定 統計検定 (ANOVA) の操作手順 Fold change(fold change) 解析 2 クラスタリングなど クラスタリング (Clustering) k-means Hierarchical Self-Organizing Map(SOM) 発現パターンの似ているエンティティの検索 (Find Similar Entities) 数値パラメーターと相関するエンティティの検索 (Filter on Parameters) Principal Component Analysis( 主成分分析 ) 結果の解釈 GO 解析 (GO Analysis) GO Analysisから ほしい遺伝子だけをピックアップする GSEA 解析 (GSEA) データの準備 GSEAの実行 パスウェイ解析 データの準備

4 Single Experiment Analysis ゲノムブラウザ データの準備 使い方 参考資料 便利な機能 Translate 機能 Export as Image Export List セレクションモードとズームモードの切り替え アノテーションの閲覧 アノテーションからのエンティティの検索 グラフの見方 GX7 とGX9 以降の検定の対応 sample T-test( 主に 2color 実験の場合に使用可能 ) Similarity Metrics GeneSpringの保守 管理 プロジェクト単位のエクスポート データのバックアップと復元 GeneSpringのバージョンアップ お問い合わせ

5 はじめに GeneSpring についての各種情報 GeneSpring について情報を収集する場合は下記をご利用ください GeneSpring のヘルプページ GeneSpring の Help メニューから Documentation Index で英文の機能解説があります GeneSpring のサポートページ 最新のインストーラーがダウンロードできます 要ユーザー登録 Agilent 日本の GeneSpringGX ページ 日本語マニュアルやデモデータなどを閲覧できます Agilent の FAQ ページ アジレントテクノロジーが作成している日本語 FAQ ページです Tomy digital biology の FAQ ページ トミーデジタルバイオロジーが作成している日本語 FAQ ページです 5

6 用語解説ここでは GeneSpringGXで使用する用語を解説します プロジェクト (Project) ユーザーがデータを格納するワークスペースです GeneSpringGXを複数人で共有する場合など データを分けることができます 用途の異なるデータは混乱を招くため異なるプロジェクトにしたほうが無難です エクスペリメント (Experiment) エクスペリメントはデータの解析単位になります 比較したいシグナルデータのインポートを行うとエクスペリメントが 1 つできます サンプル (Sample) アレイから得られたシグナルデータです シグナルデータのファイル名がSample 名です ノーマリゼーション (Normalization) アレイ間の誤差を修正し 発現量を比較するための処理です 複数の方法が搭載されています ノーマライズはエクスペリメント単位で決定され変更することはできません パラメーター (Parameter) データを解析する上での条件の名称です ( 例 Timeなど ) コンディション (Condition) 設定されたパラメーター内にある条件です ( 例 1 時間 2 時間 3 時間など ) インタープリテーション (Interpretation) グルーピングと表示方法の設定です ( 例時系列での表示 性別での表示など ) エンティティ (Entity) マイクロアレイで扱われる 1 分子を指します DNAマイクロアレイはほとんどの場合遺伝子を指しますがmiRNAアレイやExonアレイを使った場合はそれぞれの概念に従ってください テクノロジー (Technology) アレイに搭載されているエンティティの機能や公共 DBのIDを含んだアノテーションセットです 解析結果の解釈を得るためには十分なアノテーションが必要になります 6

7 GeneSpring12 で解析できるマイクロアレイデータ GeneSpring12 のGXモジュールでは 下記のプラットフォームについて解析を行うことがで きます 下記以外の対応していないプラットフォームでも テキストファイルがあればカ スタムデータとして登録することができます プラットフォーム GeneSpring 内の表記 備考 Agilent Expression Single Color 遺伝子発現 1 色法 Agilent Expression Two Color 遺伝子発現 2 色法 アジレント Agilent Exon Single Color Exon アレイ 1 色法 Agilent Exon Two Color Exon アレイ 2 色法 Agilent mirna microrna アレイ Affymetrix Association Analysis SNP ジェノタイピング解析 Affymetrix Copy number コピーナンバー解析 アフィメトリクス Affymetrix Exon Expression GeneST/ExonST を使った遺伝子発現解析 Affymetrix Exon Splicing GeneST/ExonST を使ったスプライシング解析 Affymetrix Expression 3 IVT 遺伝子発現 カスタム Generic Single Color カスタムテクノロジー 1 色法 Generic Two Color カスタムテクノロジー 2 色法 Illumina Association Analysis SNP ジェノタイピング解析 イルミナ Illumina Copy Number コピーナンバー解析 Illumina Single Color 遺伝子発現 カスタムデータの取り扱いに関しては AgilentのFAQページ ( ) にあるGenespirng12 カスタムテクノロジーの作成.pdfをご覧ください 7

8 インターフェイスの説明 メニュー群 アイコン群 ワークフロー プロジェクトナビゲーター ブラウザ レジェンド メニュー群 : 各操作を行うためのメニューですアイコン群 : よく使う操作はアイコン群になっていますプロジェクトナビゲーター : 自分の閲覧したいデータを選択しますブラウザ : プロジェクトナビゲーターで選んだデータが表示されますワークフロー : データ解析に関するメニューが並んでいますレジェンド : ブラウザの情報について補足がある場合 情報が表示されます インスペクター機能エクスペリメントやエンティティリストを右クリックし Inspect~ を選択すると 対象のインスペクターが開きます オブジェクトにもよりますが作成日や作成条件 解析結果などの情報が書き込まれています よくわからないデータがあった場合は ダブルクリックするか 右クリックしてください 8

9 プロジェクトを開く Project メニューから Open Project または 選択して開くことができます アイコンですでに作成済みのプロジェクトを エクスペリメントを開くプロジェクトナビゲーターのExperimentsフォルダ以下にあるアイコンをダブルクリックすると既存のエクスペリメントが開き ブラウザにデータが表示され データ解析可能な状態になります プロジェクトにエクスペリメントが 1 つしかない場合 自動的にそのエクスペリメントが開きます ダブルクリックで開く 9

10 エクスペリメントの切り替え エクスペリメントを複数開いている場合は プロジェクトナビゲーターのエクスペリメン ト名かブラウザ上部のタブをクリックで切り替えることが可能です 複数のエクスペリメントを開くと エンティティリストを共有することができます グラフ画面の切り替え 複数のグラフの切り替えはグラフ下部のタブを切り替えて行います 必要のないタブは右クリックからCloseを選択して閉じることも可能です Window の並べ替え WindowsメニューからTile>Bothと選ぶと 複数のグラフを一画面に並べて表示することができます 一度に閲覧できる情報量が多くなり 選択操作などが連動します 10

11 データの準備 シグナルデータとテクノロジーの作成について紹介します シグナルデータの準備 Agilent: Feature Extraction のアウトプットテキストファイル 1 色法 2 色法どちらも可能 Affymetrix:CEL ファイル CHP ファイル テキストファイル Affy のデータは日本語が含まれるフォルダに保存しないでください Illumina:GenomeStudio で bgx manifest files を使って作成されたテキストファイル Illumina のテキストデータ例 ( エクセルで表示しています ) Array Content が GeneSpring の Technology と同名である必要があります 実際使用するカラムは ProbeID Average Signal Detection p-value です 自動認識で取り込めない場合は カスタムテクノロジーで対応してください その他 : GPR 形式 行列形式のテキストファイルなど その他のデータは 別資料カスタムテクノロジーの作成方法をご参照ください 11

12 テクノロジーの作成テクノロジー ( アレイごとのデータフォーマットや遺伝子等のアノテーション ) は解析結果を解釈するために必要な情報です Affymetrix Agilent Illuminaの市販されているアレイのテクノロジーはGeneSpring GXを使い インターネット経由でダウンロードすることができます それ以外の製品をお使いの方は カスタムテクノロジーを作成する必要があります テクノロジーのダウンロード 1. Annotations メニューの Create technology から From Agilent server を選択する 2. 新しく開いた Window で お使いのアレイ名にチェックを入れて Update ボタンをクリック 3. ダウンロード容量が表示されるので HDD の空き容量を確認して 了解をクリック 4. ダウンロードが成功すると終了します ステップ 2 でダウンロードするテクノロジーの一覧が表示されない場合は インターネット接続が適切ではない場合があります 下記を確認してください Toolsメニュー/options/Miscellaneous/Network settingsからproxyの設定を見直す セキュリティソフトを停止して試す 所属の機関で下記のURLにアクセスできるかを管理者に確認する テクノロジーの更新すでにGeneSpringにダウンロードしてあるテクノロジーの更新版がリリースされると GeneSpringの起動時に更新を促すメッセージが表示されます ダウンロードと同じ手順で更新することができます テクノロジーを更新すると 遺伝子の情報等が以前と変わる場合があるのでご注意ください 12

