Ⅰ 2 蛋白質 核酸 酵素 Vol.45No 10 2000 化 に お け る 機 能 を 中 心 に紹 介 す る TD抗 たB細 原 に よ る刺 激 を受 け 胞 は 末 梢 リンパ 組 織 に 集 積 し まずT細 胞領 域 であ る動 脈 周 囲 リ ンパ 鞘 periar- teriolar lymphoid sheath; PALS で 活 性 化 され る こ こ で2通 りの 分 化 経 路 に 分 か れ る 一 部 の細 胞 は直 接 抗 体 産 生細 胞 図1 胚 中 心 で のB細 抗 原 特 異 的B細 ほ と ん ど の 抗 体 の ク 胞選択 胞 はT細 胞 領 域 で あ るPALSに ラ ス はIgM て 活性 化 され セ ン トロ ブラ ス トに な り胚 中 心 ブ ラス トは セ ン トロ サ イ トに分 化 し 明 帯 に てFDCやCD4 T細 に 分 化 し い わ ゆ るPALS-associated の 暗 帯 で活 発 な細 胞 分 裂 を く り返 す こ の領 域 で体 細胞 突 然 変 異 を受 け る そ の 後 セ ン トロ 胞 か ら の刺 激 を受 けて 高 親 foci を形 成 す る そ の 他 の 多 くの 和 性 のIg分 子 を も つ ク ロ ー ン の み が選 択 され その 後 抗 体 産 生 細 胞 や 記 憶B細 胞 に分 化 して い く CB セ ン トロ ブ ラ ス ト CC セ ン トロサ イ ト T CD4 T細 胞? ア ポ トー シ ス に 細 胞 はB細 陥 っ た細 胞 内 に移 動 し 急 速 な細 胞 分 裂 胞 領 域 で あ る濾 胞 に よ っ て 胚 中 心 を 形 成 す る 分 化 し あ る もの は記 憶B細 胞 に分 化 し 次 回 の抗 原 刺 激 に 素 早 く反 応 で き る よ う に し て い る4 初 回 免 疫 の 一 次 応 答 の 場 合 抗 原 の 投 与 後 約7日 目で 胚 中 心 の構 造 が 確 認 され るが 追 加 免 疫 の 二 次 応 答 の こ の よ うに胚 中 心 に 関 す る研 究 は 抗 原 特 異 的B細 場 合 は 免 疫 後2 3日 とい う短 期 間 で よ り明 らか な胚 中 胞 に ① 親 和 性 の 成 熟 ② ク ラ ス ス イ ッ チ ③ 記 憶B 心 形 成 が 見 られ る そ の 後 は約2週 細 胞 へ の 分 化 を誘 導 す る機 構 を 理 解 す る う えで 非 常 に 消 退 し て い く in situで 胚 中 心 を同 定 す る 際 peanut 重 要 で あ り 成 熟B細 agglutinin PNA 胞 分 化 の場 と して 最 も注 目 さ れ て い る 分 野 で あ る 筆 者 ら は 胚 中 心 で のB細 胞分 化 成 熟 の 分 子 機 構 を 明 ら か に す る 目 的 で 胚 中 心 のB細 間 ほ どで胚 中心 は との 結 合 性 が 用 い られ て い るが 最 近 は これ に 加 え て細 胞 周 期 関 連 分 子Ki-67の 発 現 も用 い られ て い る 胞 で 発 現 が 上 昇 して い る 分 子 の 同 定 を行 な って きた そ 胚 中 心 内 で の 最 初 の ス テ ップ と して Ig分 子 の 表 面 の結 果 胚 中 心 と くに セ ン トロ サ イ トが 存 在 す る明 発 現 が 減 少 し た セ ン トロ ブ ラ ス ト と よ ば れ る 細 胞 が 暗 帯 で 発 現 が 上 昇 し て い る新 規 核 内 因 子GANP ger 帯 を形 成 し この 段 階 でIg分 minal 然 変 異 が 高 頻 度 に起 こ る い まか ら9年 前 にJacobら center-associated nuclear protein を 見 い だ し そ の構 造 を 決 定 し た5 に よ っ て 胚 中 心 で は高 率 にIg分 本 稿 で は 現 在 ま で に 明 らか に な っ て い る胚 中 心 の 分 子 機 構 につ い て概 説 し さ らにGANPのB細 胞活 性 