GWB_RNA-Seq_

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ともなりいんそん
6 years ago
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1 CLC Genomics Workbench ウェブトレーニングセミナー : RNA-Seq 編フィルジェン株式会社バイオサイエンス部 ([email protected]) 1

2 Advanced RNA-Seq プラグイン CLC Genomics Workbench 9.0 / Biomedical Genomics Workbench 3.0 以降で使用可能な無償プラグイン RNA-Seq データを使用した発現データ解析用の各種ツールが使用可能になるおもにサンプル間の比較解析やデータのビジュアライゼーションに使用 2

3 Advanced RNA-Seq 搭載ツール PCA for RNA-Seq: 主成分分析 (Principal Component Analysis) Differential Expression for RNA-Seq: 発現変動遺伝子の解析 Create Heat Map for RNA-Seq: 二次元階層クラスタリング解析とヒートマップ作成 Create Expression Browser: 各種発現データの統合リストの作成 Create Venn Diagram for RNA-Seq: 発現変動遺伝子リストのベン図作成サンプル間比較解析を行うツールでは自動的に各サンプルの RNA-Seq データの Total count データに基づいて TMM 法で補正されたデータが解析に使用される 3

4 PCA for RNA-Seq 発現量データを用いて主成分分析 (Principal Component Analysis: PCA) を行うためのツールプロットデータの 2D と 3D 表示に対応あらかじめ関連付けておいたサンプルメタデータのグループ分類情報に基づきプロットを色分けしての表示が可能解析に使用する発現量データは自動的に TMM 法によりサンプル間の正規化がされる 4

5 Differential Expression for RNA-Seq 発現量データを用いてサンプル間の発現変動解析を行うためのツールサンプル間の発現変動を示す Fold Change と P 値が計算されボルケーノプロットによる表示が可能 Track 表示の際変動の大きさに基づき各遺伝子を色分けして表示が可能解析に使用する発現量データは自動的に TMM 法によりサンプル間の正規化がされる 5

6 Create Heat Map for RNA-Seq 発現量データを用いて二次元階層型クラスタリングを行いヒートマップ表示を行うツール発現変動を示す遺伝子や任意の遺伝子リストに含まれる遺伝子のみを使用して解析を実行することが可能あらかじめ関連付けておいたサンプルメタデータのグループ分類情報に基づきサンプルを色分けしたラベル表示が可能解析に使用する発現量データは自動的に TMM 法によりサンプル間の正規化がされる 6

7 Create Expression Browser Differential Expression for RNA-Seq ツールで作成した発現変動解析データと RNA-Seq の発現データを統合したリストを作成するツール Gene Ontology などの遺伝子機能アノテーションデータも同時に表示させ外部データベースへのリンクも使用可能になる 7

8 Create Venn Diagram for RNA-Seq Differential Expression for RNA-Seq ツールで作成した発現変動解析データを複数セット用いてデータ間の遺伝子の重複などを表すベン図の作成を行うツールベン図上で Fold Change や P 値の閾値を変更し変更結果をリアルタイムにベン図に反映が可能ベン図上の任意のエリアを選択することで該当する遺伝子データを容易に取得が可能 8

9 各ツールの使用の流れ Import Metadata メタデータのインポート RNA-Seq Analysis RNA-Seq 発現量データの取得 Create Heat Map for RNA-Seq クラスタリングとヒートマップ作成 Differential Expression for RNA-Seq 発現変動解析 PCA for RNA-Seq 主成分分析 Create Expression Browser 発現データリスト作成 Create Venn Diagram for RNA-Seq ベン図作成 9

10 Import Metadata 10

11 Import Metadata まず始めに Microsoft Excel などを使用し以下の例のように 1 行 1 サンプルごとにサンプル情報をまとめたファイル (.txt,.xlsx 形式など ) を作成する 1 列目には関連付ける各データの Navigation Area 上でのデータ名の一部またはすべてと同じにする 2 列目以降の列数とヘッダー名は任意に指定できる各サンプルのリード配列データ 11

12 Import Metadata Import メニューから Import Metadata を選択しクリックするとウイザードが起動する 12

13 Import Metadata Data association: Exact: 1 列目のデータ名と関連付けるデータ名が完全一致する場合に選択 Partial: 1 列目のデータ名と関連付けるデータ名が部分一致する場合に選択 * 関連付けが実行可能だと緑色のチェックが付く 13