13 エクスペリメントの作成 解析したいシグナルデータセットをインポートすると エクスペリメントが 1 つ作成され ます アレイプラットフォームよりって少々項目が異なりますが エクスペリメント作成時にはアレイ間のノーマライズやベースライン補正などが行われます Agilent 1. Project メニューから New project をクリックし Project 名を入力します すでに Project を作成してある場合は Project メニューから New experiment をクリック 2. Create new experiment を選択 すでに作成済みのエクスペリメントを開くには Open existing experiment を選択 3. 解析条件を入力する Single color か Two color を選択 Data Import Wizard を選択 4. Choose Files ボタンからテキストファイルを指定して Next 13

14 5. Flag の設定を行う ( デフォルト推奨 ) 6. ノーマライズの設定を行い Next をクリック Percentile Shift で Percentile target75 を推奨 7. ベースライン補正の設定を行い Finish ボタンをクリック ベースライン補正については # ベースラインオプションの影響を参照して下さい 8. 以上でエクスペリメント作成が完了します 14

15 Affymetrix Affymetrix のデータは CEL CHP テキストファイルをインポート可能です CEL ファイルをインポートする場合 CEL ファイルはパスに日本語を含まない場所に保存してください 1. Project メニューから New project をクリックし Project 名を入力します すでに Project を作成してある場合は Project メニューから New experiment をクリック 2. Create new experiment を選択 すでに作成済みのエクスペリメントを開くには Open existing experiment を選択 3. 解析条件を入力する Data Import wizard を選択 Analysis type:hg-u133 などの 3 IVTはExpression GeneST/ExonSTはExon Experiment type:3 IVTはAffymetrixExpression GeneST/ExonSTの遺伝子レベル解析はExon expression GeneST/ExonSTのExonレベル解析はExon splicingを選択 4. Choose FilesボタンからCELファイルを指定してNext 15

16 5. Attribute ファイルがある場合は指定する 無い場合はそのまま Next 6. ノーマライズとベースライン補正を選択して Finish ベースライン補正については # ベースラインオプションの影響を参照して下さい ベーシックトレーニングでは MAS5 を利用します 7. 以上でエクスペリメント作成が完了します 16

17 CHP ファイルをインポートする場合 CHP ファイルはパスに日本語を含まない場所に保存してください 1. Project メニューから New project をクリックし Project 名を入力します すでに Project を作成してある場合は Project メニューから New experiment をクリック 2. Create new experiment を選択 すでに作成済みのエクスペリメントを開くには Open existing experiment を選択 3. 解析条件を入力する Data Import wizard を選択 Analysis type:hg-u133 などの 3 IVT は Expression GeneST/ExonST は Exon Experiment type:3 IVT は Affymetrix Expression GeneST/ExonST の遺伝子レベル解析は Exon expression 4. Choose Files ボタンから CHP ファイルを指定して Next 17

18 5. Attribute ファイルがある場合は指定する 無い場合はそのまま Next 6. ノーマライズの設定を行い Next をクリック 7. ベースライン補正を選択して Finish ベースライン補正については # ベースラインオプションの影響を参照して下さい 8. 以上でエクスペリメント作成が完了します 18

19 テキストファイルをインポートする場合 1. Project メニューから New project をクリックし Project 名を入力します すでに Project を作成してある場合は Project メニューから New experiment をクリック 2. Create new experiment を選択 すでに作成済みのエクスペリメントを開くには Open existing experiment を選択 3. 解析条件を入力する Data Import wizard を選択 Analysis type:hg-u133 などの 3 IVT は Expression Experiment type:3 IVT は Affymetrix Expression 4. Choose Files ボタンからテキストファイルを指定して Next 19

20 5. インポートする Gene Chip のテクノロジーを選択する Expression console 以外のテキストファイルの場合は Choose template で Custom を選んでシグナルデータや Flag 情報を指定してください 6. Attribute ファイルがある場合は指定する 無い場合はそのまま Next 7. ノーマライズの設定を行い Next をクリック 8. ベースライン補正を選択して Finish ベースライン補正については # ベースラインオプションの影響を参照して下さい 9. 以上でエクスペリメント作成が完了します 20

21 Illumina 1. Project メニューから New project をクリックし Project 名を入力します すでに Project を作成してある場合は Project メニューから New experiment をクリック 2. Create new experiment を選択 すでに作成済みのエクスペリメントを開くには Open existing experiment を選択 3. 解析条件を入力する Data Import wizard を選択 4. Choose Files ボタンからテキストファイルを指定して Next 5. Detection p-value を Flag に変換する設定を行う 21

22 6. ノーマライズの設定を行い Next をクリック 7. ベースライン補正を選択して Finish ベースライン補正については # ベースラインオプションの影響を参照して下さい 8. 以上でエクスペリメント作成が完了します 22

23 ノーマライズとベースラインオプション GeneSpringには異なるアレイ間の誤差を補正するノーマライズと ノーマライズ後のデータをパターン化して視覚的に見やすくするためのベースラインオプションがあります ここではそれぞれの影響について紹介します AffymetrixのCELファイルをインポートする場合はSummarizationの際にノーマライズが行われます ノーマライズの影響 ノーマライズなし 実験誤差と考えられるばらつき 75% 50% 25% Percentile shift 75% 各サンプルの 75% を 0 に補正 Quantile 各サンプルの全域を補正 GeneSpringは上記の様なグローバル補正のほかに 特定の遺伝子を使用して補正する Normalize to Control genesや サンプル毎に一定の数値で補正するNormalize to external value があります これらは事前に補正するための情報を必要としますが mrnaの総量が大きく変わるサンプルや 網羅的ではない ある機能に特化した遺伝子のみを集めたアレイ等を利用する場合に有効です 23

24 ベースラインオプションの影響 Percentile shift 75% でノーマライズした後の 各ベースラインオプションの影響について紹介します ベースラインオプションは条件が多い場合にデータを単純なパターンにして解析を行うことができ クラスタリングの際などに有効です ベースライン補正なし発現量の情報は保持されているが 視覚的にパターンを見つけにくい Baseline to median of all samples 発現量の情報は失われるが サンプル間の発現比は保持される パターンを見つけやすい Baseline to median of control samples Control sample の発現量の情報は失われるが control sample からの比になりパターンを見つけやすい Control sample 24

25 Baseline to median of Control samplesの設定方法ベースラインオプションでコントロールサンプルを設定する際の操作方法を紹介します Baseline to median of Control samplesを使いたい場合は エクスペリメント作成の際に下記の操作を行ってください 1. Baseline to median of control samplesにチェックを入れる 2. 補正したいサンプルをドラッグしてハイライトしてから Assign value をクリック ドラッグ 3. コントロールに指定するサンプルを右側のウィンドウに移動して OK をクリック 4. 以上でコントロールサンプルが指定されます 2 群のデータで 2 種類のコントロールがある場合は 2-3 の操作を繰り返してください 25

26 基本的なグラフ ここでは頻繁に使用する 4 つのグラフについて紹介します 巻末の参考資料にほかのグラ フの説明をのせてあります Box Whisker Plot Box Whisker Plotは複数サンプルの分布を 1 画面で閲覧することができます 中央値の揃い方やデータの対称性などをみることで ノーマライズの妥当性を判断することができます 青い四角の中央の線が中央値 上端が 75% 値 下端 25% 値になります BoxWhiskerPlotの形が大きく異なる場合は ばらつきの原因を検討してください 右クリックメニューのpropertyから Columnタブで表示するサンプルを選択できます Normalizeを評価する場合は Baseline optionを使用せずにexperimentを作ります Scatter plot 横軸と縦軸にそれぞれ任意のコンディションを設定すると 2 つの条件の再現性や発現量の違いを見ることができます 数値はすべてlog2 のNormalize 値の表示になります ViewメニューからPlot Log10/Linear valueで log10 やLinearのグラフを描画できます 2 色法の場合はアイコン右のプルダウンメニューからCy3/Cy5 plotを選択できます Plotされた点をダブルクリックするとアノテーションを閲覧 画面をドラッグするとエンティティを選択 Shift+ドラッグでフリーハンドで選択 選択したエンティティはエンティティリストで保存 右クリックメニューからSave Entitiesで 2 倍以上 2 倍以下のEntitiesを保存 26

