Key words: Mycoplasma pneumoniae pneumonia, immunobinding, early diagnosis, antigen detection
Table 1 Methods Antigen fixation: 10ƒÊl each sample Kill mycoplasmas: 10% buffered formalin, 10min Inactivate endogeneous peroxidase: 0.3% H2O2 in TBS, 10min Block: 10% normal horse serum, 0.02% Tween 20in TBS, 30min Anti mycoplasma serum: rabbit, polyclonal, 30min Biotinylated anti rabbit IgG: 30min Avidin-Biotin-Peroxidase Complex: 30min Developing solution: 3mg 4-chloro-1-naphtol in lml methanol, 5ml TBS, 0.01% H2O2
1278 須山 Fig. 1 Reactivity 尚史 他 on var- Fig. 3 Sensitivity (1) ious mycoplasmas 10ug 1. M. pneumoniae 2. M. genitalium each M129 G37 live organisms 1. 1 107CFU/spot 1 102 2. 1 105 1 101 1 105 1 10-1 1 104 9. PPLO 1 103 M. orale M. salivarium M. hominis M. pneumoniae PPLO Fig. 2 Reactivity Fig. 4 Sensitivity (2) cell extract on var- ious bacterias M. pneumoniae 1. 6ng/spot 2. 660pg/spot 66pg/spot cell extract 10 dilution 9. PPLO て,す べ て の 口腔 内 常 在 菌 お よ び ク ラ ミ ジ ア な ど との反 応 を 検 討 す る こ とが 重要 と思 わ れ た. 1. 2. 1 ~107CFU/spot M. pneumoniae M129 PPLO E. faecalis P. fluorescence E. coli P. aeruginosa Immunobinding の 本 法 の 感 度 をFig.3に 感度 示 し た.生 菌 を 用 い10倍 S. pyogenes 希 釈 に て 検 討 を 行 っ た が,1 104CFU/spotま E. cloacae 反 応 が 認 め ら れ た. 9. H. influenzae 10. S. 11. S. pneumoniae で 次 に 凍 結 融 解 を 繰 り 返 し て 作 製 し たcell aureus 12. ƒ -streptococcus extractを 用 い て 感 度 を み た(Fig extractは 菌 のrecoverlyは. 4).こ のcell 認 め ら れ な か った. 感 染 症 学雑 誌 第65巻 第10号
マ イ コ プ ラズ マ肺 炎 の早 期 診 断 Fig. 5 Detection throat swabs M. pneumoniae hamsters 1279 antigens in ズ マ は 細 胞 壁 を 欠 くた め β-ラ ク タ ム剤 は 無 効 で with M. あ る.そ の た め,い infected pneumoniae た ず ら に無 効 な 治 療 に よ って 経 過 が 長 引 い て い る 症 例 も散 見 され る.こ の よ う day day 7th 14th な こ とか ら,本 感 染 症 の 早 期 診 断 は 臨 床 的 に極 め て 有 意 義 で あ る. 今 回 の我 々 の検 討 の 最 大 の利 点 は,分 子 生 物 学 的 方 法 を は じめ とす る他 の方 法 と比 べ,先 ず 簡 便 で あ る こ とが 挙 げ られ る.更 に特 殊 な機 械 も必 要 とはせ ず,多 くの施 設 で 実 施 可 能 な 方 法 で あ る と 思 わ れ た. 特 異 性 に 関 し,各 種 細 菌 との 交 差 反 応 は認 め ら れ な か った が,M.genitaliumお よ びM.hominis と の間 に 交 差 反 応 が 見 られ た.実 M.hominisに め 無 視 して よ い.し か し,M.genitaliumに 1 ` swabs swab M. PPLO 際 の 臨 床 で は, よ る 呼 吸 器 感 染 症 は考 え に くい た infected non-infected pneumoniae hamsters 吸 器 感 染 症 に関 して は,我 よ る呼 々 は 以 前 本 菌 に よ る呼 hamster 吸 器 病 変 の 可 能 性 を 指 摘 し た5).従 ってM. M129 genitaliumに よ る 呼 吸 器 感 染 症 が 存 在 す る場 合 に は,今 回 の よ うな ポ リク ロ ー ナル 血 清 を 用 い て 反 応 は660pg/spotま の 本 法 に よ るM.pneumoniae感 で 認 め ら れ た. 困難 で あ り,よ 感 染 動 物 で の抗 原 検 出 こ れ ま で の 基 礎 的 検 討 を 踏 ま え,マ イ コプ ラズ マ 感 染 ハ ム ス タ ー を 用 い て 実 際 に 咽 頭 よ り抗 原 の 検 出 が 可 能 か ど う か を 検 討 した.Fig.5に 週 後 お よ び2週 後 の 結 果 を 示 し た.感 染7日 り特 異 性 の 高 い モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 を 用 い て 本 法 を 行 うか,も 後お し くはDNA probe に よ る診 断 が 必 要 とな ろ う6). 感 度 の 検 討 で は,菌 感 染1 染 症 と の判 別 は extractを 用 い て も,極 よ び14日 後 の 肺 内 菌 数 は 各 々2 106CFU/lnl,7 応 が 認 め られ た.