遺伝子検査の基礎知識
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- あやか ひろもり
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1 リアルタイム PCR(SYBR Green I 法 ) 実 験 ガイド この 文 書 では SYBR Green I 法 によるリアルタイム PCR について 蛍 光 検 出 の 原 理 や 実 験 操 作 の 流 れなどを 解 説 します 実 際 の 実 験 操 作 の 詳 細 については 各 製 品 の 取 扱 説 明 書 をご 参 照 ください - 目 次 - 1 蛍 光 検 出 の 原 理 2 実 験 に 必 要 なもの 3 実 験 操 作 法 4 結 果 の 解 析
2 1 蛍 光 検 出 の 原 理 SYBR Green I による 蛍 光 検 出 の 原 理 SYBR Green I は DNA に 結 合 するインターカレーターの 一 種 で PCR によって 合 成 された 二 本 鎖 DNA に 結 合 し 励 起 光 の 照 射 により 蛍 光 を 発 します この 蛍 光 強 度 を 測 定 することにより PCR 増 幅 産 物 の 生 成 量 をモニターできます さらに 後 述 の 融 解 曲 線 分 析 を 行 うことで 適 切 な 増 幅 産 物 が 得 られたかどうかを 確 認 できます 融 解 曲 線 分 析 による PCR 増 幅 産 物 の 確 認 融 解 曲 線 分 析 では PCR 反 応 後 反 応 液 の 温 度 を 60 から 95 まで 徐 々に 上 昇 させ 蛍 光 値 をモニタリングします PCR 産 物 が 二 本 鎖 を 形 成 している 状 態 では 強 い 蛍 光 が 検 出 さ れますが ある 一 定 の 温 度 (Tm 値 )に 達 すると 一 本 鎖 に 解 離 し 蛍 光 値 が 急 激 に 低 下 します Tm 値 は PCR 産 物 の 長 さや GC 含 量 により 異 なるので 目 的 の 増 幅 産 物 と Primer dimer のような 短 い 増 幅 産 物 を 区 別 することができます Raw data 1 st Derivative Primer dimer Raw data が 蛍 光 値 をモニタリングした 元 データで 1 st Derivative は 元 データを 一 次 微 分 してプラスマイナスを 反 転 させたグラフです このピーク 位 置 を Tm 値 として 算 出 します
3 2 実 験 に 必 要 なもの 一 般 的 な 実 験 器 具 類 マイクロピペット(20, 200, 1000μl)およびチップ(フィルター 付 き) 1.5 ml チューブおよびチューブラック 攪 拌 機 (Vortex) 小 型 遠 心 機 (1.5 ml チューブ 用 8 連 0.2 ml チューブ 用 )など * 詳 細 は 別 冊 の 遺 伝 子 検 査 の 準 備 と 注 意 事 項 をご 参 照 ください リアルタイム PCR 装 置 Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズは 日 本 語 仕 様 の 食 品 環 境 検 査 用 ソフト ウェアを 標 準 搭 載 しており 遺 伝 子 検 査 にお 勧 めの 機 種 です 器 具 名 称 1 Thermal Cycler Dice Real Time System Lite ( 製 品 コードTP700) 用 途 など 48ウェル 対 応 のコンパクト タイプです 2 Thermal Cycler Dice Real Time System II ( 製 品 コードTP900) 96ウェルタイプのスタンダ ードタイプです 3 Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC ( 製 品 コードTP970) 96ウェルタイプのスタンダ ードタイプです リアルタイム PCR 専 用 消 耗 品 Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズでは 専 用 の 反 応 チューブおよび 反 応 プレートをご 用 意 しております 下 記 以 外 のチューブやプレートを 使 用 すると 正 常 な PCR 反 応 が 行 われない 他 装 置 故 障 の 原 因 となりますので ご 注 意 ください その 他 反 応 液 のマスターミックス 調 製 や 鋳 型 の 希 釈 に 使 用 するチューブ 類 は 通 常 の PCR/RT-PCR 実 験 と 同 様 のものをご 利 用 いただけます
