Microsoft PowerPoint - メダカ）化審法セミナー pptx
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- まさとし ちづ
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1 生態影響に関する化学物質審査規制 / 試験法セミナー 2016 年 2 月 26 日 29 日 OECD テストガイドライン改訂の動向について ( 国 ) 国 環境研究所環境リスク研究推進室鑪迫典久
2 今日の話題 VMG eco11の概要 TG203の改定提案 体サイズについて 未成熟 モリバンドに関する対策 メダカの別種問題 2
3 Species 1 Temperatur e ( C) Salinit y ( ) ph Hardness (mg/l CaCO 3 ) Photoper iod (hours) Total length 3 (cm)** Freshwater: Danio rerio Zebrafish Pimephales promelas Fathead minnow Cyprinus carpio Carp Oryzias latipes Japanese Medaka Poecilia reticulata Guppy Lepomis macrochirus Bluegill Oncorhynchus mykiss Rainbow trout Gasterosteus aculeatus Three spined stickleback Estuarine and Marine: 26± ± ± ± ± ± ± ± > ± ± ± ±1.0 (juveniles) ±1.0 (juveniles) ± ± ±1.0 3
4 Oryzias latipes (Japanese Medaka) 水温 ( ) ph 硬度 明暗周 期 (h) 全長 (cm) 新 TG203 25± ± 1.0 (juveniles) 4 現 TG203 (17 July 1992) ± 1.0 参考 ;TG210(26 July 2013) では 水温 ;25 ± 2 明暗周期 ;12 16h 試験期間 ; 孵化後 30 日 試験終了時の平均全長の最小値 ;17 mm 孵化率 ; 最低 80% 孵化後生残率 ; 最低 80% 4
5 魚類急性毒性試験等における 毒性症状の記載について モリバンドの取り扱い
6 背景 化審法試験法通知及び環境省の実施する生態毒性試験の仕様書において 魚類の毒性症状についての記載が求められている 毒性症状の定義および記載方法については試験施設の判断に依存している 魚類急性毒性試験において 重篤な毒性症状は 生態毒性に関する重要な知見である 毒性症状の記載を今後化学物質の安全性評価判断に用いるかどうかは未定であるが 将来的に有効な共通財産となるように整備したい よって症状の定義を明確にし 記載法を統一することが望ましいと考えられる 6
7 現行魚類の毒性症状についての記載 (1) 化審法試験法通知 ( 平成 15 年 11 月 ) 暴露開始後少なくとも 時間後に魚の様子を観察する 観察可能な動き ( 例えば 鰓蓋の動きなど ) がなく 尾柄部に触れて反応がない場合には魚は死亡しているとみなす 観察時に死亡魚を取り除き死亡率を記録する 暴露開始後 3 時間と 6 時間後にも観察することが望ましい 平衡 遊泳行動 呼吸機能 体色などに異常が観察された場合は記録しておく 7
8 現行魚類の毒性症状についての記載 (2) 藻類 ミジンコ及び魚類の急性毒性に対する試験手順例 ( 平成 15 年 11 月版 国立環境研究所 ) ( 一部分略 ) 観察可能な動き ( 例えば 鰓蓋の動きなど ) がなく 尾柄部に触れて反応がない場合には魚は死亡しているとみなす 平衡 遊泳行動 呼吸機能 体色などに異常が観察された場合や 亜致死的な影響が観察された場合は具体的に記録する 死亡の他にも 行動や外見の異常が見られた場合には記録する その他特異的症例 ( 背曲がり 出血 体色変化 粘液の分泌 平衡失調 立鱗等 ) が観察された場合には別途具体的にその旨を記載する 異常呼吸 : 対照区の魚と比較して鰓蓋の動きが異なるもの 異常遊泳 : 明らかに対照区の魚と異なる遊泳をしたもの 動作の緩慢 過敏 痙攣 反転 鼻上げ等 遊泳不能 : 底部または水面で動いてはいるものの 水中を遊泳することが不可能なもの 横転 仮死を含む 8
9 term General behavior Quiescent Hyperexcitable Irritated Surfacing Sounding Twitching Tetanous Flaccid Normal Pigmentation Light discolored Dark discolored Varidiscolored Integument Mucus shedding Mucus coagulation Hemmorrhagic Definition Observable responses of the test fish, individually or in groups, to their environment. Marked by a state of inactivity or abnormally low activity; motionless