マ 105CFU/mlで が 分 離 さ れ な いcell く少 量 の 蛋 白 量 で 陽 性 反 イ コ プ ラ ズ マ肺 炎 患 者 の咽 頭 後 は いず れ の 感 染 拭 い液 中 に は,増 殖 が 可 能 な マ イ コ プ ラ ズ マ 菌 体 ハ ム ス タ ー に お い て も 明 ら か に 陽 性 ス ポ ッ トが 認 の み な らず,増 殖 能 力 が 低 下 して培 養 して も増 殖 め られ た.感 し な い よ うな菌 や,cell あ っ た.感 染7日 染14日 後 で は,感 染 ハ ムス タ ーで ご 含 まれ て い る も の と考 え られ る.こ の よ うな こ と く僅 か に 陽 性 ス ポ ッ トが 認 め ら れ た. 考 か ら,臨 床 的 観 察 に て 本 症 が疑 わ れ た 際 に,培 養 案 マ イ コ プ ラ ズ マ 感 染 症 の 診 断 は,菌 の分離 も し くは血清 学 的 な 抗 体 価 の上 昇 の 有 無 に よ って な さ れ る.菌 debrisな どの 菌 体 成 分 が の 分 離 に は 最 低 で も7 10日 が 陰 性 で も本 試 験 で 陽 性 の結 果 が 得 られ れ ば 本 感 染 症 で あ る可 能 性 が 高 い と考 え られ た. 感 染 動 物 で の検 出 実 験 で は感 染7日 後 の 明 ら か を 要 し,抗 体 価 に つ い て も病 初 期 お よび 回 復 期 の ペ ア血 清 に な陽 性 ス ポ ッ トに 比 べ,感 染14日 後 で は 僅 か に陽 よ り そ の 上 昇 を 判 定 す る た め,こ 性 ス ポ ッ トが認 め られ た に と ど ま っ た.咽 頭 拭 い 方 法 に し て も 回 顧 的 診 断 と な る.そ れ らの いず れ の の た め,確 の な い ま ま に 治 療 を 開 始 せ ざ る を 得 ず,本 感 染症 の 治 療 の 大 き な 問 題 点 の 一 つ と な っ て い た.さ に,肺 診 ら 炎 の 治 療 の 第 一 選 択 剤 と し て 本 邦 で は β-ラ ク タ ム 剤 が 選 択 さ れ る こ と が 多 い が,マ 平成3年10月20日 イ コプラ 液 中 の 抗 原 量 が 少 量 で あ った た め と考 え ら れ た が,肺 内 菌 数 の比 較 で は 各 々2 106CFU/ml,7 105CFU/mlと 大 差 な く,こ の よ うな結 果 に な っ た 理 由 は不 明 で あ った.抗 原 量 が 少 量 で あ る と予 想 され る場 合 に は,陽 性 反 応 が 出 に く くな る こ と も
6) Hyman, H. C., Yogeb, D. & Razin, S.: DNA probes for detection and identification Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma 1) Kotani, H. & McGarrity, G. J.: Rapid and genitalium. J. Clin. Microbiol., 25: 726-728, simple identification Mycoplasmas by im- 197 munobinding. J. Immunol. Methods, 85: 257 2) Dular, R., Kajiok a, R. & Kasatiya, S.: Comparison Gen-probe commercial kit and cul- ture technique for the diagnosis Mycoplasma pneumoniae infection. J. Clin. Microbiol., 26: 1068-1069, 198 3) Bernet, C., Garret, M., Barbeyrac, B., Bebear, C. & Bonnet, J.: Detection Mycoplasma pneumoniae by using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., 27: 2492-2496, 1989. Early Diagnosis Mycoplasma pneumoniae Pneumonia by Antigen Detection Using Immunobinding Assay Naumi SUYAMA1), Mitsuo KAKU2), Hiroshi TOMITA2), Shigeru KOHNO2) & Kouhei HARA2) Department Internal Medicine, Sasebo City General Hospital 2)Second Department Internal Medicine, Nagasaki University School Medicine The possibility rapid diagnosis Mycoplasma pneumoniae infection by immunobinding is described. Immunobinding which was developed by Kotani and McGarrity is a simple and rapid method for identification mycoplasmas. Small amounts antigen were spotted onto the nitrocellurose membrane. It was treated with a specific rabbit antisera against M. pneumoniae. The antigen-antibody complex was visualised with the avidin-biotin horseradish peroxidase method. Cross reaction was seen between M. pneumoniae and M. genitalium. Throat swabs from hamsters infected with M. pneumoniae were positive on 7th and 14th day after infection. Although the cross reaction was seen between M. pneumoniae and M. genitalium, this method could be useful for rapid diagnosis M. pneumoniae infection.