27 Profile Plot Profile Plotは縦軸にNormalized Intensity 横軸にコンディションが設定され エンティティごとに折線グラフが描かれます Profile Plotは複数条件の発現量変化を表示することができます GX11.5 以降でnumeric parameterを作成すると パラメータをスケールに合わせて表示できるようになりました 後述のExperiment grouping 機能でnumeric parameterを設定する必要があります 線をダブルクリックするとアノテーションを閲覧 右クリックメニューから Properties>VisualizationでColor Byを選択することで 任意のコンディションの発現量で色を変えられます Venn diagram Venn Diagramは最大 4 つのエンティティリストのAND OR NOTを表示することでリストの比較をすることができます また 図を表示した後でもドラッグ & ドロップでエンティティリストを変更することができます 興味のあるエリアをクリックしてハイライトしてから ( ハイライトすると黄色い枠が表示されます ) 左上のアイコン (Fig 赤枠 ) をクリックすると ハイライトしたエリアのエンティティリストを保存できます Venn 図からエンティティリストを作成する場合 必ずこのアイコンから保存してください 右クリックメニューのpropertiesから VisualizationタブからSelect Entity listsを選択することで 比較するエンティティリストの数を変更可能 をクリックすると重なり具合を考慮した図になります 27

28 参考資料 Raw Signal valueとnormalized Signal value GeneSpringにデータをインポートすると Raw Signal valueとnormalized Signal value の 2 つの数値データが得られます 大まかに言って 補正前の値がRaw Signal value で補正後の値が Normalized Signal value です アレイプラットフォームによる違いを下記にまとめました Agilent 1color の場合 (Illumina や Generic Single color を含む ) Raw Signal value: ノーマライズとベースライン補正前のシグナル値 整数 Normalized Signal value : ノーマライズとベースライン補正後のシグナル値 底 2 の対数 Agilent 2color の場合 Raw Signal value:cy3 と Cy5 のシグナル値 整数 Normalized Signal value :Cy3/Cy5 の比 (Cy5/Cy3 に変更可 ) 底 2 の対数 Generic 2color の場合 Raw Signal value:cy3 と Cy5 のシグナル値 整数 Normalized Signal value : ノーマライズした Cy3/Cy5 の比 (Cy5/Cy3 に変更可 ) 底 2 の対数 AffymetrixのCELファイルの場合 Raw Signal value:mas5 やRMA 等のSummarization 後のシグナル値 整数 Normalized Signal value : ベースライン補正後のシグナル値 底 2 の対数 CHPやテキストをインポートした場合はAgilent 1colorの場合と同等です 28

29 グループの設定 (Experiment Grouping) インポートが終わったサンプルに実験条件を入力します 同じ処理群のサンプルは同じパラメーターを入力しておくと インタープリテーションを作成する際に平均することができます 1. ワークフローのExperiment setupからexperiment Groupingをクリック 2. Add Parameterをクリック 3. Parameter name と Parameter Values を入力 3-1 サンプル選択 3-3 値を入力 3-2 Assign value 選択 Parameter name: 任意の名称 (Time や Disease type 等 ) Parameter value: 実験条件の名称 Parameter type:normal, Disease などのカテゴリカルな値は Non-numeric で設定します 時系列等のデータは Numeric に設定し 数値のみを入力します 4. 必要なパラメーターの入力が全て終わったら OK ボタンで終了します もし変更が必要な場合は パラメーターを選択してから Edit parameter ボタンで編集してください 29

30 パラメーターをファイルからインポートする ( 必要なときのみ ) サンプル数やコンディションが膨大な場合 ファイルからパラメーターを取り込むことができます サンプルとコンディションの対応表をタブ区切りのテキスト (.txt) で作っておくと ウィンドウ左上のアイコン Load experiment parameter from file から取り込むことができます 例 : 下記のように情報をエクセル等で作成し タブ区切りテキストで保存する Import parameter from file アイコンから上記のテキストファイルを指定する 30

31 ブラウザでの表示順を変更する ( 必要なときのみ ) パラメーターのブラウザ上の表示順を変更したい場合は 並べ替えたいパラメーターを選択し Re-order parameter valuesをクリックしてください ポップアップしたウィンドウで表示する順番を変更することができます 上から順にブラウザでは左から並びます Quality control on sample のPCAや 2way 実験の表示順を変更 ( 必要なときのみ ) 複数のパラメーターがある場合 Quality control on sample のPCAの表示や 2way 実験での表示はExperiment Groupingでの左右の順番に依存します 左側にあるパラメーターから利用していくので Move parameter leftまたはrightで利用したいパラメーターを左に寄せておくと使いやすくなります 31

32 インタープリテーションの作成 (Create Interpretation) 先ほど作成した Experiment Grouping の設定を使用し インタープリテーションを作成します これによりこの後の解析の比較解析を行うグループが決まります 1. ワークフローの Experiment setup から Create Interpretation をクリック 2. インタープリテーションを作成したいパラメーターにチェックして Next をクリック 3. Numerical か Categorical を設定する Numerical:Profile plot( 線グラフ ) の線をつないで表示 Categorical:Profile plot( 線グラフ ) の線をつなげない 4. 作成されるコンディションを確認 解析したくないコンディションがある場合 チェックを外す もし除外したい条件があれば チェックをはずす Averaged: ブラウザ上の表示の際に平均する Non-Averaged: 平均しない Both: 上記の両方を作る Use measurements flagged のチェックをはずすと任意の Flag のエンティティを除去できますが 欠損値が出現するため検定やクラスタリングできないエンティティが出てきます 32

33 5. 作成されるインタープリテーションの名前を確認してFinishをクリック 6. Interpretationsフォルダの下にインタープリテーションが作成される 平均したインタープリテーション平均してないインタープリテーション 例 1:Numerical で 4 回繰り返した実験を平均した場合の表示 例 2:Numerical で 4 回繰り返した実験を平均しない場合 (Non-averaged) の表示 33

34 クオリティコントロール サンプルの品質管理 (Quality control on samples) ワークフローの Quality control から Quality control on samples をクリックします 3D PCA Scores ノーマライズする前の値での PCA の結果を表示です 各サンプルの点がコンディション別に 分かれるかどうかを確認します X Y Z の 3 軸があり X 軸で分かれたサンプルの要因が一 番影響が大きくなります Ctrl キーを押しながらドラッグすると角度を変えることができ Shift キーを押しながらドラッグすると 拡大縮小をすることができます ノーマライズ後 の値で PCA をする場合は Analysis にある Principal Component Analysis を使用します Correlation plot それぞれの Sample 間の相関係数をグラフで表示しています 相関係数が高くなるほど赤く 表示されます レプリケイト間の相関が高いか コンディション別で相関に変化があるかなどをチェックしてください 相関係数は絶対的な指標ではなく 他のサンプルと比べる場合などの相対的な指標として使用してください Color rangeは自動的に設定されますが rangeを任意に設定したい場合はcorrelation plot 上で右クリックするとpropertyが選択できるので Visualizationタブから設定してください 34

35 Hybridization Controls アレイを作成した各メーカーが使用するコントロールプローブの値を表示します それぞれのサンプルが同じようなパターンを示していれば 均一な実験をしていると考えられます 使用するアレイのメーカーにより表示される情報が異なります Agilent の場合 Affymetrix の場合 サンプルの除外今までの情報を基に除外したいsampleがある場合は グラフ上で該当するサンプルを選択してからAdd/Remove Samplesで除外すると 指定したサンプルが除外されたExperimentが再構築されます 元に戻したい場合もAdd/Remove Samplesで元に戻せます 注意 : ある程度解析を進めてからこの操作を行うと Experimentを再構築の際に発現量も再計算されるために再構築前のデータと異なる値になる場合があります 35

36 発現量によるフィルタリング (Filter Probesets by Expression) 発現量の低いエンティティは再現性が低いため ある程度除去します 1. ワークフローのQuality controlからfilter probe sets by Expressionをクリック 2. フィルターをかけるエンティティリストとインタープリテーションを選択します 3. フィルターをかける範囲を設定して Next Raw Data:Normalize 前の値 Raw 値を用います Normalized Data:Normalized 値を用います Filter by value: 数値で範囲を設定 Filter by Percentile: パーセンタイルで範囲を設定 Upper cutoff: 最大値を設定 Lower cutoff: 最小値を設定 Retain entities in which: 指定した範囲で抽出する際の条件を設定します 上段 : インタープリテーションで定義した各コンディションから通過する % を設定下段 : すべてのサンプルから通過させる数を選ぶ 値を変更した後は 必ず Enter キーを押して設定を反映させてください 4. 結果が表示されます 設定を変えたい場合は Back 保存する場合は Next 5. 名前を確認して Finish で保存します 36