or nearly so. Reacting to stimuli with substantially greater intensity than control fish. Exhibiting more or less continuous hyperactivity. Rising and remaining unusually long at the surface. Diving suddenly straight to the bottom; remaining unusually long at the bottom. Moving the body or parts of the body with sudden jerky movements. In a state of tetany; marked by intermittent tonic spasms of the voluntary muscles. Lacking tone, resilience or firmness; weak and enfeebled; flabby. Unaffected by or not exposed to a particular experimental treatment; conforming to the usual behavioral characteristics of the species. Color or skin due to deposition or distribution of pigment. Color appearance lighter than usual for the species. Color appearance darker than usual for the species. Color appearance abnormally varied; mottled. The skin EPA の表記法 ( 参考 ) Observably losing mucous skin coating to an abnormal degree. Showing observable clumping or clotting of the mucous skin coating, especially at the gills Visibly bleeding as from gills, eyes, anal opening 用語行動一般無活動過剰反応過敏浮上潜行ひきつり筋緊張性痙攣弾性低下正常色彩明色化暗色化変色外皮粘膜剥離粘膜硬化出血 9
10 つづき Swimming Ceased Erratic Gyrating Skittering Inverted On side Respiration Rapid Slow Irregular Ceased Gulping air Labored Progressive self-propulsion in water by coordinated movement of tail, body, fins. Broken off or tapered off to a stop. Characterized by lack of consistency, regularity, or uniformity; fluctuating, uneven; eccentric. Revolving around a central point; moving spirally about an axis. Skimming hurriedly along the surface with rapid body movements. Turned upside down, or approximately so. Turned 90 laterally, more or less, from the normal body orientation. Physical action of pumping water into mouth and out through gills, so as to absorb oxygen Observably faster than normal to a significant degree Observably slower than normal to a significant degree Failing to occur at regular or normal intervals Broken off or tapered off to a stop Swimming at surface with mouth open and laboriously pumping surface water and air through gills. Performed with apparent abnormally great difficulty and effort 遊泳 停止 不安定 旋回 アメンボ行動 逆さ遊泳 傾泳 呼吸 速い 遅い 不規則 停止 空気飲み ( 鼻上げ ) 疲弊 10
11 各試験施設のアンケート結果の記載例 ( 抜粋 ) 行動が停止した場合 遊泳不能 不活発 横転 反転 遊泳行動異常 着底 異常遊泳 無活動 活動 ( 度 ) 低下 うつぶせ 完全平衡喪失 嗜眠状態 仮死 行動が異常の場合 旋回 スパイラル遊泳 コークスクリュー遊泳 回転 狂奔 平衡失調 方向不定遊泳 異常遊泳 興奮 過敏 体色が変化した場合 明色化 暗色化 体色の変化 体色黒化 体色淡化 白化 暗化 変色 該当無し 11