14 Import Metadata データの保存先を指定するメタデータのテーブルがインポートされる 14

15 RNA-Seq Analysis 15

16 RNA-Seq Analysis 1. RNA-Seq Analysis を選択しダブルクリック 2. リード配列データを選択 16

RNA-Seq Analysis References Genome annotated with genes and transcripts: Gene および mrna のアノテーショントラックの両方が存在する場合 ( 真核生物ゲノム ) Genome annotated with genes only: Gene のアノテーショントラックのみ存在する場合 ( 原核生物ゲノム ) One

17 RNA-Seq Analysis References Genome annotated with genes and transcripts: Gene および mrna のアノテーショントラックの両方が存在する場合 ( 真核生物ゲノム ) Genome annotated with genes only: Gene のアノテーショントラックのみ存在する場合 ( 原核生物ゲノム ) One reference sequence per transcript: アノテーションが無い場合 ( リファレンスデータが配列のリストである場合に使用 ) 各配列は転写産物として扱われそれらの発現量が計算される RNA-Seq データの De novo assembly 産物がリファレンスの場合に頻用される Mapping: Map to gene region only (fast): Gene track で指定された領域のみにマッピングする Also map to inter-genic regions: 遺伝子間領域にもマッピングする ( 遺伝子発現量データには反映されない ) 17

$RNA-Seq Analysis Read alignment: Mismatch cost: リードにおいてリファレンスとマッチしない塩基があった場合のコスト Insertion cost: リードに挿入があった場合のコスト Deletion cost: リードに欠失があった場合のコスト Length fraction: リードの長さのどの程度がマップされているべきか Similarity$

18 RNA-Seq Analysis Read alignment: Mismatch cost: リードにおいてリファレンスとマッチしない塩基があった場合のコスト Insertion cost: リードに挿入があった場合のコスト Deletion cost: リードに欠失があった場合のコスト Length fraction: リードの長さのどの程度がマップされているべきか Similarity fraction: リードとリファレンス間での配列がどの程度類似しているか Global alignment: Global alignment を実行するか Color space alignment: SOLiD のカラースペースデータにおけるエラーコスト Auto-detect paired distances: ペアリードデータにおいてリード配列の距離を自動で計算する Strand specific: リファレンス配列の forward または reverse 鎖に対してのみアライメントを実行するかどうか Maximum number of hits for a read: 1 つのリードがリファレンス配列に対してアライメント可能な個所の最大数 18

RNA-Seq Analysis Expression level: Count paired reads as two: ペアリードを 2 本としてカウントする Expression value: Total counts: 各遺伝子またはリファレンス配列にマップされた全リード数 (non-specific reads も含まれる ) Unique counts:

19 RNA-Seq Analysis Expression level: Count paired reads as two: ペアリードを 2 本としてカウントする Expression value: Total counts: 各遺伝子またはリファレンス配列にマップされた全リード数 (non-specific reads も含まれる ) Unique counts: 各遺伝子またはリファレンス配列にのみマップされたリード数 TPM: 各遺伝子または転写物の発現量を Transcripts Per Million; TPM で算出 RPKM: 各遺伝子または転写物の発現量を Reads Per Kilo base of exon model per Million mapped reads; RPKM で算出 Calculate RPKM for genes without transcripts: mrna アノテーションが存在しない場合遺伝子領域をエキソン領域として RPKM を算出する Use EM estimation (recommended): EM アルゴリズムを用いてリード配列が複数遺伝子や転写物にマッピングされた場合の発現データ算出の感度を上げる 19

20 RNA-Seq Analysis Gene-Level Expression data Transcript-Level Expression data Mapping data 3 種類の解析結果データが作成される 20

21 RNA-Seq Analysis Metadata テーブルで Find Associated Data をクリックすると画面下側に関連付けられた各サンプルのデータの一覧が表示され新たに作成した解析結果データも表示される Role カラムなどで目的のデータを容易に抽出することができ抽出したデータを選択した状態で Toolbox のツールを起動するとそれらデータが既に選択された状態になる 21

22 PCA for RNA-Seq 22

23 PCA for RNA-Seq 1. PCA for RNA-Seq を選択しダブルクリック 2. RNA-Seq Expression track データを選択 23

24 PCA for RNA-Seq 2D PCA プロットが表示される Plot Settings の Metadata 項目から各サンプルのメタデータ情報に基づきプロットの表示色などを変更することが可能 24

25 PCA for RNA-Seq 3D 表示に切り替えることも可能 25

26 Differential Expression for RNA-Seq 26

27 Differential Expression for RNA-Seq 1. Differential Expression for RNA-Seq を選択しダブルクリック 2. RNA-Seq Expression track データを選択 27

