第 185 回 農 林 交 流 センターワークショップ 植 物 科 学 作 物 育 種 におけるフェノーム 解 析 - はじめて 画 像 解 析 を 行 う 研 究 者 のための 入 門 実 習 - ImageJ を 使 った 画 像 解 析 実 習 2 値 化 領 域 抽 出 2014-10-03 9:15-10:30 ( 実 習 75 分 ) 朽 名 夏 麿 1,2, 湖 城 恵 1,2, 林 世 莉 3, 相 阪 有 理 2 1. 東 京 大 学, 2. エルピクセル( 株 ),3. 東 京 理 科 大 学
基 本 画 面 とメニューの 構 成
ImageJ のメニュー と 画 像 解 析 の 流 れ 大 雑 把 な 流 れ 画 像 処 理 1 画 像 処 理 2 cf. 実 験 のプロトコル, 料 理 のレシピ
ImageJ の 基 本 画 面 画 像 タイトル 画 像 情 報 (サイズ 等 ) 画 像 ウインドウ メニューバー ツールバー ステータスバー タバコBY-2 液 胞 膜 ツールバー 赤 い 三 角 形 の 付 く アイコンは 右 クリック で 機 能 切 り 替 え 可. 赤 い 線 : 頻 用 するもの. 青 い 線 : selection (ROI). http://rsb.info.nih.gov/ij/docs/tools.html
File メニュー: ファイルの 読 み 込 み 書 き 込 み 等 New: 新 規 作 成. System Clipboard で 他 アプリから 画 像 の ペーストができる. Open...: 画 像 ファイル 等 を 開 く. Import: 各 種 フォーマットのファイルを 開 く. Save: 画 像 ウインドウの 内 容 をファイルに 保 存 する. 保 存 するまで 画 像 データを 変 更 しても ファイルは 書 き 変 わらない.
Edit メニュー: 画 像 の 切 り 貼 り, 描 画 Undo: 直 前 の 作 業 の 取 消 し. 1ステップ 限 定 かつ 一 部 のみ 対 応. Cut, Copy, Paste: 画 像 の 切 り 貼 り. 対 象 は 画 像 全 域 かROI. Copy to System: 他 アプリへのコピー. Clear, Fill, Draw: 単 色 描 画. Color Pickerで 色 は 設 定. Selection: ROI の 制 御. (Selection = ROI) Add To Manager: 複 数 のROI を 管 理.
Image メニュー: 種 別, 色,スタック, 変 形, 複 製 等, 色 々 Type: 輝 度 タイプの 変 換. 8-bit, 16-bit, 32-bit, RGB color... Adjust: 表 示 上 の 明 るさの 調 整 や 二 値 化 等. Color: グレイスケール 画 像 とカラー 画 像 の 変 換 等. Stacks: 時 系 列 画 像 ( 動 画 像 ), 立 体 画 像 の 処 理. 輝 度 投 影,スライス 一 覧 (montage) の 作 成 等. Crop: ROI 部 分 の 切 り 出 し. Duplicate: 画 像 ウインドウの 複 製. Rename: 画 像 ウインドウのタイトル 変 更. Scale: 画 像 解 像 度 の 変 更.つまり 画 像 サイズ の 拡 大 縮 小. 表 示 の 拡 大 縮 小 と 混 同 しないよう 注 意.
Process メニュー: 基 礎 的 な 画 像 処 理 (フィルタ 等 ) Find Edges: 輪 郭 強 調. Binary: 2 値 画 像 ( 白 黒 画 像 ) 処 理. Math: 加 減 乗 除 等 による 各 画 素 の 輝 度 変 更. Filters: ノイズ 抑 制 等 のフィルタ. Image Calculator: 画 像 と 画 像 の 間 の 演 算. 加 減 乗 除 等.
Analyze メニュー: 測 定 やグラフ 関 係 Measure: ROI 部 分 の 諸 パラメタの 測 定. Analyze Particles...: 粒 子 解 析. Set Measurements...: 'Measure' で 測 定 する パラメタの 選 択. Set Scale...: 1 画 素 が 何 µm かを 設 定 する. Histogram: 輝 度 ヒストグラムの 表 示. Plot Profile: 輝 度 プロファイルの 表 示. 他 のメニュー Plugins: プラグイン,マクロ,ショートカット キー 設 定 等. Window: 画 像 ウインドウ,ログウインドウ 等 の 一 覧 や 並 び 換 え. Help:ブラウザにウェブ 上 のマニュアルを 表 示 する 等.
デジタル 画 像 の 基 本
159 画 素 と 画 素 数 画 像 情 報 : 159x153 pixels; 8-bit; 24K 153 + キーで 拡 大 - キーで 縮 小 (3200%) : 拡 大 縮 小 率 * Voxel * Binning 画 素, pixel (picture element) 画 像 ウインドウ 左 上 に 青 い 枠 が 表 示 されている 場 合, ウインドウに 画 像 全 域 が 収 まっていない. 現 在 表 示 されている 部 位 が, 画 像 全 域 のどこに 相 当 する かを 示 している.
