マダニ種同定のために(初心者編)140214

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1 マダニの 遺 伝 学 的 な 型 別 ( 同 定 )のために( 初 心 者 編 ) はじめに マダニの 同 定 は 形 態 学 的 な 同 定 法 が Gold standard である これに 加 えて 遺 伝 学 的 型 別 (シー クエンスタイピング)が 可 能 となっている 遺 伝 学 的 型 別 法 では 一 部 種 の 区 別 ができないものが あります また マダニの 発 育 期 ( 幼 ダニ 若 ダニ 成 ダニ 成 ダニ)は 区 別 ができないこと から 必 ず 実 体 顕 微 鏡 等 にてマダニを 観 察 し 発 育 期 を 確 認 してください さらに DNA 抽 出 後 外 皮 をエタノール 等 で 保 管 することをお 勧 めいたします DNA 抽 出 後 も 外 皮 は 残 るため 遺 伝 子 に よる 同 定 が 出 来 なかった 場 合 外 皮 を 用 いた 形 態 学 的 な 同 定 を 行 なうことができます 図 1. マダニの 形 態 学 的 な 特 徴 マダニは 蜘 蛛 の 仲 間 であるため 歩 脚 が 計 8 本 ある(4 対 ) しかし 幼 ダニの 歩 脚 は2 本 少 ない 3 対 である 図 内 に 最 低 限 必 要 な 部 位 名 を 記 載 した 図 2. 日 本 国 内 に 生 息 する 代 表 的 なマダニ 亜 科 の 属 区 別 のフローチャート 花 彩 は 吸 血 時 には 分 かりにくいので 肛 門 周 囲 の 溝 の 形 で 判 断 すると 分 かりやすい 1

2 マダニの 発 育 期 簡 易 同 定 方 法 1, 脚 の 数 片 側 3 本 の 合 計 6 本 幼 ダニ 片 側 4 本 の 合 計 8 本 若 ダニあるいは 成 ダニ へ 2, 生 殖 口 の 有 無 生 殖 口 が 無 い 若 ダニ 生 殖 口 が 有 る 成 ダニ( もしくは ) へ 3, 生 息 口 の 位 置 背 板 の 大 きさ 背 板 が 背 中 の 大 部 分 を 覆 っている 成 ダニ 背 板 が 背 中 の 半 分 程 度 を 覆 っている 成 ダニ 生 殖 口 の 位 置 : 未 吸 血 であれば 成 ダニでは 生 殖 口 の 位 置 が 第 二 脚 より 肛 門 寄 りであることが 多 い 図 3. タカサゴキララマダニの4つの 発 育 期 ( 幼 若 成 ダニ 成 ダニ) 背 側 成 ダニの 背 板 ( 黒 矢 印 )は 体 の 半 分 まで 成 ダニでは 体 の 全 体 を 覆 っている( 白 矢 印 ) 図 4. チマダニ 属 の 成 ダニ 背 側 チマダニ 属 では 種 類 によ って 背 板 ( 矢 印 )が 見 に くい 左 :ヤマアラシチマダニ 右 :フタトゲチマダニ 2

3 図 5. 成 ダニ 腹 側 生 殖 口 ( 黒 矢 印 ) 位 置 の 比 較 生 殖 口 ( 黒 矢 印 )は 種 類 によって 多 少 位 置 は 異 なるが 未 吸 血 状 態 であれば 第 二 脚 の 位 置 より 肛 門 ( 青 矢 頭 ) 寄 りにあることが 多 い キララマダニ 属 ( 一 番 右 図 )では 第 二 脚 の 付 け 根 付 近 に 存 在 す る 種 もいるが 背 板 がはっきりしているため の 区 別 は 容 易 である また 生 殖 口 の 形 状 は の 生 殖 口 よりも 小 さく 丸 い ( 左 から 順 に:ヒゲナガチマダニ キチマダニ ヤマアラシチマダニ カメキララマダニ) 図 6. 吸 血 中 の 成 ダニ 腹 側 (タカサゴキラ ラマダニ) 吸 血 中 の 場 合 は 左 図 のように 脚 の 間 が 広 がる ため 位 置 が 吸 血 前 とは 異 なる しかしながら 成 ダニはほとんど 吸 血 しないことから 図 のよ うに 生 殖 口 ( 矢 印 )がある 吸 血 中 のマダニの 場 合 は 成 ダニと 判 断 できる なお 若 ダニと 幼 ダ ニも 吸 血 するので 足 の 数 と 生 殖 口 の 有 無 は 必 ず 確 認 する 左 図 で 分 かるように 吸 血 後 の 花 彩 は 見 にくい 肛 門 周 囲 の 溝 は 吸 血 時 も 残 ることが 多 いため 判 断 基 準 になる 図 7. 吸 血 中 の 若 ダニ 腹 側 (アカコッコマダニ) 吸 血 中 の 若 ダニは 脚 が4 対 生 殖 口 がない( 右 図 ) 図 はマダニ 属 であるため 肛 門 周 囲 の 溝 が 逆 U 字 になって いることが 分 かる 3

4 図 8. 成 ダニ 背 側 背 板 図 9. 成 ダニ 腹 側 生 殖 口 チマダニ 属 成 ダニの 生 殖 口 は 概 して 第 二 脚 より 上 ( 頭 部 側 )にあることが 多 い ( 図 9 左 およ び 中 央 ) 一 方 マダニ 属 などではこの 限 りではない ( 図 9 右 )しかし マダニ 属 では 背 板 の 形 状 が はっきり 区 別 できることから と の 区 別 は 容 易 である( 図 8 右 ) 未 吸 血 チマダニ 属 の 成 ダニの 背 板 は 見 にくい 場 合 があるので 生 殖 口 の 位 置 を 確 認 すると 良 い 一 般 的 に の 生 殖 口 は 横 に 広 い 形 状 をしている ( 図 8, 9: 左 キチマダニ 中 央 ヒゲナガチマダニ 右 ヤマトマダニ) 4

5 遺 伝 子 型 別 によるマダニ 種 同 定 方 法 ステップ1:マダニからの DNA 抽 出 1-1 前 処 理 DNA のコンタミを 防 ぐために 1 個 体 に1 本 の 使 い 捨 てメス 刃 ( 当 研 究 室 では ELP No.10)を 使 用 し でマダニの 腹 部 の 一 部 に 切 り 込 みを 入 れる( 右 図 =イメージ) この 際 腹 部 の 一 部 に 切 り 込 みを 入 れるだけで 十 分 である この 方 法 では 外 皮 が 形 態 同 定 にも 使 用 できる 1-2 市 販 キットを 使 用 した DNA 抽 出 法 使 用 kit:dneasy tissue Kit (キアゲン) ATL 180μl+Proteinase K 20μl プレミックスした 溶 液 をスクリューキャップタイプの チューブに 入 れ 切 り 込 みを 入 れたマダニを 入 れる Vortex 後 56 で 3 時 間 以 上 加 温 通 常 一 晩 インキュベートする Vortex スピンダウン 後 AL 200μl を 加 え 再 度 Vortex し 70 で 10 分 インキュベート (マニュアルには 80 との 記 載 があるが 病 原 体 の 検 出 を 行 なう 際 病 原 体 側 の DNA 抽 出 効 率 が 低 下 する 場 合 があったため 70 に 変 更 している) %エタノールを 200μl 加 え Vortex し スピンダウンする Filter cup に のサンプルを 全 て 入 れる( 出 来 るだけ 破 片 も 移 す) 室 温 (RT) 8000xg 1 分 遠 心 濾 液 を 捨 て Filter cup を 新 しいチューブ(2ml)に 移 し AW1 を 500μl 加 え RT 8000xg 1 分 遠 心 濾 液 を 捨 て Filter cup を 新 しいチューブ(2ml)に 移 し AW2 を 500μl 加 え RT 15000xg 3 分 遠 心 濾 液 を 捨 て Filter cup を 新 しいチューブ(1.5ml)に 換 え RT 15000xg 1 分 遠 心 し エタノールの 残 留 を 防 ぐ Filter cup をサンプルを 回 収 する 新 しいチューブに 移 し AE を 100μl 加 える サンプルが 少 ない 場 合 は 70μl に 調 整 (カラムの 最 低 容 量 はマニュアルだと 100μl) min インキュベート 後 RT 15000xg 1 分 遠 心 し 抽 出 完 了 保 管 は-20 以 下 ( 重 要!!70 インキュベートは 必 ず 行 なう マダニはゲノムサイズが 大 きいため 加 温 しないと DNA 抽 出 効 率 が 著 しく 低 下 する) なお 一 部 のマダニ 種 では 中 腸 組 織 が 多 く 含 まれる 場 合 に ph が 変 化 しやすく 抽 出 溶 液 がピンク 紫 色 になるとこがある このような 場 合 は DNA の 抽 出 効 率 が 低 下 している 可 能 性 が 高 い また 大 量 のマダニサンプルを 処 理 する 場 合 簡 易 法 であるアルカリ 抽 出 法 を 用 いることで 96 Well plate を 用 いた 抽 出 を 行 なうこともできる この 場 合 長 期 間 の 保 存 は 難 しいが 安 価 簡 便 である 目 的 に 併 せて 選 択 する ( 参 考 文 献 :Barbour et al., 2009 Am J Trop Med Hyg, 81(6); 他 詳 細 はお 問 い 合 わせください) 他 メーカーの DNA 抽 出 キットとの 比 較 を 行 なったことはないが 最 後 の 溶 出 の 際 に 分 のイ ンキュベートは 行 なった 方 が 良 い ( 別 の 研 究 者 からの 体 験 談 ) 5