37 フラグによるフィルタリング (Filter Probesets by Flags) Flag はエンティティごとに付加される品質情報です Flag 情報は解析するアレイのプラット フォームで内容が異なります Agilent の Flag の種類 Detected: シグナルが検出された Spot Not-Detected: シグナルが検出されなかった Spot Compromised:Spot の品質が低い (Saturation や Non-uniform など ) Affymetrix の Flag の種類 (3 IVT Genechip を MAS5 で Summarize したときのみ利用可 ) P: シグナルが PM 特異的に検出されたプローブセット M: P か A を判別できないプローブセット A: シグナルが検出されない またはクロスハイブリの可能性のあるプローブセット 1. Quality controlからfilter probesets by flagを選択する 2. エンティティリストとインタープリテーションを選択する 3. フィルター条件を設定して Next Retain entities in which: 指定した範囲で抽出する際の条件を設定します 上段 : インタープリテーションで定義した各コンディションから通過する % を設定 下段 : すべてのサンプルから通過させる数を選ぶ 値を変更した後は 必ず Enter キーを押して設定を反映させてください 4. 結果が表示されます 設定を変えたい場合はBack 保存する場合はNext 5. 名前を確認してFinishでエンティティリストを保存します 37

38 シグナルデータのフィルタリング (Filter Probesets on Data files) インポートしたシグナルデータがテキストファイルの場合は Filter Probesets on Data files を 使うとテキストファイルに存在する情報についてフィルターをかけることができます 1. ワークフローの Quality control から Filter Probesets on Data files をクリック 2. フィルターをかけるエンティティリストとインタープリテーションを選択して Next をクリック 3. フィルターをかけるカラムを選択 テキストデータのプレビュー 検索対象のカラムを選択 = や > などの条件を設定 検索に使用する値を入力 Retain entities in which: 指定した範囲で抽出する際の条件を設定します 上段 : インタープリテーションで定義した各コンディションから通過する % を設定下段 : すべてのサンプルから通過させる数を選ぶ 4. 結果が表示されます 設定を変えたい場合は Back 保存する場合は Next 5. 名前を確認して Finish ボタンで保存します 38

39 再現性によるフィルタリング (Filter Probesets by Error) 再現性の低いデータを CV 値や SD 値をもとにフィルターすることができます 1. ワークフローの Quality control から Filter probesets by Error をクリック 2. フィルターをかけるエンティティリストとインタープリテーションを選択して Next をクリック インタープリテーションは平均化されているものを選んでください 3. フィルターの設定を行います CV 値 (0-100) かSD 値 (0- ) にチェックを入れ 数値を入力します どちらも 0 に近い値がより再現性が高くなります Retain entities in which: 指定した範囲で抽出する際の条件を設定します 上段 : インタープリテーションで定義した各コンディションから通過する % を設定下段 : すべてのサンプルから通過させる数を選ぶ値を変更した後は 必ずEnterキーを押して設定を反映させてください 4. 結果が表示されます 設定を変えたい場合はBack 保存する場合はNext 5. 名前を確認してFinishボタンで保存します 39

40 解析 1 遺伝子リストの絞込み統計検定 (Statistical Analysis) 統計検定は 繰り返し実験から得られた様々な統計量を基に確率的な有意差で発現変動している遺伝子を抽出することができます 実験デザインと利用する検定の対応統計検定は 2 群比較 多群比較などで利用する手法が異なります 下記に実験デザインと利用する検定の対応表を示しました Unpaired test 例 ) 薬剤効果を比較するグループ間で個人が一致しないとき 1 パラメータ 1 パラメータ 2 パラメータ 2 条件 3 条件 2 条件以上 パラメトリックテスト ( 等分散 ) T-test unpaired Moderated t-test ANOVA 2-way ANOVA パラメトリックテスト ( 不等分散 ) T-test unpaired unequal variance ANOVA unequal variance -N/A ノンパラメトリックテスト Mann Whitney unpaired Kruskal Wallis -N/A Paired test 例 ) 薬剤効果を比較するグループ間で個人が一致しているとき 1 パラメータ 2 条件 1 パラメータ 3 条件以上 パラメトリックテスト T-test paired Repeated measures ノンパラメトリックテスト Mann Whitney paired Friedman 40

41 t-test による検定 t-test は繰り返し実験を行った 2 条件の遺伝子の発現差を検定する手法です 有意差の指標 である p-value が低いほど 2 条件で発現量が同じ確率が低くなります p-value が低くなる要 因は主に下記の 2 つになります 1. 検定する遺伝子の 2 条件間の平均値が大きく離れている 2. 検定する遺伝子の条件内の再現性が良い 例 : ある遺伝子の Box plot 遺伝子 A( 発現差なしと判断 ) 遺伝子 B( 発現差ありと判断 ) P=0.91 P=0.01 t-testのオプション統計検定はインプットした遺伝子 ( エンティティ ) の数だけ繰り返されます これにより統計検定の回数が増えると偽陽性が検出される確率もその分増えることになります 偽陽性の増加を制限するために GeneSpringには多重検定の補正 (Multiple testing correction) オプションが選択可能です デフォルトではFDRに設定されています t-testとfold changeを組み合わせると有効繰り返し実験の数が少ない場合や 非常に再現性が高い場合などは平均値の差が 1.1 倍でも検出する場合があります この場合は後述のFold changeと組み合わせます t-testとfold changeを同時に行うfilter on Volcano plot 機能も搭載されています 41

42 統計検定 (t-test) の操作手順 1. ワークフローの Analysis から Statistical Analysis を選択 2. 検定するエンティティリストとインタープリテーションを選択 3. 比較する条件と検定の種類を設定 注意 : 結果で表示される Fold change の計算は Condition1/Condtion2 です Condition2 にコントロールに該当するコンディションを指定すると結果がわかりやすくなります 4. 多重検定の補正を設定する 42

43 5. 結果を閲覧する 値を変更した後は 必ず Enter キーを押して設定を反映させてください Result Summary( 左上 ) p-value と FC(Fold change) で段階的にフィルターした結果を表示しています たとえば P < 0.05 と FC > 2.0 に該当するセルを選択すると 右側にある Volcano plot に該当するエンティティが緑でハイライトされます ハイライトしたエンティティは Save custom list で保存することができます 検定の際 Multiple testing correction を使用した場合は Corrected p-value になります Expected by chance は予測される偽陽性 (Type I Error) の数です p-values( 左下 ) 検定を通過したエンティティです p-value の Cutoff を変更可能 Volcano Plot( 右 ) 縦軸に有意差 (-log10 p-value) 横軸に発現差 (log2 Fold change) をプロットしたグラフです 縦軸は p-value を -log10 に変換しているため 縦軸が高いほうが p-value が低いエンティティになります 6. 名前 ( 変更可能です ) を確認して Finish 7. 入力したエンティティリストの下層に検定済みの新しいリストが保存されます 43

44 ANOVA による検定 ANOVA は 3 条件またはそれ以上の比較で いずれかの条件で発現差がある遺伝子を検定す る手法です 1way-ANOVA や 1 元配置の分散分析と同義です 有意差の指標である p-value が 低くなる要因は主に下記の 2 つになります 1. 検定する遺伝子の条件内のばらつきが小さい 2. 検定する遺伝子のサンプル全体の平均値から各条件の平均値のばらつきが大きい ANOVA は条件内のばらつきよりも サンプル全体の平均値から各条件の平均値のばらつき が十分大きい遺伝子が得られます 遺伝子 A( 発現差なしと判断 ) 遺伝子 B( 発現差ありと判断 ) ANOVA のオプション 1 P=0.45 P=0.008 統計検定はインプットした遺伝子の数だけ繰り返されます これにより統計検定の回数が増えると偽陽性が検出される確率もその分増えることになります 偽陽性の増加を制限するために GeneSpringには多重検定の補正 (Multiple testing correction) オプションが選択可能です デフォルトではFDRに設定されています ANOVAのオプション 2 ANOVAは複数の条件を同時に比較することができ どこか 1 条件でも変動していると発現差ありとみなされます どの条件で変動しているかを確認するには ANOVAを通過した後の遺伝子リストに対してPost Hoc testを行うことで確認できます ANOVAとFold changeを組み合わせると有効繰り返し実験の数が少ない場合や 非常に再現性が高い場合などは平均値の差が 1.1 倍でも検出する場合があります この場合は後述のFold changeと組み合わせます 44

45 統計検定 (ANOVA) の操作手順 1. ワークフローから Statistical Analysis を選択 2. 検定を行うエンティティリストとインタープリテーションを選択 3. 検定の種類を選択する 4. Post Hoc test を選択する 各コンディションでいくつのエンティティに違いがあるかを検定することができます TukeyHSD が良いでしょう 5. 多重検定の補正方法を選択 6. ANOVA の結果に指定した条件からの Fold change を付加する事ができます ここでは Fold change でのカットオフはかかりません 45