4 Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC( 製 品 コード TP970) 向 け 独 立 型 フラットキャップ 付 き 8 連 反 応 チューブ 0.1 ml 8-strip tube, individual Flat Caps( 製 品 コード NJ902) コンタミネーション 防 止 のためには 独 立 型 フラットキャップ 付 き 8 連 チューブをお 勧 めします チューブおよびキャップがそれぞれ 連 結 した 8 連 反 応 チューブ 0.1 ml 8-strip tube & cap Set( 製 品 コード NJ903) 96 穴 反 応 用 プレート & 密 着 シール 0.1 ml 96 well plate for Real Time( 製 品 コード NJ900) Sealing Film for Real Time ( 製 品 コード NJ500) Plate Sealing Pads*( 製 品 コード 9090) * 96 ウェルプレートに シールをしっかりと 貼 り 付 けるために 使 用 する 専 用 パッド リアルタイム PCR 試 薬 SYBR Green I 法 による 微 生 物 遺 伝 子 検 査 には QuickPrimer (Real Time)シリーズをお 使 い 頂 けます 以 下 のようにプライマーと 試 薬 を 組 み 合 わせて 使 用 します なお 反 応 確 認 用 の 陽 性 コントロールも 別 売 りしています リアルタイム PCR 用 プライマー QuickPrimer (Real Time)シリーズ( 製 品 コード MR101 等 ) リアルタイム PCR 用 試 薬 SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)( 製 品 コード RR420A/B)
5 陽 性 コントロール DNA QuickPrimer (Real Time)シリーズ 用 Positive Control DNA( 製 品 コード MR401 等 ) 3 実 験 操 作 法 (1) サンプルの 調 製 (エリア 2 で 実 施 ) 検 体 の 種 類 や 実 験 目 的 に 適 した 方 法 でサンプルの 調 製 を 行 います 簡 易 的 な 抽 出 を 行 う 方 法 としては 熱 抽 出 法 やアルカリ 熱 抽 出 法 があります 高 純 度 な DNA が 必 要 な 場 合 は DNA 精 製 キットを 使 用 して 調 製 します * DNA 調 製 法 に 関 しては 別 冊 の DNA/RNA 調 製 法 実 験 ガイド をご 参 照 ください * 実 験 エリアに 関 しては 別 冊 の 遺 伝 子 検 査 の 準 備 と 注 意 事 項 をご 参 照 ください (2) リアルタイム PCR 用 装 置 のセッティング(エリア 2 で 実 施 ) * Thermal Cycler Dice Real Time シリーズを 使 用 する 場 合 は 別 冊 の Thermal Cycler Dice Real Time Quick Manual をご 参 照 ください (3) 反 応 液 の 調 製 (エリア 1 3 で 実 施 ) * 操 作 方 法 の 詳 細 は 各 製 品 の 取 扱 説 明 書 をご 参 照 ください 1 反 応 液 の 調 製 (エリア 1 で 実 施 ) サンプル 以 外 の 試 薬 のマスターミックスを 氷 上 で 調 製 し リアルタイム PCR 専 用 チュ ーブに 分 注 し キャップを 軽 く 閉 めます 12 反 応 分 のマスターミックス 調 製 例 試 薬 1 反 応 当 り 12 反 応 分 2 SYBR Premix Ex Taq 12.5μl 150μl 5 Primer mix 5μl 60μl dh2o 2.5μl 30μl 2 陰 性 コントロールの 添 加 (エリア 1 で 実 施 ) 陰 性 コントロールのチューブに dh2o を 5μl 添 加 し チューブのキャップをしっかり 閉 めます 3 サンプルおよび 陽 性 コントロールの 添 加 (エリア 3 で 実 施 ) エリア 3 に 移 動 し (1)で 調 製 したサンプルおよび 陽 性 コントロールを 各 5μl 添 加 し チューブのキャップをしっかり 閉 めます