12 語句の統一の考え方 症状を細かく規定すると 判断に差が生じ 統一が難しい 化審法では死因まで言及するわけではなく 細かな症状の違いを必要としていない また詳細な症例のデータ利用を考えていない 生データ ( 実験ノート等 ) への詳細な症状の記載は推奨するが 報告書には簡素化した記載にする 重篤であるか否かが重要 96 時間目における重篤の目安として 120~144 時間後には死に至ると思われる状態としてはどうだろうか 12
13 魚類の毒性症状について A: 死亡 重篤 B: 異常 C: 正常の 3 つに分類し それぞれの定義 ( 案 ) を示す 分類記載事項症状の定義 ( 案 ) A 死亡 重篤 死亡 観察可能な動き ( 例えば鰓蓋の動きなど ) がなく 尾柄部に触れて反応がな い状態 遊泳不能 鰓蓋のみが動いているが 遊泳等の運動が停止 または極度の異常を示している状態 これまでの仮死 横臥 横転等が相当する B 異常遊泳異常正常ではない遊泳行動を示す状態 以下の症状が含まれる 外見異常 表層遊泳 ( 表層で遊泳 鼻上げ等を含む ) 平衡失調 ( 平衡感覚が失われており 背泳 スパイラル遊泳 ( 鉛直方向 ) コークスクリュー遊泳 ( 水平方向 ) 等をしている ) 方向不定遊泳 ( 方向感覚がなく遊泳方向が定まらない ) 過活発 ( 活動量が増加している 興奮 狂奔等 ) 不活発 ( 活動量が低下している ) 痙攣 正常ではない外見を示す状態 1 表面に関する異常と 2 形態に関する異常の 2 つに分類する 1 表面異常 体色変化 ( 明化 暗化 ) 出血 ( 内出血を含む ) びらん ( ただれる ) 鰭腐れ 立鱗 ( 鱗が逆立つ ) 脱鱗 粘液異常 ( 粘液過剰分泌 粘液凝固等 ) 2 形態異常 背曲がり 骨折 眼球異常 ( 眼球突出等 ) 呼吸異常 正常ではない 鰓蓋の動きを示す状態 増加または減少がある C 正常なし遊泳行動及び外見に異常がみられない状態 13
14 最終報告書の記載方法 ( 案 ) 少なくとも 死亡 遊泳不能 遊泳異常 外見異常 (1 表面異常 2 形態異常 ) 呼吸異常 正常 のいずれかを記載し 全生存個体中のそれぞれの個体数がわかるように記載する 症状が重複して観察される場合には より重篤な分類 (A>B) を優先する 分類 Bの症状が重複して観察される場合には 併記する ただし一つの個体が呈している症状がわかるように記載する 14
15 最終報告書の記載方法 ( 例 ) 濃度区 症状等の X h Y h 区分 A mg/l 死亡 1/8 3/7 遊泳不能 2/8 2/7 遊泳異常 3/8 1 個体は+ 呼吸異常 1 個体は+ 表面異常 1/7 以下の * は全て同一個体 外見異常 1 表面 1/8 1 個体は + 遊泳異常 1/7 * 2 形態 0/8 1/7 * 呼吸異常 2/8 1 個体は + 遊泳異常 1/7 正常 1/8 0/7 15
16 今後の予定 症状の表記および記載法の統一について 関係各機関の意見を参考にしながら進めていく 英語表記 OECDとの整合性についても考慮する モリバンド ( 瀕死 ) の定義が決まったらお知らせする 16
17 メダカは 分類学上 2 種類に分けられた 日本からメダカが消えた!? メダカ O.latipes ミナミメダカ O.latipes キタノメダカ O.sakaizumii 17
18 遺伝的多様性 ニホンメダカは, 種内の地理的変異が非常に多様である 各クレードの分岐年代 : 推定 200~800 万年前 : クレードA( 北日本集団 ) : クレードB( 南日本集団 ) : クレードC( 関東集団 ) : クレードD( 中国 西韓集団 ) : クレードE( 東韓集団 ) Fig. ニホンメダカにおける各クレードとその地理的分布 ( 概略図 ) 18
19 遺伝的多様性 ニホンメダカは, 種内の地理的変異が非常に多様である 各クレードの分岐年代 :200~800 万年前 [ 参考 ] チンパンジーとヒトの場合 :400~700 万年前 チンパンジー (Pan troglodytes) ヒト (Homo sapiens) 19
20 遺伝的多様性 ニホンメダカは, 種内の地理的変異が非常に多様である 各クレードの分岐年代 :200~800 万年前 [ 参考 ] オオカミとイヌの場合 :1~10 万年前 オオカミ (Canis lupus) イヌ (Canis lupus familiaris) 20
21 遺伝的多様性 ニホンメダカは, 種内の地理的変異が非常に多様である 各クレードの分岐年代 :200~800 万年前 南日本集団 南日本集団 北日本集団 しかし, 形態的差異は極めて僅かである 21
22 遺伝的多様性 主な形態的差異 :Asai et al.(2012) による 黒色網目模様 黒色染み状斑紋 銀色鱗数 キタノメダカあるある 0~9 枚 ミナミメダカないない 10~23 枚 背びれ欠刻 浅い ( 軟条の半分以下 ) 深い ( 軟条の半分以上 ) 南日本集団 北日本集団 しかし, 例外が非常に多く, 判断材料としては不充分である 22