46 7. 結果を確認 p-value の Cutoff を変更可能 値を変更した後は 必ず Enter キーを押して設定を反映させてください Result Summary( 左上 ) 段階的に p-value でフィルターした結果を表示しています 検定の際 Multiple testing correction を使用した場合は Corrected p-value になります Expected by chance は予測される偽陽性 (Type I Error) の数です p-values( 左下 ) 検定を通過したエンティティです Post-hoc Analysis Report( 右 ) Post Hoc test を選択した時のみ表示されます ANOVA を通過したエンティティについて Post Hoc test を行った結果を表示します 各コンディションをすべて比較し 発現差があるエンティティ数を青いセル 発現差がないエンティティを赤いセルで表示します 興味のあるセルを選択してから Save custom list をクリックするとエンティティリストとして保存されます 複数のセルを選択すると Union でマージしたエンティティリスト Intersection で重複部分のみのエンティティリストが保存されます 8. 名前 ( 変更可能です ) を確認して Finish 9. インプットしたエンティティリストの下層に結果が保存されます 46

47 Fold change(fold change) Fold change は発現量の変化が大きいエンティティを抽出することができます 1. ワークフローの Analysis から Fold change をクリックする 2. エンティティリストとインタープリテーションを指定する 3. 比較するコンディションを指定する Select pairing option で比較方法を 2 種類選択可能です All against single condition の場合は特定のコントロールを選択する Pairs of conditions の場合は比較するペアを選択する 注意 :Fold change の計算は Condition1/Condtion2 です Condition2 にコントロールに該当するコンディションを指定すると結果がわかりやすくなります また 画像赤枠のボタンで Condition1 Condition2 を切り替えることができます 47

48 4. 結果のプレビューが表示される Fold change 後のエンティティ数を表示 発現差のカットオフは変更可能 複数ペアがある場合はカットオフ可能 5. 名前を確認して Finish 6. 比較したペアごとに UP と DOWN のエンティティリストが保存されます 48

49 解析 2 クラスタリングなどクラスタリング (Clustering) 膨大なデータの中からエンティティやコンディションの発現パターンが似ているものを分類します コンディションが少ないものはScatter plotやprofile plotでも変動をつかめますが コンディションが多くなるとそれぞれのエンティティの発現変動を理解しづらくなるので クラスタリングでパターン別に分けて それぞれのクラスターに 後述のGO Analysisなどで意味付けしていきます クラスタリングする際の注意点 1:Baseline Transformationを利用する Baseline transformationは発現値を同じスケールに置き換えパターンに変換します この補正は個々の遺伝子の条件変化による変動を見つけやすくなります クラスタリングする際の注意点 2: はずれ値を除去するクラスタリングでは 極端な値を持つはずれ値や変動していないエンティティの影響を受けます 事前にQuality controlを行い 信頼性の高い かつ変動したエンティティを絞り込むことが重要です 49

50 k-means K-means は エンティティまたはコンディションをユーザーが指定した K 個のクラスターに 分けるアルゴリズムです 例えば ある病態に 3 つのサブタイプが存在する という仮 説がある場合など コンディションを 3 つのクラスターに分ける K-means を実行する価値が あります 初期の K 個のクラスターはランダムに配置されるので 結果が安定しない場合が あります メモリ使用量が低く非常に処理が早いアルゴリズムですが エンティティ同士の関連やク ラスター同士の関連情報は得られません 1. ワークフローの Analysis から Clustering を選択する 2. エンティティリスト インタープリテーションを選択し K-means を選択して Next エンティティリストを指定 インタープリテーションを指定 K-means を指定 3. Parameters を設定する Cluster on: クラスタリングする対象を選択 Entities か Condition または両方 Distance metric: 距離の定義を設定します Number of clusters: クラスター数を指定します Number of iterations: クラスターを探す工程を繰り返す回数 ( 大きいほど再現性が良くなる ) 4. Preview ボタンで結果が表示されます 保存する場合は OK をクリックします 5. 名前を確認して Finish 6. 結果がプロジェクトナビゲーターに保存されます 7. 結果を右クリックして Expand as Entity list をクリックするとクラスター毎のリストが保存されます 各クラスターに後述の GO 解析やパスウェイ解析をお試しください 50

51 Hierarchical Hierarchical は階層的クラスタリングです エンティティとコンディションの距離をツリーで 表現します 枝が近いほど似ていると解釈します 全ての関連を表示することができますが クラスターの明確な境界が無いためその点はユーザーが判断する必要があります 1. ワークフローの Analysis から Clustering を選択する 2. エンティティリスト インタープリテーションを選択し Hierarchical を選択して Next エンティティリストを指定 インタープリテーションを指定 Hierarchical を指定 3. Parameters の設定 Normalized intensity values:normalized intensity を利用します Associated values:p-value や Fold change 等エンティティリストに付加された値を利用 Cluster on: クラスタリングする対象を選択 EntitiesかCondition またはBoth( 両方 ) Distance metric: 距離の定義を設定します Linkage rule: クラスター間を比較するためのアルゴリズムを選択します Single: クラスター間の最近のノードの距離を比較 ( 最近隣距離法 ) Complete: クラスター間の最遠のノードの距離を比較 ( 最遠距離法 ) Average: クラスター間のそれぞれのノードの平均距離を比較 ( 群平均距離法 ) Centroid: クラスター内の重心 ( 平均 ) 同士の距離を比較 ( 重心距離法 ) Ward s:anovaに似たアプローチで クラスター内の誤差の平均値を計算し全体の誤差の平均値から差が小さいものを新しいクラスターに結合します 4. Preview をクリックすると 結果が表示されます 保存する場合は OK をクリックします 5. 名前を確認して Finish 51

52 6. 結果がプロジェクトナビゲーターに保存されます 7. 保存後は 発現量に応じた階層的クラスタリングの図が表示されます 全体図 Gene 拡大図 サンプルまたはコンディション 発現量のカラーチャート 画面左側の任意の位置のツリーをクリックすると そのツリー以下に存在する遺伝子が選 択されます アイコンで 選択した遺伝子をエンティティリストとして保存可能です 52

53 Self-Organizing Map(SOM) SOM はユーザーが行と列を指定したグリッドに対して 近いグリッドが近い値を持つよう に値を繰り返し更新して クラスターを作ります グリッドの隣り合ったクラスターはパターンが似ている傾向があります 1. ワークフローの Analysis から Clustering を選択する 2. エンティティリスト インタープリテーションを選択し Self-Organizing Map を選択する エンティティリストを指定 インタープリテーションを指定 Self-Organizing Map を指定 3. Parameters の設定 Cluster on: クラスタリングする対象を選択 Entities か Condition または両方 Distance metric: 距離の定義を設定します Maximum number of iterations: クラスターの更新の回数を設定 Number of grid rows: グリッドの列の数を指定 Number of grid columns: グリッドの行の数を指定 作成されるクラスター数 = 上記で指定した列 行になります 4. Preview ボタンをクリックすると結果が表示されます 保存する場合は OK をクリックします SOM の結果は 隣り合うクラスターはパターンが似ているという特徴があります 5. 名前を決めて Finish ボタンをクリックすると SOM の結果がプロジェクトナビゲーターに保存されます 6. SOM の結果を右クリックして Expand as Entity list をクリックすると各クラスター毎のリストが保存されます それぞれのクラスターに後述の GO 解析やパスウェイ解析等をお試しください 53

54 発現パターンの似ているエンティティの検索 (Find Similar Entities) 注目すべき発現パターンのエンティティが既にある場合 そのエンティティと似た相関ま たは逆相関する発現パターンを示すエンティティを検索します 1. Analysis から Find Similar Entities を選びます 2. エンティティリスト インタープリテーション Query Entity Similarly metric を選択します Query Entity は注目しているエンティティを Select ボタンから検索して設定してください ピアソン相関係数は線形の相関解析です 非線形の相関を解析したい場合はスピア マン順位相関係数を使用します 3. 検索結果が表示されます Cutoff 値のレンジは 1 に近いと相関 0 で相関なし -1 に近いと逆相関になります 4. エンティティリストの名前を確認して Finish ボタンでエンティティリストを保存します 54

55 数値パラメーターと相関するエンティティの検索 (Filter on Parameters) タイムコース実験や薬剤の投与量など量的なパラメーターがある場合 パラメーターと発現量について相関 逆相関するエンティティを検索します 時間依存で変動するエンティティや薬剤の量特異的に変動するエンティティなどの抽出が可能です 事前にExperiment GroupingでParameter typeがnumericのパラメーターを作成します 1. Analysis から Filter on parameter を選択します 2. エンティティリスト インタープリテーション 相関を探すパラメータ Similarity Metric を選択 ピアソン相関係数は線形の相関解析なので 非線形の相関を解析したい場合はスピアマン順位相関係数を使用します 3. 結果を閲覧する Cutoff 値のレンジは 1 に近いと相関 0 で相関なし -1 に近いと逆相関になります 4. 名前を確認して Finish ボタンでエンティティリストを保存します 55