6 ステップ2:マダニ mt-rrs の 検 出 2-1 PCR Primer set Forward; Reverse; mt-rrs1 5 -CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3 mt-rrs2 5 - CCGGTCTGAACTCAGATCAAGTA-3 酵 素 : 適 宜 当 研 究 室 では Takara Ex Taq あるいは pure Taq Ready-To-Go PCR Beads を 用 いて 行 なっている (これまでの 経 験 では TOYOBO KOD シリーズも 問 題 なく 増 幅 他 の 酵 素 は 試 行 していない) PCR 条 件 反 応 容 量 : 25μl 94 10sec 以 下 30cycles 94 10sec 55 30sec 72 30sec 幼 ダニなど DNA 濃 度 が 低 い 場 合 は 35cycle 回 す 電 気 泳 動 後 バンド( 約 450bp 500bp)が 見 られたら 精 製 シーケンシングへ 大 量 のサンプル を 行 なう 場 合 は mt-rrs1 のみをシーケンスし 短 い 配 列 で 判 断 することも 可 能 これまでの 経 験 では マダニ 亜 科 ( 国 内 に 生 息 しない Hyalomma 属 を 含 む) ヒメダニ 亜 科 さ らにマダニではないが ワクモも 上 記 Primer で 増 幅 可 能 であった 6

7 ステップ3: 系 統 解 析 シーケンシングで 得 られた 配 列 を 単 に BLAST 等 で 検 索 し 種 を 判 断 することは 危 険 必 ず 系 統 解 析 を 行 なって 判 断 してください ( 単 に Similarity のみで 判 断 すると 誤 同 定 になる 場 合 があります) 3-1 アセンブル ソフト: MEGA5.2 を 使 用 フリーソフト ネットから 簡 単 な 登 録 のみでダウンロードできる パソコン:Windows を 推 奨 Mac でも 動 作 可 能 だが 処 理 速 度 が 遅 いようである また Intel Mac 以 外 (Power PC 搭 載 機 など)では 動 かない 場 合 がある なお 以 下 の 解 説 は Windows 版 を 用 いている レファレンス 配 列 : 当 研 究 室 にリンクを 貼 ってあるファイルをダウンロード FASTA 形 式 上 記 までの 実 験 で 得 られた 配 列 をテキスト 形 式 あるいは FASTA 形 式 で 保 存 もし 配 列 解 析 ソフトがない 状 況 で シーケンサーから 出 力 されたテキスト 配 列 を 用 いる 場 合 は そのまま MEGA に 取 り 込 み MEGA 上 で 編 集 する 方 が 経 験 的 に 良 い 場 合 が 多 い ( 改 行 コードが 入 らないため) MEGA ソフトを 立 ち 上 げ レファレンス 配 列 を 取 り 込 む ( 先 に 実 験 で 得 られた 配 列 を 取 り 込 んでも 良 い) メニューバーの Edit/Build Alignment をク リック Create a new alignment をクリック DNA をクリック なお Protein の 解 析 も 可 能 今 回 は 割 愛 7

8 Alignment 用 の 画 面 (Alignment Explorer)が 出 てくる ここにアセンブルを 行 なう 配 列 を 取 り 込 む メニューバーの Edit から Insert Sequence From File を クリック ダウンロードしておいたレファ レンス 配 列 を 選 択 し 取 り 込 む 取 り 込 み 後 の 状 態 調 べたい 配 列 が FASTA 形 式 で 保 存 されている 場 合 は 上 記 と 同 じ 方 法 で 同 様 に 取 り 込 む テキスト 配 列 の 場 合 は 以 下 に 進 む シーケンサーから 出 力 された 生 配 列 (.txt ファイル 形 式 )の 場 合 は 上 記 と 同 じ 方 法 で 取 り 込 む そ れ 以 外 の 場 合 ( 改 行 コードが 含 まれたファイル) まずは 改 行 が 入 っていない 状 態 にする 左 のように メモ 帳 等 で 開 き 改 行 されている 場 合 は 面 倒 だが 改 行 を 削 除 し 下 記 のような 連 続 配 列 にする 全 選 択 (Ctrl+A)し コピー(Ctrl+C) なお GenBank 上 のデータを 取 り 込 む 場 合 も 多 く は 改 行 コードが 含 まれている (MEGA には 別 に GenBank データから 直 接 取 り 込 む 機 能 があるが 今 回 は 割 愛 ) 8