Differential Expression for RNA-Seq Experimental design: Metadata table: サンプル情報のメタデータを指定する Test differential expression due to: 発現差解析に使用するサンプルのグループ情報を指定する While controlling for:

28 Differential Expression for RNA-Seq Experimental design: Metadata table: サンプル情報のメタデータを指定する Test differential expression due to: 発現差解析に使用するサンプルのグループ情報を指定する While controlling for: 発現に影響を与えていると考えられる他の情報を指定する Comparisons: Across groups (ANOVA-like): 3 グループ以上のサンプルの場合の比較を行う All group pairs: 全グループ間で 2 グループごとの比較を行う Against control group: コントロールとなるグループを決めて比較を行う 28

29 Differential Expression for RNA-Seq テーブル表示に切り替えるとグループ間の比較データが表示されさらにウインドウ上部にある Filter 項目で任意の条件を指定し条件を満たすデータを検索することができる 29

30 Differential Expression for RNA-Seq Volcano plot の表示も可能 30

31 Differential Expression for RNA-Seq トラック表示に切り替えると各遺伝子のゲノム上の配置を確認でき Fold Change や P-value などのデータに基づいて各遺伝子を着色表示できる Create Track List ツールで複数の比較データトラックを並べて表示しそれぞれのデータの違いを目視で確認できる 31

32 Create Heat Map for RNA-Seq 32

33 Create Heat Map for RNA-Seq 1. Create Heat Map for RNA-Seq を選択しダブルクリック 2. RNA-Seq Expression track データを選択 33

34 Create Heat Map for RNA-Seq Distance: データ間の距離の計算方法のアルゴリズムを指定する Clusters: クラスター間の距離の計算方法のアルゴリズムを指定する 34

Create Heat Map for RNA-Seq Filter settings: 計算に使用するデータの選択方法を指定する No filtering: 全データを使用する Fixed number of feature: サンプル間の発現変動が大きく少なくとも 1 サンプルにおいて指定された最低リード数をもつ

35 Create Heat Map for RNA-Seq Filter settings: 計算に使用するデータの選択方法を指定する No filtering: 全データを使用する Fixed number of feature: サンプル間の発現変動が大きく少なくとも 1 サンプルにおいて指定された最低リード数をもつ任意の数のデータを使用する Filter by statistics: Differential Expression for RNA-Seq で作成した発現比較データを指定しその中から任意の検索条件で抽出されたデータを使用する Specify features: 任意のトラックまたはデータ名を指定しその中に含まれるデータのみを使用する 35

36 Create Heat Map for RNA-Seq 2 次元階層型クラスタリングの樹形図とヒートマップ図が表示される Heat Map Settings の Metadata 項目から各サンプルのメタデータ情報に基づきメタデータのラベルを表示することが可能 36

37 Create Expression Browser 37

38 Create Expression Browser クリックしてダウンロード the Gene Ontology ( のサイトから解析に使用する生物種の遺伝子発現解析用アノテーションファイルをダウンロードしておく代わりに Blast2GO PRO プラグインを使用しリファレンス遺伝子の BLAST 結果より遺伝子発現解析用アノテーションデータを作成することも可能 38

Area にデータが保存されるインポートの際は Option の Force import

39 Create Expression Browser ダウンロードしたファイルを Import アイコン -> Standard Import からインポートすると Navigation Area にデータが保存されるインポートの際は Option の Force import as type: の設定で Gene Ontology Annotation file を指定する 39

40 Create Expression Browser 1. Create Expression Browser を選択しダブルクリック 2. RNA-Seq Expression track データを選択 40

41 Create Expression Browser Additional data (optional): Statistical comparisons:differential Expression for RNA-Seq で作成した比較データを指定する Annotation resource: 遺伝子発現解析用アノテーションデータを指定する 41

42 Create Expression Browser グループ間比較データや遺伝子機能アノテーションデータサンプルごとの発現量データをまとめたリストが作成される 42

43 Create Venn Diagram for RNA-Seq 43

44 Create Venn Diagram for RNA-Seq 1. Create Venn Diagram for RNA-Seq を選択しダブルクリック 2. Statistical Comparison track データを選択 44

45 Create Venn Diagram for RNA-Seq 指定の条件で抽出された各比較データの遺伝子の重複を表すベン図が表示される Venn Diagram Settings の Data 項目から比較データの遺伝子抽出条件を指定できる 45

46 お問い合わせ先 : フィルジェン株式会社 TEL (9:00~17:00) FAX [email protected] 46

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