23 ニホンメダカの遺伝的多様性に関する経緯 1950 年代 ( 江上ら ) 臀鰭軟条数の違いを報告 1980 年代 ( 酒泉ら ) 核 DNAの多型を調査 南日本集団と北日本集団に大別されることを報告 加えて, 中国 台湾 朝鮮半島のニホンメダカについても調査 2000 年代 (Matsuda et al., Takehana et al. など ) 核 DNA mtdna 5つのクレード ( 前述 ) に分かれている事を報告 23
24 ニホンメダカの遺伝的多様性に関する経緯 Asai et al. (2012) により, 下記が提唱 クレードA: Oryzias sakaizumii ( キタノメダカ ) クレードB: Oryzias latipes ( ミナミメダカ ) クレードD: Oryzias siness ( チュウゴクメダカ ) 上記に従う場合, 何がどうなるか? 24
25 ニホンメダカ新種記載の影響 分類学 分類の妥当性を巡り, 議論がされている 分子生物学 キタノメダカ と ミナミメダカ の意図的な交雑によりゲノム解読や遺伝子組み換えを効率化させている 異なる 2 種を交配させたことになってしまう 毒性学 多くの試験法で, 推奨魚種を下記としている Japanese medaka (Oryzias latipes) キタノメダカを使ったデータは無効? メダカ を買ったらまず遺伝子を調べないといけない? 25
26 medaka が試験魚の OECD テストガイドライン No.203: Fish, Acute Toxicity Test No 204: Fish, Prolonged Toxicity Test: 14-Day Study No 210: Fish, Early-life Stage Toxicity Test No 212: Fish, Short-term Toxicity Test on Embryo and Sac-Fry Stages No 215: Fish, Juvenile Growth Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay No 230: 21-day Fish Assay No 234: Fish Sexual Development Test No 240: Medaka Extended One Generation Reproduction Test (MEOGRT) 26
27 OECD 試験法の種類 ( 魚類の例 ) 慢性 TG230 TG229 (3 週間, 繁殖 VTG) TG240(MEOGRT) (5 ヶ月間, 多世代への影響 ) TG234 (10 週間, 二次性徴 ) TG212 (8~9 日間, 発達 生存 ) TG210 ( 約 40 日, 発達 生存 成長 ) 短期 TG203 TG204 TG236 (3 日間, 胚発達 ) (4 日間, 生存 ) (14 日間, 延長急性 ) 急性 TG215 (28 日間, 発達 生存 ) 魚類を用いた生態影響試験の分類 ( 概念 ) 長期 27
28 OECD TG240 のメダカに関する記載 ( 原文 ) The test species is Japanese medaka Oryzias latipes because of its short life cycle and the possibility to determine genetic sex. Although other small fish species may be adapted to a similar test protocol, the specific methods and observational endpoints detailed in this guideline are applicable to Japanese medaka alone. The medaka is readily induced to breed in captivity; published methods exist for its culture, and data are available from short term lethality, early life stage and full life cycle tests. 短いライフサイクルと遺伝 の性決定が可能なので 試験 物は 本メダカ Oryzias latipes を いる 他の 型試験 も いることができるが このガイドラインに詳述される特定の 法と観察のエンドポイントは 本メダカのみに適 できる メダカは 槽中で繁殖し 飼育 法が公開されており 短期 期の毒性試験データが利 可能である 28
29 さらにメダカに求められる条件 若 を容易に ( 購 ) できる (TG203) 数百の均質な卵が集められる (TG 他 ) 胚発 孵化 仔 の死亡率が低い (TG210) 外 上で性が判別できる (TG 他 ) 遺伝的性 (dmy) が判別できる (TG 他 ) 1ペアで繁殖できる (TG 他 ) ビテロジェニンが測定できる (TG 他 ) 成熟が早く次世代試験ができる (TG240) 急性 慢性のバックグラウンドデータがある 29