dendriti GANP:germinal center-associated 子 を 細 胞 表 面 に 出 した セ ン トロ サ イ トに分 化 の 免 疫 複 合 体 を認 識 す る こ こで 抗 原 に親 和 性 の 高 いIg分 ccell maintenance nuclear protein 子 を 表 面 に もつ 細 胞 だ けが選 択 され て 抗 体 産 生 細 胞 や 記 憶B細 胞 に分 化 す る よ う に 選 別 され る 親 和 性 の 高 くな いIg分 子 を 発 現 す るセ ン トロ サ イ agglutinin トは再 び セ ン トロ ブ ラ ス トに戻 り 新 た にV領 1696 域 号 FDC:follicular PNA:peanut のV領 に体 細 胞 突 然 変 異 が 起 こっ て い る こ とが 示 さ れ た6 続 し FDC上 MCM:minichromosome 子 のH鎖 い て セ ン ト ロ ブ ラ ス トは 明 帯 に 移 動 し 突 然 変 異 を受 け たIg分 略 子 可 変部 領域 の体細 胞突 域 の突
6 蚤 白質 核酸 酵 素 Vol.45 No 10 2000 こ とが 知 られ て い る MCM複 合 体 は出 芽 酵 母 のMCM変 体 の 解 析 か ら DNA複 異 製開 始 に 必 須 な分 子 で あ る こ とが 明 らか に され て い る 以 前 よ りア フ リ カ ツ メ ガ エ ル を 用 い た 系 で 1回 の 細 胞 分 裂 で1 度 の ゲ ノ ムDNA複 製 を保 証 す る ラ イ セ ン ス 因 子 replication licensing factor の 存 在 が提 唱 されて い たが これ ま で の研 究 で こ の ラ イ セ ン ス 因 子 の中心 的役割 を果 たす のが MCM複 合体 で あ る こ とが明 らか に されて い る35 真核 生 物 の 複 製 に か か わ る 因 子 と して まず 複 製 開 始 領 域 に 結 合 す る ORC(origin recognition complex が あ る ア フ リカ ツ メ ガ エ ル 卵 無 細 胞DNA複 製 系 の 解 析 か ら 複 製 可 能 な 染 色 体 の 形 成 に は まず 染 色 体 上 にORCが Cdc6が 結 合 し 次 に 最 後 にMCMが 結 合 す る こ とが 必 要 で あ る36) い っ た ん 複 製 が 進 行 す る と Cdc6とMCM複 合体 は クロ マ チ ン か ら遊 離 し 細 胞 周 期 図3GANP分 子 の 胚 中心 に おけ る発 現 上 昇 a 正 常 マ ウス の バイエ ル板 の 凍 結切 片 を抗GANP抗 と抗IgD抗 体 とで二 重 染色 した GANPの 細 胞 はB220陽 性IgD陰 性 であ っ た この 表 現 型 は胚 中心B細 ジ赤 血 球 を免 疫 した 脾 臓 凍 結 切 片 を抗GANP抗 色 した GANP陽 性 細 胞 は 明 帯 でFDCに 2321-2328 2000 体 29-15mAb 性 胞 の 表 現 型 と一 致 する b ヒツ 体 29-15mAb PNA 抗BrdU抗 体 とで三 重 染 性 細 胞 は 胚 中 心 の なか で もセ ン トロサ イ トが 多い 明 帯 に発 現 して い た c ヒ ツ ジ 赤血 球 を 免 疫 した 脾 臓 凍 結 切 片 を抗GANP抗 た GANP陽 体 29-15mAb と抗B220抗 発 現 は バ イ エル 板 胚 中心 の 中央 部 に認 め GANP陽 体 29-15mAb)と 抗CR1抗 体 とで 二 重 染 色 し 取 り囲 まれ る よ う に 存 在 し て い た 文 献5 Blood 95 よ り許 可 を得 て転 載 が 完 了 す る まで 再 び 複 製 領 域 に結 合 す る こ とは で き な い MCM複 合 体 の ク ロマ チ ンか らの遊 離 には リン酸 化 が 重 要 な 役 割 を果 た して い る こ とが 示 されて い る37) 哺 乳 動 で あ る 上 述 し た よ う に GANPとMap80の 物 培 養 細 胞 を 用 い た 実 験 で は MCM2とMCM3がS GANPが 期 の 進 行 と と も に リ ン酸 化 が 起 こ る こ とが 報 告 さ れ て され た そ こ で まず 抗 体 を 用 い た 共 沈 実 験 を 行 な っ お り ク ロ マ チ ンか ら遊 離 したMCM複 た な お 29-15mAbは 合 体 は脱 リン 酸 化 された の ち ク ロマ チ ンに結合 で き るよ うにな る 細 胞 内 でMCM3分 相 同性 か ら 子 と会 合 す る こ とが 示 唆 免 疫 沈 降 が で き な い抗 体 の た め GST-GANP 579 1,028ア ミノ 酸 融 合 蛋 白 質 と考 え ら れ る MCM2とMCM3がCdc7 Dbf4のin を作 製 後 ラ ッ トに 免 疫 して 新 た な抗GANPモ vitroで の リン酸 化 基 質 にな る こ とが知 られ て い るが 最 ー ナ ル 抗 体42-23を 近Hunterら 細 胞 のNP-40可 溶 化 物 を 抗GANP抗 し 抗MCM3抗 体 で ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ ト した と こ ろ はCdc7 Dbf4がin 酸 化 す る ことを示 した38 MCM複 vivoでmcm2を リン 合 体 の構 成 分 子 をin で リ ン酸 化 す る酵 素 が 何 で あ る か は まだ 明 らか vivo に され て い な い が DNA複 1700 製 を考 え る う えで 非 常 に重 要 得 た マ ウ スB細 分 子 量 約100KのMCM3分 とMCM3の ノクロ 胞 株WEHI-231 体 で 免疫 沈 降 子 のバ ン ドを認 め GANP 物 理 的 会 合 が 確 認 され た さ ら に COS-
胚中心の分子生物学 7細 胞 にFLAGで タ ギ ング したgangとHAで グ したMCM3両 7 タギ ン 方 の 遺 伝 子 を 導 入 した 共 沈 実 験 で も GANPとMCM3の 会 合 を認 め 細 胞 内 に お け る GANPとMCM3の 結 合 が 明 らか と な っ た 次 に GANPの ど の 領 域 でMCM3と GANPの 種 々 の 欠 失 変 異 体 をGSTと 会 合 して い るの か を し て発 現 さ せ こ れ ら を 用 い たpull 調 べ た GANPとMap80と C末 端 側 がMCM3と の融 合 蛋 白質 と down assayに て の相 同 性 か ら GANPの の結 合 に 重 要 で あ る こ と は当 初 予 想 した とお りで あ っ た D 胚 中 心 に お け るB細 GANPの 胞 増 殖 活 性 化 とMCM3 役割 抗GANPモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 29-15mAb を用 い て 腸 管 の リ ンパ 組 織 で あ るパ イ エ ル 板 の 凍 結 切 片 を 免 疫 染 色 す る と 胚 中 心 と思 わ れ る 領 域 に 陽 性 シ グ ナ ル が 見 られ 種 々 の マ ー カ ー と と も に二 重 染 色 を す る と 29-15陽 示 した 性 細 胞 はPNA B220 IgD-の 表現型 を 図3a 5) した が っ て 29-15mAbで れ る細 胞 は胚 中 心B細 図4 MCM3分 子 の胚 中心 に おけ る発現 上 昇 ヒツジ 赤血 球 を免 疫 した脾 臓 凍 結 切 片 を抗MCM3抗 体 抗MCM3抗 体 と抗CR1抗 体 とPNAと で 二 重 染 色 した こ こ で は 示 さ な い が 非 免 疫 状 態 で はMCM3の 発 現 は ほ とん ど認 め な い 胚 中 心 に お け るMCM3の 発 現 上 昇 は GANPと は異 な り 胚 中 心 全 体 に 見 られ た 染色 さ 胞 で あ る こ とが 示 さ れ た この ど発 現 して いな か った39) MCM蛋 白質 の 発 現 