6 リアルタイム PCR 反 応 液 は コンタミネーション 防 止 のため クリーンベンチ 内 で 調 製 し ます 試 薬 は 酵 素 の 失 活 を 避 けるため アイスボックス 内 で 氷 上 で 取 り 扱 ってください (4) リアルタイム PCR の 開 始 (エリア 2 で 実 施 ) リアルタイム PCR 反 応 液 が 入 ったチューブを 軽 くスピンダウンし リアルタイム PCR 装 置 にセットし 反 応 を 開 始 します 4 結 果 の 解 析 増 幅 曲 線 と Ct 値 PCR 増 幅 の 有 無 は 増 幅 曲 線 で 確 認 します コントロール 反 応 の 結 果 が 適 切 であることを 確 認 した 上 で 測 定 対 象 サンプルの 増 幅 の 有 無 を 判 定 します 増 幅 が 認 められない 場 合 には 陰 性 と 判 定 されます ただし PCR 阻 害 物 質 による 偽 陰 性 の 可 能 性 がありますので 注 意 してください 増 幅 が 認 められた 場 合 は 次 の 融 解 曲 線 の 結 果 と 合 わせて 判 定 を 行 います 増 幅 曲 線 が 閾 値 に 達 した 時 のサイクル 数 を Ct 値 と 呼 び Ct 値 は 初 期 鋳 型 量 の 目 安 となり ます Ct 値 が 小 さい 場 合 は 鋳 型 量 が 多 く Ct 値 が 大 きい 場 合 は 鋳 型 量 が 少 なかったと 推 測 されます 融 解 曲 線 と Tm 値 PCR 増 幅 産 物 の 特 異 性 は 融 解 曲 線 で 確 認 します 陽 性 コントロールの Tm 値 と 測 定 対 象 サンプルの Tm 値 が 一 致 していれば 目 的 の PCR 産 物 が 得 られていると 推 測 され 陽 性 と 判 定 されます Tm 値 が 異 なる 場 合 は 非 特 異 的 増 幅 と 推 測 され 陰 性 と 判 定 されます
7 ( 解 析 例 ) コントロール 反 応 の 例 陽 性 コントロールは 増 幅 し 陰 性 コントロールは 増 幅 しないのが 正 しい 結 果 です SYBR Green I 検 出 の 場 合 反 応 系 によっては 陰 性 コントロールでわずかに 増 幅 が 認 められるこ とがありますが 陽 性 コントロールと 同 じ Tm 値 の 産 物 でなければ 非 特 異 的 増 幅 産 物 と 推 測 され 問 題 ありません 陽 性 コントロール 陰 性 コントロール
8 陰 性 判 定 の 例 増 幅 曲 線 で 増 幅 が 認 められても 融 解 曲 線 の Tm 値 が 陽 性 コントロールと 一 致 しない 場 合 は 陰 性 と 判 定 されます このような 結 果 になる 原 因 としては プライマー 由 来 の 非 特 異 的 増 幅 が 生 じたこと 等 が 考 えられます 陽 性 判 定 の 例 増 幅 曲 線 で 増 幅 が 認 められ 融 解 曲 線 の Tm 値 が 陽 性 コントロールと 一 致 した 場 合 は 陽 性 と 判 定 されます
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第 1 編 共 通 業 務 共 通 仕 様 書 平 成 27 年 7 月 第 1 章 一 般 1.1 目 的 業 務 共 通 仕 様 書 ( 以 下 技 研 仕 様 書 という )は 阪 神 高 速 技 研 株 式 会 社 ( 以 下 会 社 という )が 発 注 する 調 査 検 討 資 料 作 成 設 計 補 助 測 量 作 業 その 他 こ れらに 類 する 業 務 に 係 る 業 務 請 負
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接 続 検 討 回 答 書 ( 高 圧 版 ) 別 添 様 式 AP8-20160401 回 答 日 年 月 日 1. 申 込 者 等 の 概 要 申 込 者 検 討 者 2. 接 続 検 討 の 申 込 内 容 発 電 者 の 名 称 発 電 場 所 ( 住 所 ) 最 大 受 電 電 力 アクセス の 運 用 開 始 希 望 日 3. 接 続 検 討 結 果 (1) 希 望 受 電 電 力 に
- 1 - 総 控 負 傷 疾 病 療 養 産 産 女 性 責 帰 べ 由 試 ~ 8 契 約 契 約 完 了 ほ 契 約 超 締 結 専 門 的 知 識 技 術 験 専 門 的 知 識 高 大 臣 専 門 的 知 識 高 専 門 的 知 識 締 結 契 約 満 歳 締 結 契 約 契 約 係 始
部 案 参 照 文 目 1 1 持 可 能 療 険 制 構 築 国 民 険 部 9 部 11 1 5 特 別 15 6 17 7 運 確 18 8 0 9 独 立 10 - 1 - 総 控 負 傷 疾 病 療 養 産 産 女 性 責 帰 べ 由 試 ~ 8 契 約 契 約 完 了 ほ 契 約 超 締 結 専 門 的 知 識 技 術 験 専 門 的 知 識 高 大 臣 専 門 的 知 識 高 専 門