56 Principal Component Analysis( 主成分分析 ) PCA はアレイデータをベクトルデータとみなし 空間にプロットすることでその分布から新 たな軸 ( 主成分 ) を作ります これによりエンティティやコンディションを視覚的に分類 することができます PCA on Entity と PCA on Condition のどちらかを選べます Quality control on samples の PCA とは違い ノーマライズ後のデータを使い 使用するエンテ ィティリストやインタープリテーションも選択可能です 初めに Tools メニュー /Options/Data Analysis Algorithms フォルダを選択し Principal Component Analysis の 3-D Scores にチェックを入れてから Apply してください 1. Analysis から Principal component Analysis を選択 2. エンティティリストとインタープリテーションを選択 3. 各条件を設定して Next PCA on:entity か Condition を選択する ( ここでは Condition を選択 ) Number of principal components: 入力した数字だけ主成分を作成します 56

57 4. 結果を閲覧する PCA Scores:X 軸 (PCA Component1) とY 軸 (PCA Component 2) の 2 次元のスキャッタープロットです 3D PCA Scores:X 軸 (PCA Component1) とY 軸 (PCA Component 2)Z 軸 (PCA Component3) のスキャッタープロットです デフォルトでは影響の大きいX>Y>Zの順に並びます PCA Loadings:PCA on Conditionを選んだ場合 各 Entityが各 PCA Componentに対して持っている負荷量をプロットすることができます PCA 終了後にエンティティリストに付加される値と同じものです C-C Plot: 共分散と相関をプロットしたグラフです Eigen values: この値は各 PCA Componentがデータの持つ変動を全体からどの程度説明しているかを表す寄与率です 青は累積の寄与率になります 累積寄与率が 80% 程度までのPCA Componentを見れば 十分な情報を捉えていることいえるでしょう 57

58 5. Entity list の保存 NEXT をクリックすると PCA の結果を Entity list で保存できます この時 Entity list に付加される Associated value として PCA loading factor が付加されます これは各 PCA Component に対する個々の Entity のインパクトを表します 6. PCA の結果はプロジェクトナビゲーターに保存され ダブルクリックで結果を見ることができます 7. PCA の結果を右クリックして Expand Entity list をクリックすると エンティティリストとして結果が保存されます View メニューの Plot list associated value を使うと PCA の Loading factor をヒストグラム等で表示することができます 58

59 結果の解釈 GO 解析 (GO Analysis) GO(Gene Ontology project: は生物学的な語彙とそれに関連する遺伝子を収集し 遺伝子の機能や 局在 プロセスごとにカテゴライズしています GeneSpringのGO Analysisは自分の解析で得たエンティティリストがGOで分類された遺伝子のリストと偶然一致する確率を計算します 偶然一致する確率が低い (p-valueが低い) 関連が高いと解釈します 1. ワークフローのResults InterpretationからGO Analysisを選択します 2. エンティティリストを選択してNextをクリックします 3. 結果の閲覧 4. Spreadsheet の見方基本的には Corrected p-value の値が低い順に見ていきます Change cutoff ボタンをクリックすることで p-value( 実際には FDR) のカットオフを変えることができます カットオフ値を低くすると 検定はより厳しくなります GO ACCESSION:GO Term の ID GO Term:GO によって定義されたカテゴリ名 P-value:Fisher s exact test の p-value Corrected p-value:multiple testing correction 後の p-value この値で Cutoff します Count in selection: 自分のエンティティリストと GO カテゴリで重複した遺伝子数 %Count in selection: 自分のエンティティリストでその GO カテゴリに該当し割合 Count in total: All entities から その GO Term が含まれる遺伝子の数 %count in total:all entities から その GO Term が含まれる遺伝子の割合 59

60 5. Finish で Project Navigator にエンティティリストに保存されます GO Analysisから ほしい遺伝子だけをピックアップする自分のエンティティリストから興味のある遺伝子だけを検索する場合は 下記の方法を使用します 1. 通常通りGO Analysisを行います 2. 次にCut offを 1 に変更します 3. GO Tree タブを選択します 60

61 4. 検索単語を入力して Find をクリックします 複数の GO Term がヒットする場合は Select をクリックすると すべて選択されます 5. Save custom list ボタンで保存します 注意 :Cutoff を 1 にしたまま Finish ボタンをクリックしないでください すべての GO Term が保存されるため 大幅に時間がかかります 終了する際は Cancel することをお勧めします 61

62 GSEA 解析 (GSEA) GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) はユーザーが指定したエンティティリストと発現量を もとに 独自に定義された Geneset 毎に Enrichment score を算出し その Enrichment Score が偶 然に発生する確率を計算します これによりユーザーが指定したエンティティリストに GSEA で定義された Gene set がどの程度含まれるかを検索します GSEAは個々の遺伝子の発現量変化というよりも 遺伝子群としての発現量変化を重視するのでFold changeや検定をする前のリストに対して有効です BROAD Institute が配布している Gene sets C1 Cytogenetic sets: 染色体位置情報セット C2 Functional sets: 既知のパスウェイやバイオマーカー遺伝子セット C3 Regulatory-Motif sets:microrna や転写因子の結合配列モチーフセット C4 Neighborhood sets: 癌関連遺伝子セット C5 Gene Ontology sets:go で定義された遺伝子セット Geneset の定義の詳細は下記をご覧ください データの準備 BROAD Instituteが管理しているGenesetをインポートします GenesetをインポートすることでGeneSpringでGSEAを使うことができるようになります ダウンロードにはGSEAのWEBページでのユーザー登録が必要になるので 各自で行ってください 1. Downloadsをクリックします 2. 登録した アドレスでログインします 62

63 3. GSEA 解析に使いたい Gene Set をダウンロードします ( 例 :C2 の既知のパスウェイの場合 ) 必ずダウンロードする各 Geneset は ~symbols.gmt をダウンロードしてください 4. GeneSpringGX の Tools メニューから Import BROAD GSEA Gene sets をクリックします 5. ダウンロードした Gene set を指定し インポートしてください ファイルタイプは *gmt を選択するとファイルが表示されます 6. 該当する Geneset のカテゴリーを選択して OK をクリックするとインポートを開始します 63

64 GSEA の実行 1. ワークフローの Results Interpretation から GSEA を選択します 2. エンティティリストとインタープリテーションを選択します インタープリテーションは比較したいグループで作成したものを選択してください 3. 発現量を比較する条件を選択する 4. 解析したいカテゴリーを選択して Next をクリックする Minimum number of marking Genes: 指定値以上の遺伝子が hit した Gene Set を出力 Maximum number of permutations: ランダムシャッフリングの回数 (100 回程度で十分 ) Simple Search:BROAD Gene sets に対する解析を行う Advanced Search: 自分で準備したエンティティリストに対して解析を行う 64

65 5. 解析結果の閲覧基本的に q-value をソートして値の小さい順に確認します Gene Sets: 解析を通過した Gene sets Details: Gene set に対する注釈 Total Genes: gene set の遺伝子総数. Genes Found: 自分のエンティティリストが Gene set にヒットした数 P value: p-value Q value: 検定の総数で補正した p-value ES value: エンリッチメントスコア NES value: エンリッチメントスコアの最大値で補正されたされたスコア 6. Finish ボタンをクリックするとエンティティリストとして保存されます各 Gene Set の定義の詳細は で確認してください 全ての Geneset は GeneSpring 内にはエンティティリストとして登録されています 内容を確認したい場合や 削除したい場合など Search メニューから Entity で検索してください 65

66 パスウェイ解析 GeneSpring12 では WikiPathway に対応したことにより 自分のデータを簡単に既知のパスウ ェイにマップすることができるようになりました データの準備 インタラクション DB のダウンロード 1. Annotations メニューの Update pathway interaction/from server を選択 2. 初めてこの機能を使う場合は基本データのダウンロードが始まります 3. Interactiondb のリストが表示されたら目的の生物種を選択して Update をクリック 4. しばらくするとインポートが完了します Human などはファイルサイズが 1GB 程度あるのでかなり時間がかかります BridgeDb のダウンロード 1. Annotations メニューから Update BridgeDb/From Agilent Server を選択 2. 目的の生物種がある場合はチェックを入れ Update をクリック WikiPathway のダウンロードとインポート 1. にブラウザでアクセスして目的の生物種の Pathway をダウンロードしする 2. ダウンロードしたファイルを解凍する 3. GeneSpring の Tools メニューから Import pathway from file>gpml を選択 4. 新しく開いた Import pathway 画面の Choose file(s) をクリックし 3 で解凍したファイルを指定 5. Import pathway 画面で OK をクリック 6. 生物種を確認して OK をクリック 7. しばらくするとインポートが完了します Single Experiment Analysis Single experiment analysisは自分の解析したエクスペリメント 1 つと既知のパスウェイデータとの関連を調べることができます マイクロアレイ解析では主にこちらを使います また Multi-Omic Analysisは ほぼ同じ操作で 2 つのExperimentから遺伝子リストを選び既知のパスウェイデータとの関連を調べることができます 1. ワークフローの Pathway Analysis から Single Experiment Analysis をクリック 2. 対象生物と解析対象のパスウェイを選択します 66