30 OECD TG に sakaizumii を入れるとしたら 別種として OECD に申請するため まず基礎データを得る キタノメダカの 的温度は?(OECDは25-26 度 ) 産卵数 孵化率 死亡率 成 速度 乳頭状 突起数等の基礎データを揃える 化学物質について急性 慢性毒性値等バックグラウンドデータの取得 ビテロジェニンのELISA 反応の確認 ( 絶対値 ) 内分泌かく乱化学物質の感受性差の知 ハイブリットを排除するか否か 分け 以上の情報を揃えてから OECD 専 者会合を経て WNT( 全体会議 ) での承認を受ける 30
31 生態毒性試験上の問題 コンタクトラボから良く受ける質問 化審法の過去のデータは キタとミナミのどちらですか キタノメダカとミナミメダカで メダカとしてデータの互換性はあるのですか ( 感受性差 ) 将来 O.sakaizumii またはハイブリッドは化審法他の試験で使われるのですか 余談 O.sinensis は使われていない 外見的に判別できる O.latipes と妊性が無い あった! 31
32 化審法の過去のデータは キタとミナミのどちらですか 橋ら ( 環境省 ) の調査から 環境省 GLPラボは南 本に偏っていて 家 産しているラボのメダカのマイトタイプはミナミである 化審法ではヒメダカを推奨しており を購 しているラボの仕 れ先養殖業者 ( 和郡 市が有名 ) の遺伝 型はミナミである ( ら 類学雑誌 短報 56(2): ) 上記から環境省 GLPから出されたデータはミナミの可能性が いが 今までミナミかキタかを区別して使 されていない 32
33 キタノメダカとミナミメダカで データの互換性はあるか ( 感受性差 ) 東洋 柏 教授らの発表では キタとミナミの毒性値にほぼ差は無い 我々のラボデータ ( 急性毒性値 ) でも差が無い TG210 等の慢性毒性試験の公式のsakaizumii データは存在しない 内分泌に関する感受性は異なる ( 林ら A journal of integrative Biology,2015) 遺伝的差異が存在するのに 感受性が同じであるとは い切れない 33
34 将来 O.sakaizumii またはハイブリッドは化 審法他の試験で使えるか O.sakaizumiiの基礎データが揃い OECDの推奨試験 欄に名前が載れば 使える ただしlatipesと同等の感受性 検出範囲を持っているのなら あえてsakaizumiiを いる必要性が不明 間違えて いられた時の危険回避的意味合い もし latipesと感受性 検出範囲が異なるなら sakaizumiiを いる価値がある その価値とOECDの推奨試験 にするための努 のバランスが取れればの話である おそらくハイブリッドは いない ( 種として定義できない ) ハイブリッドを検出する 法が分からない ( ミトコンドリアによるマイトタイプではわからない ) 34
35 被験生物 系統の異なる 5 種のニホンメダカを供試 NIES-R NIES-R/EG NIES-A ODT KNI : クレードA( 北日本集団 ) : クレードB( 南日本集団 ) : クレードC( 関東集団 ) : クレードD( 中国 西韓集団 ) : クレードE( 東韓集団 ) 35
36 試験結果 :CuSO 4 CuSO 4 1,500 ** ** 1,000 96h -LC 50 (μg/l) NIES-R NIES-R/EG NIES-A ODT KNI (B) Strain / (Clade) Fig. ニホンメダカ個体群におけるふ化仔魚の半数致死量 (LC 50 ): CuSO4,**p<0.01,Bar: 95% C.I. (A) (D) 36
37 試験結果 :2,4 DCP 2,4-DCP 10 96h -LC 50 (μg/l) 5 0 NIES-R NIES-R/EG NIES-A ODT KNI (B) (A) (D) Strain / (Clade) Fig. ニホンメダカ個体群におけるふ化仔魚の半数致死量 (LC 50 ): 2,4-DCP,Bar: 95% C.I. 37
38 試験結果 :3,4 DCA 3,4,-DCA 20 ** 15 96h -LC 50 (μg/l) NIES-R NIES-R/EG NIES-A ODT KNI (B) (A) (D) Strain / (Clade) Fig. ニホンメダカ個体群におけるふ化仔魚の半数致死量 (LC 50 ): 3,4-DCA,**p<0.01,Bar: 95% C.I. 38
39 まとめ TG203の改定は検討中 モリバンドについては 協力をお願いします キタノメダカは当面使わない ミナミメダカを試験魚とする 39
40 ご清聴ありがとうございました 40
メダカの行動
魚類急性毒性試験等における 毒性症状の記載について 鑪迫 典久 ( 独 ) 国立環境研究所環境リスク研究センター 背景 化審法試験法通知及び環境省の実施する生態毒性試験の仕様書において 魚類の毒性症状についての記載が求められている 毒性症状の定義および記載方法については試験施設の判断に依存している 魚類急性毒性試験において 重篤な毒性症状は 生態毒性に関する重要な知見である 毒性症状の記載を今後化学物質の安全性評価判断に用いるかどうかは未定であるが
Ⅵ 魚類急性毒性試験
Ⅵ 魚類急性毒性試験目的本試験は 魚類を被験物質に 96 時間暴露し 死亡率を測定することにより 魚類に対する被験物質の毒性を明らかにすることを目的とする 1 供試生物メダカ ( ヒメダカ ) が推奨されるが 例えば付表 1に示す魚種などを使用してもよい 魚は良好な健康状態にあり 外見上の奇形があってはならない 付表 1 魚種 推奨試験温度 試験魚の推奨全長 ( ) ( cm) Brachydanio