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Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズ 食品環境検査用ソフトウェア Quick Manual -QuickPrimer シリーズ用 - 目次 1. 起動と終了 2 2. 初期画面と解析タイプの選択 3 3. 実験ファイルの画面構成 3 4. 反応条件設定 (1)PCR 条件の設定 4 (2) ランの開始と進行状況の確認 5 5. サンプル設定 (1) サンプル情報の入力
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サービス説明書 - STP 10000TLEE-JP-10 / STP 10000TLEE-JP-11 / STP 20000TLEE-JP-11 / STP 25000TL-JP-30
故 障 したファンの 交 換 STP 10000TLEE-JP-10 / STP 10000TLEE-JP-11 / STP 20000TLEE-JP-11 / STP 25000TL-JP-30 1 本 書 について 1.1 適 用 範 囲 本 書 は 以 下 の 型 式 のファンの 交 換 方 法 を 説 明 しています STP 10000TLEE-JP-10 / STP 10000TLEE-JP-11
積 載 せず かつ 燃 料 冷 却 水 及 び 潤 滑 油 の 全 量 を 搭 載 し 自 動 車 製 作 者 が 定 める 工 具 及 び 付 属 品 (スペアタイヤを 含 む )を 全 て 装 備 した 状 態 をいう この 場 合 に おいて 燃 料 の 全 量 を 搭 載 するとは 燃 料
別 添 72 後 退 灯 の 技 術 基 準 1. 適 用 範 囲 等 この 技 術 基 準 は 自 動 車 に 備 える 後 退 灯 に 適 用 する( 保 安 基 準 第 40 条 関 係 ) ただし 法 第 75 条 の2 第 1 項 の 規 定 によりその 型 式 について 指 定 を 受 けた 白 色 の 前 部 霧 灯 が 後 退 灯 として 取 付 けられている 自 動 車 にあっては
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研 究 用 Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0 説 明 書 v201509da Random Primer DNA ラベリングキットは ハイブリダイゼーションに 用 いる DNA を [α- 32 P] [ 3 H] dctp を 用 いてラベルし DNA プローブを 作 製 するためのキットです A. P. Feinberg と B. Vogelstein
トラネキサム 酸 純 度 試 験 試 料 溶 液 トラネキサム 酸 の 保 持 時 間 が 約 20 分 になるように 調 整 する.. Tranexamic acid 10,000 mg/l -0.8-0.6-0.4-0.2 0.0 0.2 0.4-0.8-0.6-0.4-0.2 0.0 0.2
LC Technical Note 92 GL Sciences Inc. 日 本 薬 局 方 に 準 拠 したトラネキサム 酸 の 分 析 GL7700 HPLC シリーズを 用 いたトラネキサム 酸 の 分 析 例 です トラネキサム 酸 は 人 工 アミノ 酸 の 一 種 であり 血 液 を 溶 かして 分 解 するプラスミンの 働 きを 抑 制 する 作 用 があることから 止 血 剤 や
平 成 28 年 5 月 クドア 食 中 毒 検 査 用 試 薬 のご 案 内 日 本 では 2011 年 にクドア セプテンプンクタータによる 食 中 毒 が 報 道 されて 以 降 ヒラメの 刺 身 等 を 提 供 しないレストランや 量 販 店 が 増 加 して ヒラメの 消 費 回 復 に 対 策 が 待 たれているところです 日 本 国 内 の 養 殖 ヒラメはクドア 防 除 対 策 がなされ
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株 券 電 子 化 制 度 よくあるQ&A( 改 訂 版 ) 平 成 21 年 5 月 11 日 日 本 証 券 業 協 会 (タンス 株 ) 問 1 上 場 会 社 の 株 券 が 手 元 にあります 株 券 はどうなりますか( 株 券 電 子 化 で 何 か 手 続 は 必 要 ですか) 株 券 電 子 化 までに 証 券 会 社 を 通 じて 証 券 保 管 振 替 機 構 (ほふり)に 預