67 3. 解析するインタープリテーションとエンティティリスト 利用する ID を選択 4. 結果が表示されるので Next 5. Save pathway list が開くので 名前を決めて Finish 6. ブラウザで結果を閲覧 ブラウザ パスウェイリスト 遺伝子リストフィルタパスウェイリストは p-valueでソートして小さい順に見てください 67

68 ゲノムブラウザ Technology にゲノムの位置情報があればゲノムブラウザ上にエクスペリメントを表示するこ とができます 遺伝子発現だけでなく CGH のようなゲノム構造 メチル化や転写因子とい った発現制御の情報なども同時にゲノムブラウザで閲覧することができます データの準備 1. Annotations メニューから Annotations manager をクリック 2. Annotations manager が開いたら 左上の List から Annotation server を選択 3. 生物種一覧が表示されるので 必要な生物種にチェックを入れる 4. Update ボタンをクリックするとダウンロードが始まります 5. ダウンロードが終わると完了です 使い方 1. アイコンでゲノムブラウザを起動する 2. ゲノムビルドが複数ある場合は 使用するゲノムビルドを選択する 68

69 3. データを表示させたいエクスペリメントをブラウザにドラッグ & ドロップする 表示したいインタープリテーションとサンプルを選ぶ エンティティリストもドラッグ & ドロップでゲノムブラウザに表示させることができます 4. アノテーションを表示させたい場合は右側の Annotation タブからダブルクリックで表示する ライセンスによっては表示されないアノテーションもあります 5. ゲノムブラウザの表示は Scatter plot ですが 右クリックメニューの Edit track property でグラフタイプや軸の設定などを変更することができます 69

70 ゲノムブラウザ操作アイコンの説明 A B C D E F G H I J K A: ゲノムブラウザの全画面表示 B: トラックのマージ :Ctrlキーを押しながら 2 つトラックを選択してからマージします C: トラックの自動サイズ調整 D: トラックのフルズームアウト E: トラックのズームアウト F: トラックのズームイン Shiftキー +ドラッグでも拡大できます G: トラックの方向切り替え H: トラックの表示順変更 I: 画像ファイルのエクスポート J: 染色体の切り替え K: 閲覧する染色体位置の指定 またはGene Symbolを入力して遺伝子の検索 70

71 参考資料便利な機能 Translate 機能異なるエクスペリメント間でエンティティリストをコピーしたい場合に使用します アレイのプラットフォームや生物種が異なっても自動的に対応する遺伝子リストに変換する機能があります アレイのプラットフォームが異なる場合はアノテーションのEntrez GeneIDをキーに変換し 生物種が異なる場合はEntrez GeneIDをキーにNCBIのHomologeneの情報を参照して生物間の遺伝子を決定しています Translateの操作手順 ( 例 :AエクスペリメントからBエクスペリメントにTranslate) 1. エンティティリストをTranslateする先のBのエクスペリメントを選択 A B 2. A のエクスペリメントのエンティティリストを右クリックし Translate List を選択 3. ID と一緒に Translate する値を選択 Import list associated values にチェックを入れると エンティティリストに p-value や Fold change などの associated value がある場合は一緒に Translate できます Import signal values: 選択したインタープリテーションの Normalized 値か Raw 値を一緒に Translate できます 71

72 4. Translation mapping が表示される Percentage of entities translated ~ で変換されたパーセンテージを確認できます この対応表を保存したい場合 図上で右クリックメニューの Export As text を使用してください 5. 名前を確認して Finish をクリック 6. B のエクスペリメントに Translate 結果が保存される Translateの注意点 アノテーションにEntrez GeneIDが無い場合 利用できません Homologene( で定義されていない生物種は利用できません ProbeIDとEntrez GeneIDが 1 対 1 ではない場合 ( ほとんどの場合 1 対 1 ではない ) Translate 前後でエンティティリストの数が変化します 72

73 Export as Image ブラウザ上の画像をファイルでエクスポートすることができます 1. エクスポートしたい画面上を右クリックで Export as Image をクリック 2. ファイル名の決定 画像の大きさ 解像度を指定して OK をクリックすると保存されます 73

74 Export List Entity List にアノテーションを付加した情報をテキストファイルでエクスポートすることが できます 論文作成や他のソフトウェアへのデータ排出に使用します 1. Entity List を右クリックで Export List 2. エクスポートしたいデータにチェックを入れます アノテーションは選択して矢印ボタンで移動することができます Selected items に含まれるアノテーションがエクスポートされます 3. ファイル名とファイルタイプを指定して保存します 74

75 セレクションモードとズームモードの切り替え ブラウザ上で右クリックすることで セレクションモードとズームモードを選択できます セレクションモードスキャッタープロットの興味深い分布を範囲選択することで後述の機能でエンティティリストを作ることができます ズームモード見えにくい部分を拡大する場合 ズームモードに切り替えて範囲選択することで選択した部分を拡大することができます Create Entity List from selection Scatter plotやprofile plotのブラウザで選択したエンティティをエンティティリストとして保存できます 1. セレクションモードで興味のあるエンティティを選択する 2. Create Entity list from selection をクリック 3. 名前をつけて保存する 75

76 Import Entity List from File 論文や参考書にある外部の遺伝子リストを GeneSpringGX にインポートします 1. インポートしたい遺伝子リストをタブ区切りテキストで準備する準備するリストには GeneSpringGX 内のデータとマッチする ID が必要です お使いのチップのプローブ ID や Entrez GeneID 等を準備してください 2. Utilities から Import entity list from file をクリックする Choose file: テキストファイルを指定 Choose column to match: テキストファイル内の ID に相当するものを選択 Choose technology column: テキスト内の ID とマッチさせる GX 内の ID を選択 Choose columns to import: テキストファイル内に ID 以外にインポートしたい 情報があれば Available Items から Selected Items に移動させる 3. OK ボタンをクリックして取り込み完了 取り込めない場合は マッチさせるテキスト内の ID と GX 内のアノテーションが同じタイプの ID かどうかを確認してください 76

77 アノテーションの閲覧 自分が解析している Technology にはどんなアノテーションが含まれるかどうかを確認します 1. Search メニューから Technology を選択 何も入力せずに Next 2. インポート済みの Technology 一覧が表示されるのでアノテーションを閲覧したい Technology を選択して Inspect ボタンをクリック 3. アノテーションを閲覧する Configure column ボタンで表示するアノテーションを選べます 77

78 アノテーションからのエンティティの検索 Technology に含まれるアノテーションから興味のあるエンティティを検索できます ブラウ ザ上で Ctrl キー +F でも検索ウィンドウを開くことができます 1. Search メニューから Entities を選択 2. 検索条件を決定して Next Search for: 検索するテキストを入力 検索対象のアノテーションを左から選んで右に移動します 3. 検索結果を確認して Next 4. 名前を確認して Finish で保存します 78

79 グラフの見方 GeneSpringGX は解析データの解釈を助けるため多くの View を持っています Scatter plot 横軸と縦軸にそれぞれ任意のコンディションを設定すると 2 つの条件の再現性や発現量の違いを見ることができます 数値はすべてlog2 のNormalize 値の表示になります ViewメニューからPlot Log10/Linear valueで log10 やLinearのグラフを描画できます 2 色法の場合はアイコン右のプルダウンメニューからCy3/Cy5 plotを選択できます Plotされた点をダブルクリックするとアノテーションを閲覧 画面をドラッグするとエンティティを選択 Shift+ドラッグでフリーハンドで選択 選択したエンティティはエンティティリストで保存 右クリックメニューからSave Entitiesで 2 倍以上 2 倍以下のEntitiesを保存 MvA plot 図の下のプルダウンメニューから 横軸と縦軸にそれぞれ任意のコンディションを設定すると 横軸に 2 条件の平均値 縦軸に 2 条件の発現差 (Fold change) をプロットした図です 2 色法実験の場合は Cy5 とCy3 を比較することができます Plotされた点をダブルクリックするとアノテーションを閲覧 画面をドラッグするとエンティティを選択 Shift+ドラッグでフリーハンドで選択 79