座 標 系 と 画 素 と 輝 度 画 像 情 報 : 159x153 pixels; 8-bit; 24K (3, 0) 輝 度 30 x (x,y) = (0, 0) 輝 度 35 (3, 2) 輝 度 21 y ImageJ では 左 上 を 原 点 (0, 0)とし, 右 に X 軸, 下 にY 軸 が 伸 びる 各 画 素 には 輝 度 ( 強 度,intensity. 明 度 brightness とも 言 う) が 割 り 当 てられている. 0 から 数 えること 左 上 が 原 点 であること に 注 意.
153 159 座 標 系 と 画 素 と 輝 度 File > Save As > Text Image... (3, 0) 輝 度 30 x (x,y) = (0, 0) 輝 度 35 (3, 2) 輝 度 21 y 159 列 Excel で 開 いた 例 表 示 を 縮 小 153 行
153 159 座 標 系 と 画 素 と 輝 度 File > Save As > Text Image... (3, 0) 輝 度 30 x (x,y) = (0, 0) 輝 度 35 (3, 2) 輝 度 21 y 159 列 Excel で 開 いた 例 表 示 を 縮 小 153 行
PowerPoint 等 での 強 拡 大 に 注 意 補 間 なし PowerPoint で 拡 大 PowerPoint や Photoshop 等 で 補 間 を ともなう" 強 拡 大 "をするとデジタル 的 な 解 像 度 や 分 解 能 と 関 係 なく 擬 似 的 にズームしたようになるが, 解 像 度 や 分 解 能 が 上 がる 訳 ではない. データ 解 釈 を 誤 らないよう 注 意. 補 間 あり
Brightness & Contrast による 表 示 状 態 の 変 更 ( Shift + c キー) 真 っ 白 真 っ 黒 スライドバーを 動 かすことによる 調 整 は, 表 示 上 の" 明 るさ"を 変 えているに 過 ぎない. 輝 度 は 変 化 しない. 8-bit 画 像 の 場 合 は Apply ボタンを 押 すことによって,その 時 の 表 示 範 囲 が0~255にスケールされる. 輝 度 が 変 化 する.
ImageJ で 最 初 に(?)とまどう 所 Brightness & Contrast や Image > Lookup Tables による 見 ため の 変 化 は, 画 像 データの 加 工 を 必 ずしも 意 味 しない. ImageJ における 操 作 の 多 くは - 読 み 込 んだ 画 像 データを 加 工 するもの Image > Transform > Rotate... など - ImageJ 上 での 表 示 の 仕 方 を 変 えるもの Image > Zoom >... など に 大 別 できる. サイズ: Image > Scale... Image > Zoom >... 明 るさ: Process > Enhance Contrast Image > Adjust > Brightness & Contrast
輝 度 ヒストグラム ( h キー ) h 位 置 情 報 を 無 視 した 上 で, 全 画 素 について 輝 度 の 分 布 を 可 視 化 したもの. 輝 度 の 基 本 的 な 統 計 量 ( 最 小, 最 大, 平 均, 標 準 偏 差 等 )も 表 示 されている.
輝 度 ヒストグラム ( h キー )
輝 度 プロファイル (k キー) 線 分 上 の 輝 度 を 形 (プロファイル) として 可 視 化. 横 軸 が 距 離 or 位 置, 縦 軸 が 輝 度. 多 重 蛍 光 標 識 像 から 局 在 関 係 を 示 す 直 観 的 手 法.
輝 度 プロファイル Plugins > Graphics > RGB Profile Plot RGB 信 号 のうち 主 に Blue が 果 皮 の 位 置 により 変 化 していることがわかる.
Higaki T et al. (2006) Plant Cell Physiol 47(7): 839-852.
輝 度 のタイプ 輝 度 のデータ 型. ビット 深 度 (bit depth), bits per pixel, 量 子 化 ビット 数 等 とも 呼 称. (0, 0) 輝 度 35 (3, 0) 輝 度 30 (3, 2) 輝 度 21 グレイスケール 画 像, 濃 淡 画 像 8-bit: 0~255 の 整 数 (integer) 16-bit: 0~65535 の 整 数 (integer) 32-bit: 浮 動 小 数 点 数 (float) 実 数 の 近 似 値.±3.4*10 38 の 範 囲 で7 桁 位 の 精 度. カラー 画 像 白 黒 画 像 8-bit Color: 使 わない. RGB Color: 赤 緑 青 の3チャネルを 重 ねることによるカラー 表 現. 各 チャネルのデータ 型 は8-bit, 16-bit, 32-bit のいずれかで, チャネル 間 では 統 一 されている.