は増 殖 し こ と を さ ら に 確 認 す る た め に 脾 臓 胚 中 心 で も同 様 に て い る 細 胞 に 強 い発 現 が 見 ら れ 分 化 し て い る細 胞 で 陽 性 シ グ ナ ル が 検 出 さ れ るか を 検 討 し た ヒ ツ ジ赤 血 は 発 現 を認 め な い と い う複 数 の 報 告 が あ り 胚 中 心 に 球 をBALB cマ ウ ス に 免 疫 し 7日 後 の 脾 臓 凍 結 切 片 お け るMCM3分 を29-15mAbお よ びPNAで ン トロ ブ ラ ス トと 関 連 が あ る こ と が 予 想 され た 免 疫 染 色 した この 場 合 もバ イ エ ル板 同 様 胚 中 心 に一 致 す る よ うにGANP陽 性 細 胞 を認 めた 子 の 発 現 上 昇 は細 胞 増 殖 す なわ ち セ E GANP分 図3b 興 味 あ る こ とにGANP陽 性 子 発 現を誘 導 す る シグナ ル 胚 中 心 でGANPの 発 現 が 増 強 す る と い う こ とを in 細 胞 は胚 中 心 全 体 で は な く 明 帯 に比 較 的 強 く見 られ vitroで も再 現 で き るか ど う か マ ウ ス脾 臓B細 た ま た 抗CR1抗 の マ イ トジ ェ ン で 刺 激 してGANPの 発 現 上 昇 を細 胞 内 染 色 で調 べ た そ の 結 果 CD40か ら の シグ ナ ル に よ っ 陽 性 細 胞 はFDCに 体 と の 二 重 染 色 の 結 果 GANP 取 り囲 まれ る よ う に存 在 す る こ とが わ か り セ ン トロ サ イ トで 発 現 が 選 択 的 に上 昇 し て い てGANPの る こ とが 強 く示 唆 さ れ た らに CD40と 図3c 上 述 の よ う にGANPとMCM3の 会 合 が 見 られ た の で 次 に胚 中 心 にお いてMCM3分 子 の 発 現 が 上 昇 して い る か を 調 べ た ヒツ ジ赤 血 球 をBALB cマ 疫 し た7日 PNA,抗MCM3抗 ウスに免 後 の 脾 臓 凍 結 切 片 を 抗MCM3抗 体 と抗CR1抗 体 と 体 を用 いて 二 重 染 色 した そ の 結 果 正 常 脾 臓 組 織 にお い てMCM3の が ほ と ん ど見 られ な い の に対 し MCM3の 発現 胚 中心 にお IL-4レ 発 現 が 強 く誘 導 され る こ とが 示 され た さ 抗 原 レ セ プ タ ー か ら あ るい はCD40と セ プ タ ー か ら の シ グ ナ ル はCD40単 さ ら にGANPの CD38と 抗 原 レ セ プ タ ー か ら の シ グ ナル は 細 胞 増 殖 は誘 導 す る も の の GANPの サ イ トはFDCか らの シ グナ ル を受 け て GANPの 異 な り胚 中 心 全 体 で 発 現 が 上 昇 して い た Musahlら は BはGANPの 発 現 は 強 く 上 方 の 分 化 した 領 域 で はMCM3は ほ とん 発現 を誘 導 して い る可 能 性 が 考 え られ た 図5 この 発 現 誘 導 シ グ ナ ル はOCA-Bの れ に よ る と基 底 部 の細 胞 増 殖 が 盛 んな 領 域 にMCM3の 発 現 誘 導 は それ ほ ど見 られ な か った 筆 者 ら 未 発 表 こ れ らの 結 果 か ら セ ン トロ は 発 現 を検 討 して い るが そ 独 に比 べ て 発 現 を 増 強 さ せ た これ に 対 し て け る 発 現 上 昇 を認 め た 図4 51 しか し GANPと ヒ ト表 皮 組 織 で のMCM3の 胞 を種 々 場 合 とよ く似 て い るが OCA- よ うに セ ン トロサ イ トで 発 現 が 上 昇 す るわ け で は な く 胚 中 心 全 体 で そ の 発 現 が 増 強 す る40 CD40欠 損 マ ウ ス の 解 析 か ら CD40-CD40Lの 相互 作 用 は胚 中 心 形 成 や ク ラ ス ス イ ッ チ に必 要 で あ る こ と 1701