80 Profile Plot Profile Plotは縦軸にNormalized Intensity 横軸にコンディションが設定され エンティティごとに折線グラフが描かれます Profile Plotは複数条件の発現量変化を表示することができます GX11.5 以降でnumeric parameterを作成すると パラメータをスケールに合わせて表示できるようになりました 後述のExperiment grouping 機能でnumeric parameterを設定する必要があります 線をダブルクリックするとアノテーションを閲覧 右クリックメニューから Properties>VisualizationでColor Byを選択することで 任意のコンディションの発現量で色を変えられます Histogram Histogramは縦軸に積み上げのエンティティ数 横軸にIntensityの範囲を表示することで サンプル内のIntensityの分布をみることができます SingleとMultipleがあり Multipleを選択すると 複数サンプルのヒストグラムを見ることができます Samplesで表示するサンプルの選択 右クリックメニューのProperties/DatasetタブでRaw とNormalize を切り替え VisualizationタブでUse explicit binningにチェックを入れ Number of binを変更することでグラフの解像度を変更 80

81 Matrix plot Matrix plot は Experiment に含まれる Sample を総当たりで Scatter plot 表示します どこの Sample 間で相関しているか 逆相関しているかを見つけることができます 右クリックメニューのRenderingタブのPageから 1 ページに表示する数を指定できます また ColumnsタブからMatrix plotを作成するサンプル数を変更 Venn diagram Venn Diagramは最大 4 つのエンティティリストのAND OR NOTを表示することができ リストの比較をすることができます また 図を表示した後でもドラッグ & ドロップでエンティティリストを変更することができます 興味深いエリアをクリックしてハイライトしてから ( ハイライトすると黄色く表示されます ) 左上のアイコン (Fig 赤枠 ) をクリックすると ハイライトしたエリアのエンティティリストを保存できます Venn 図からエンティティリストを作成する場合 必ずこのアイコンから保存してください 右クリックメニューのpropertiesから VisualizationタブからSelect Entity listsを選択することで 比較するエンティティリストの数を変更可能 をクリックすると重なり具合を考慮した図になります 81

82 Box Whisker Plot Box Whisker Plotは複数サンプルの分布を 1 画面で閲覧することができます 中央値の揃い方やデータの対称性などをみることで Normalizeの妥当性を判断することができます 青い四角の中央の線が中央値 上端が 75% 値 下端 25% 値になります BoxWhiskerPlotの形が大きく異なる場合は ばらつきの原因を検討してください 右クリックメニューのpropertyから Columnタブで表示するサンプルを選択できます Normalizeを評価する場合は Baseline optionを使用せずにexperimentを作ります Heatmap Heatmapは縦軸にエンティティ横軸にコンディションを配置し 発現量を色で表示しています これにより発現の強弱を視覚的にとらえることができます エンティティはエンティティリストの順番で並んでいます 発現パターンが似ているものを集めるにはクラスタリングを行う必要があります 82

83 Spreadsheet SpreadsheetはID Normalized Intensity Annotationをテキストで閲覧することができます エクスポートする場合は右クリックメニューからExport as textでテキストファイルに保存できます Summary Statistics 各サンプルの統計量を閲覧することができます 83

84 GX7 と GX9 以降の検定の対応 GX7 と GX9 以降について統計検定機能の対応表です T-test ANOVA 2-way ANOVA 2color 実験で使う GX の T-test against Zero は GX7 の Filter on Confidence に相当します 84

85 1sample T-test( 主に 2color 実験の場合に使用可能 ) 2color 実験に使用します それぞれのEntityについて 2 色のDyeの比が 1(log2 表示だと 0) である可能性を検定します 結果はp-valueで表され p-valueが低いほど 2 色のDyeの比が 1 である可能性が低い つまり変動している可能性があるといいかえられます 1. 2color 実験でレプリケイトのあるInterpretationを作る 2. Analysis から Statistical Analysis を選択 3. エンティティリストとインタープリテーションを選択して Next 4. T-test against Zero を選択 85

86 5. P-value computation と Multiple testing correction を選択して Next 6. 結果を閲覧して Next p-value の Cutoff 値を変更するには Change cutoff ボタンをクリックして値を変更します 結果の見方 Result Summary( 左上 ) p-value と FC(Fold change) で段階的にフィルターした結果を表示しています たとえば P < 0.05 と FC > 2.0 に該当するセルを選択すると 右側にある Volcano plot に該当する Entity がハイライトされます ハイライトした Entity は Save custom list で保存することができます p-values( 左下 ): 検定を通過した Entity のリストです Volcano Plot( 右 ) 縦軸に有意差 横軸に変動差をプロットしたグラフです 縦軸は p-value を -log10 に変換しているため 縦軸が高いほうが p-value が低くなります 横軸は 2 コンディションの平均値を比較したときの値です 7. 名前を確認して Finish ボタンで保存 86

87 Similarity Metrics クラスタリングや Find similar entities などで利用される エンティティやコンディションの 距離の定義について性質を解説します 距離系の定義 Euclidian: Standard sum of squared distance (L2-norm) between 2 entities. Takes into account the direction and magnitude of vectors. Squared Euclidian: This accentuates the distance between entities and tends to give more weight to outliers because of the lack of the squared root. Manhattan: Manhattan distance is greater than Euclidian. Data using this method might appear less compact. Chebychev: The absolute value of the maximum difference in any dimension (L-Infinity-norm). This will simply pick the largest distance between 2 corresponding genes. This is resilient to noise.. 87

88 Differential: The difference in slopes between the expression profiles of two entities and computing the Euclidean norm of the resulting vector. Useful in time series analyses, where changes in the expression values over time are of interest, rather than absolute values at different times. Correlation 系の定義 Pearson Absolute: The absolute value of the Pearson Correlation Coefficient between two entities positively and negatively correlated entities are close to 1 and -1, respectively. Unrelated ones are close to 0. Pearson Centered: The 1-centered variation of the Pearson Correlation Coefficient. Positively correlated entities are close to 1; negatively correlated are close to 0, and unrelated entities close to 0.5. Pearson Uncentered: Entities are not mean-centered. Positively and negatively correlated entities are close to 1 and -1, respectively. Unrelated ones are close to 0. 88

89 GeneSpring の保守 管理 プロジェクト単位のエクスポート 現在開いているプロジェクトをエクスポートすることで 部分的なデータのバックアップや 他のGeneSpringへのデータ移行が可能になります 1. エクスポートしたいプロジェクトを開く 2. Project メニューから Export Project を選択 3. Choose Experiments 画面で Export したいエクスペリメントにチェックを入れる 4. テクノロジー ( アノテーション ) も同時に Export する場合はチェックを入れる 5. 名前をつけて保存先を指定する ( 日本語パスを含めないように ) 6. 拡張子が.tar のファイルが保存されると完了 89

90 データのバックアップと復元 この手順はGeneSpringに含まれる全てのデータをバックアップします おおむねデータ容量が大きくなるため かなり時間がかかります さらに古いWindowsなどで利用している FAT32 ファイルシステムの場合は 4GB 以上のファイルを作成できないので かならずNTFSでフォーマットされた十分に空き容量のあるディスクを保存先にしてください またバックアップしたデータの復元は 同じバージョンの GeneSpring で復元してください バックアップ方法 1. Tools メニューから Backup Repository を選択 2. 保存先を指定する 3. バックアップが完了するまで待つ デフォルトで backup.tar が作成されます これを外付け HDD などに保存してください 復元方法 1. Tools メニューから Restore backup を選択 2. バックアップで作成した backup.tar を指定する 3. 復元が終わるまで待つ GeneSpringのバージョンアップ HelpメニューからUpdate product/from Agilent serverでインターネット経由でgenespringをバージョンアップ可能です バージョンアップはファイルサイズの大きいデータのダウンロードが必要になるため ネットワーク環境によりダウンロードできない場合は必要なデータをCDなどで取り寄せてから Update product/from fileでファイルからバージョンアップすることが可能です 90

91 お問い合わせ GeneSpringのサポートは 大まかに企業ユーザーはアジレントテクノロジー アカデミックユーザーはトミーデジタルバイオロジーと分かれています ここにはそれぞれの会社のサポートと連絡先を記述しましたので ご不明な点がある場合は下記までご連絡ください 事前にGeneSpringGXのバージョンやお使いのアレイの名称を準備いただけるとスムーズに対応できますのでお手数ですがよろしくお願い致します アジレントテクノロジー株式会社 東京都八王子市高倉町 9-1 電話 : [email protected] 担当石井 トミーデジタルバイオロジー株式会社 東京都台東区池之端 電話 : [email protected] 担当田中 高木 91