輝 度 のビット 深 度 グレイスケール 画 像, 濃 淡 画 像 白 黒 画 像 8-bit: 0~255 の 整 数 (integer) 16-bit: 0~65535 の 整 数 (integer) 32-bit: 浮 動 小 数 点 数 (float) 実 数 の 近 似 値.±3.4*10 38 の 範 囲 で7 桁 位 の 精 度. 8 bits/pixel 輝 度 255 0 2 8 =256 段 階 位 置 (pixel) 原 画 像 のビット 深 度 はカメラによって 異 なる. 顕 微 鏡 用 のモノクロカメラでは 8~16 bits グレイスケール /pixel デジタルカメラやスキャナでは 8 * 3 bits RGB /pixel 12 bits/pixel (2 12, 0~4095) や 14 bits/pixel (2 14, 0~16383)の カメラで 得 た 画 像 は 16 bits/pixel の 画 像 フォーマットとして 扱 う. 画 像 処 理 的 には 内 部 で 32-bit (float) を 用 いることも 多 い ( 浮 動 小 数 点 数 やマイナスの 値 が 扱 えるので).
画 像 情 報 の 修 正 (ビット 深 度,スケール 情 報 ) ビット 深 度 : Image > Type スケール 情 報 : Analyze > Set Scale...
この 章 のまとめ: デジタル 画 像 の 基 本 まず 解 析 対 象 をさまざまな 見 方 で 見 よう. 表 示 上 の" 明 るさ"をさまざまに 設 定 し, 必 ず 一 度 は サチる 状 態 までコントラストを 上 げる. Shift + c キー ズーム 機 能 によって, 必 ず 画 素 の 大 きさが 認 識 できる 倍 率 まで 拡 大 する. + キーで 拡 大,- キーで 縮 小 回 転 (Image > Transform), 白 黒 反 転 や 擬 似 色 表 示 (Image - Lookup Tables -...)も 有 効. 画 像 処 理 画 像 解 析 の 基 本 的 概 念 を 覚 えておこう. 画 素 (pixel), 輝 度 (intensity),ビット 深 度 (bit depth), 輝 度 ヒストグラム(intensity histogram), 輝 度 プロファイル(intensity profile)
二 値 化 領 域 抽 出
手 作 業 でのROI 設 定 を 介 した 形 状 解 析 : 長 さ t Excel 等 にペースト or テキストファイルに 保 存 して R スクリプトで 統 計 処 理 等. 線 分 や 曲 線 をマウスで 引 き, t キーで ROI Manager に 登 録,を 繰 返 す. ROI Manager の Show All をチェックしておくと 見 やすい. Measure ボタンで 登 録 済 の ROI 全 部 をまとめて 測 定. 角 度 や 長 さ( 画 素 単 位 )が 得 られる. Excel 等 でμmに 変 換 し, 統 計 処 理. ROI: region of interest, 関 心 領 域, 注 目 領 域
手 作 業 でのROI 設 定 を 介 した 形 状 解 析 : 面 積 or t 測 定 項 目 は Analyze > Set Measurements... で 決 定. 測 定 対 象 領 域 をマウスで 指 定 し, t キーで ROI Manager に 登 録 を 繰 返 す. Measure ボタンで 測 定.
二 値 化 による 領 域 抽 出 ( Shift + t キー) 二 値 画 像 ( 白 黒 画 像 ) グレイスケール 画 像 ( 濃 淡 画 像 ) or 蛍 光 像 の 場 合, 高 い 輝 度 の 領 域 が 測 定 対 象 領 域 の 場 合 が 多 い. 閾 値 となる 輝 度 を 決 め, 二 値 画 像 ( 白 黒 画 像 ) に 変 換 することで, 領 域 抽 出 ( 領 域 分 割, segment)ができる. ではどのように 閾 値 を 決 めればいいのか?
作 業 者 の 感 覚 が 頼 り. 同 じ 人 が 作 業 しても, 閾 値 が 同 じになるとは 限 らない( 部 屋 やモニタ の 明 るさの 影 響 など). 人 間 の 目 視 による 閾 値 決 定
自 動 閾 値 決 定 Threshold ウインドウでは, 人 間 による 閾 値 決 定 だけでなく 自 動 閾 値 決 定 もできる. 右 図 のように, 複 数 のアルゴリズムから 選 択 する. いずれも 輝 度 ヒストグラムをもとに ある 明 るさ を 閾 値 として 背 景 と 背 景 ( 解 析 対 象 )を 分 ける. 画 像 自 体 と 解 析 対 象 に 関 する 輝 度 分 布 の 性 質 によって, 適 切 なアルゴリズムは 異 なる. 形 状 情 報 は 用 いていない. 前 処 理 による ヒストグラム 形 状 の 変 化