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目 次 動 作 環 境 特 長 方 法 方 法 起 動 終 了 方 法 方 法 操 作 方 法 使 方 使 方 使 方 詳 細 設 定 使 方 KINGSOFT Office 2016 動 作 環 境 対 応 日 本 語 版 版 共 通 利 用 上 記 動 作 以 上 以 上 空 容 量 以 上 他 接 続 環 境 推 奨 必 要 2 KINGSOFT Office 2016 特 長 主 特 長 以
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2 3 5 6 6 7 7 8 9 10 12 13 13 17 18 19 21 22 23 25 26 26 26 27 27 28 i
503HW 取 扱 説 明 書 2 3 5 6 6 7 7 8 9 10 12 13 13 17 18 19 21 22 23 25 26 26 26 27 27 28 i 29 29 32 32 34 34 34 36 37 37 38 39 40 40 40 44 44 44 45 47 48 48 49 50 50 50 50 52 ii 52 53 54 56 57 58 59 60 61
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5-(1)-2 高 濃 度 硫 化 水 素 削 減 のための 汚 泥 脱 気 装 置 の 開 発 計 画 調 整 部 技 術 開 発 課 廣 繁 直 治 山 下 博 史 ( 現 経 理 部 業 務 管 理 課 ) 1. 目 的 東 京 都 区 部 で は 汚 泥 処 理 の 効 率 化 を 図 る た め に 集 約 処 理 を 進 め て い る 汚 泥 の 集 約 処 理 の 進 展 と と も
する ( 評 定 の 時 期 ) 第 条 成 績 評 定 の 時 期 は 第 3 次 評 定 者 にあっては 完 成 検 査 及 び 部 分 引 渡 しに 伴 う 検 査 の 時 とし 第 次 評 定 者 及 び 第 次 評 定 者 にあっては 工 事 の 完 成 の 時 とする ( 成 績 評 定
射 水 市 建 設 工 事 施 行 に 関 する 工 事 成 績 評 定 要 領 平 成 8 年 3 月 7 告 示 第 44 号 ( 目 的 ) 第 条 この 要 領 は 射 水 市 が 所 掌 する 工 事 の 成 績 評 定 ( 以 下 評 定 という )に 必 要 な 事 項 を 定 め 公 正 かつ 的 確 な 評 定 を 行 うことにより もって 請 負 業 者 の 選 定 及 び 指
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( 別 様 式 第 4の1-1/3-) 復 興 産 業 集 積 区 域 における 研 究 開 発 税 制 の 特 例 等 ( 法 第 39 条 ) 指 定 を 行 った 認 定 地 方 公 共 法 人 の 場 合 事 業 年 度 又 は 連 結 事 業 年 度 終 了 後 団 体 の 長 の 氏 名 を 載 してく 1か 月 以 内 に 提 出 し ださい 個 人 の 場 合 事 業 年 度 ( 暦
診療行為コード
別 添 5 オンライン 又 は 光 ディスク 等 による 請 求 に 係 る 診 療 行 為 コード ( 医 科 用 DPC 用 ) 平 成 20 年 4 月 版 凡 例 1 診 療 行 為 コードは 次 により 設 定 している (1) コードの 設 定 対 象 範 囲 コードの 設 定 対 象 範 囲 は 診 療 報 酬 の 算 定 方 法 ( 平 成 20 年 3 月 5 日 厚 生 労 働
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Ⅱ 国 地 方 公 共 団 体 公 共 公 益 法 人 等 の 消 費 税 Q&A ( 問 1) 免 税 期 間 における 起 債 の 償 還 元 金 に 充 てるための 補 助 金 等 の 使 途 の 特 定 Q 地 方 公 共 団 体 の 特 別 会 計 が 消 費 税 の 納 税 義 務 が 免 除 される 課 税 期 間
は 固 定 流 動 及 び 繰 延 に 区 分 することとし 減 価 償 却 を 行 うべき 固 定 の 取 得 又 は 改 良 に 充 てるための 補 助 金 等 の 交 付 を 受 けた 場 合 にお いては その 交 付 を 受 けた 金 額 に 相 当 する 額 を 長 期 前 受 金 とし
3 会 計 基 準 の 見 直 しの 主 な 内 容 (1) 借 入 金 借 入 金 制 度 を 廃 止 し 建 設 又 は 改 良 に 要 する 資 金 に 充 てるための 企 業 債 及 び 一 般 会 計 又 は 他 の 特 別 会 計 からの 長 期 借 入 金 は に 計 上 することとなりまし た に 計 上 するに 当 たり 建 設 又 は 改 良 等 に 充 てられた 企 業 債 及