9 MEGA のメニューバーの Edit から Insert Blank Sequence を クリック メニューバーの Edit から Paste を 選 択 し 先 ほどコピ ーした 配 列 を 貼 付 ける (Ctrl+P でも 可 ) なお 誤 った 場 合 は Ctrl+Z で 元 に 戻 せる ちなみに 改 行 コードが 含 まれていると 2 行 目 以 降 が 下 のレファレン ス 配 列 に 渡 って 貼 付 けされて しまうため 注 意 が 必 要 なお 取 り 込 んだ 配 列 の 名 前 部 分 を 右 クリックすることで 名 前 の 変 更 や 相 補 鎖 への 変 換 (Reverse Complement)も 可 能 ( 上 図 ) シーケンスに Reverse プライマーを 用 いている 場 合 は Reverse Complement が 必 須 9

10 3-1-3 レファレンス 配 列 と 目 的 配 列 を 併 せてアセンブル Edit から Select All を 選 択 (Ctrl+A) 全 選 択 した 状 態 で Alignment から Align by ClustalW を 選 択 パラメーターを 設 定 当 研 究 室 では DNA Weight Matrix を ClustalW に 設 定 している( 右 図 ) OK で 解 析 がスタート( 下 図 ) 10

11 終 了 すると 上 図 のような 画 面 になるので 任 意 の 場 所 に 保 存 する Data から Save Session なお Reverse プライマーを 用 いて 誤 って 解 析 した 場 合 下 図 のように 明 らかに 配 列 がおかしくな るので その 場 合 は 上 記 の Reverse Complement にて 修 正 後 全 選 択 し 再 度 解 析 しなおす 系 統 樹 作 成 上 記 アセンブル 終 了 後 ファイルを 保 存 後 一 度 Alignment Explorer を 閉 じる メニューバーの Data から Open A File/ Session を 選 択 先 ほど 保 存 したアセンブル 後 のファイル を 選 択 (.mas file) 11

12 Analyze を 選 択 メニューバーの Phylogeny から Construct / Test Neighbor-Joining Tree を 選 択 パラメーターを 設 定 する 簡 単 に 系 統 樹 を 書 いて 種 同 定 をした いのでれば Phylogeny test の 欄 は None にしておく Bootstrap を 計 算 すると 時 間 がかかる 論 文 や 学 会 等 で 発 表 する 場 合 は Bootstrap 計 算 が 必 須 Model/Method は 当 研 究 室 では Kimura 2-Parameter model を 使 用 目 的 に 併 せて 変 える ける Gaps/ Missing data treatment は Pairwise deletion を 選 択 もし 配 列 の 長 さが 揃 っている 場 合 は complete deletion でも 可 目 的 に 併 せて 使 い 分 12

13 系 統 樹 が 出 来 たら 目 的 の 配 列 がどのクラス ターに 入 るか 判 断 なお View Option で 表 示 形 式 を 変 更 可 能 Option で Tree タブにおいて Taxon Separation の 値 を 小 さくする(15 20 程 度 ) と 少 し 見 やすくなると 思 います なお 図 のように オオトゲチマダニ (H. megasponosa)とヤマトチマダニ (H. japonica)およびダグラスチマダニ (H. douglasi) は 区 別 が 付 かないので ご 注 意 ください 図 では 区 別 できるように 見 えますが ここは1 2 塩 基 の 差 なので これを 基 準 にしないこと 以 上 簡 単 な 流 れを 記 載 しました なお 本 ファイル 中 の 写 真 の 無 断 転 用 はご 遠 慮 ください また MEGA の 使 用 に 当 たっては MEGA の HP にて 利 用 規 程 をご 確 認 ください 疑 問 点 等 御 座 いましたら 下 記 までお 問 い 合 わせください 文 責 : 高 野 愛 ( 山 口 大 学 )a-takano(アットマーク)yamaguchi-u.ac.jp 13