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Journal of Fisheries Technology, 3 2, , , , 2011 The Development of Artificial Spawning Grounds for Ayu, Plecoglossus altivelis
Journal of Fisheries Technology, 3 2, 137 145, 2011 3 2, 137 145, 2011 The Development of Artificial Spawning Grounds for Ayu, Plecoglossus altivelis altivelis Masayoshi KONDO, Koichi IZUMIKAWA, Katashi
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OECD OECD NOEC 14 7296 LC 50 EC 50 7296 4896 OECD TG210Fish, Early-life Stage toxicity Test ISO 12890Water quality - Determination of toxicity to embryos and larvae of freshwater fish Semi-static method
KIT-2010-EA1Bgm-L14.key
Count Form 24 of 14 in 13 to (as infinitive) 6 to 4 as 3 at 3 by 3 on 1 but 1 for 1 like 1 than 1 with of in to in 1/2 want to < >, (would) like to < >, intend to < >, 2/2 of, in, to about 3 of, in, to
On the development of eggs and rearing of larvae of a puffer, Fugu (Higanfugu) pardalis ( Temminck et Schlegel)" YOichi Shojima
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7 20 20089 002 005 019 015 029 038 041 042 047 051 071 085 088 14 5 120 50cm 700 150 Abstract This ecological project was conducted for the purpose of understanding the present and the biological diversity
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1 20019 1527 CAS 1317368 1230 PbO 223.20 1 99 1. 2 888 2 9.53 0.017 g/l 20 3 3 2 2. 10 29,309 t 22,069 t 7,240 t 4 1 3. 1 2 3.5 6 1 µg/l 9.1-24 2 µg/l < 43 6 27,431-70,000 4.5-1,300 13.4-17 31.7 0.48-3,459
1 2 1 2012 39 1964 1997 1 p. 65 1 88 2 1 2 2 1 2 5 3 2 1 89 1 2012 Frantzen & Magnan 2005 2010 6 N2 2014 3 3.1 2015 2009 1 2 3 2 90 2 3 2 B1 B1 1 2 1 2 1 2 1 3.2 1 2014 2015 2 2 2014 2015 9 4.1 91 1 2
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2011 Vol.60 No.2 p.138 147 Performance of the Japanese long-term care benefit: An International comparison based on OECD health data Mie MORIKAWA[1] Takako TSUTSUI[2] [1]National Institute of Public Health,
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1 200117 21512 CAS 111693 110 NC(CH 2 ) 4 CN 1,4- C 6 H 8 N 2 108.14 1 99 2-1. 2 1 295 159 c.c. 550 3 1.7-4.9 20 d 0.965 4 3.73 = 1 0.3 Pa 0.002 mmhg20 2 log Pow-0.32 m/z 41, 1.0 68 0.54 54 0.43 4 Koc9-16
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