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- たみえ むらかわ
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1 Japanese Journal of Transfusion Medicine, Vol. 39. No. 4 39(4): , 1993 COMPARISON OF THE SENSITIVITY OF ABC-MACE, MACE, MAIPA AND FCM FOR THE DETECTION OF ANTI-PLATELET ALLOANTIBODIES Satoru Kosugi, Yoshiaki Tomiyama, Hirokazu Kashiwagi, Yoshio Kanayama, Yoshiyuki Kurata1) and Yuji Matsuzawa The Second Department of Internal Medicine, Osaka University Medical School 1) Department of Blood Transfusion, Osaka University Hospital Recently, antigen-specific assays for detecting anti-platelet alloantibodies have been available: immunobead assay, modified antigen capture ELISA (MACE) and monoclonal antibody-specific immobilization of platelet antigens (MAIPA). These assays are based on essentially the same principle. In this study, using anti-hpa-la and anti-hpa-4a antibody, we have compared the sensitivity of MACE using avidin-biotin-complex method (ABC-MACE), MACE, MAIPA, and flowcytometry (FCM) as a conventional method. The sensitivity of MACE for detecting anti-hpa-la antibody was twofold better than that of MAIPA, while the sensitivity of MAIPA for detecting anti-hpa-4a antibody was twofold better than that of MACE. Using ABC-method, the sensitivity of MACE for detecting anti- HPA-la and anti-hpa-4a increased 8-fold and 64-fold, respectively. In comparison with FCM, ABC- MACE showed almost the same sensitivity for detecting anti HPA-4a antibody, and showed better sensitivity for detecting anti HPA-la antibody. These data demonstrate that ABC-MACE is much more sensitive than MACE or MAIPA for detecting anti-platelet alloantibodies, and that the sensitivity of ABC-MACE is comparable to that of FCM.
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3 722 Japanese に て 非 特 異 的 結 合 を ブ ロ ッ ク し た 後, を100μlず 同 様, つ 加 え 室 温1時 製)を1: 加 え 室 温1時 ALP量 上 記Iysate MACE 識 ヤ ギ 抗 ヒ トIgG抗 anti-hpa-1a anti-hpa-4a 体 1, 000に 希 釈 し て100μlず つ 再 び6回 の 間 反 応, Medicine, Vol. 39. No.4 間 反 応 さ せ た.MACE 6回 洗 浄 後, ALP標 (Sigma社 Journal of Transfusion 洗 浄 後, well側 を 測 定 し た. 5. FCMに よ る蛍 光 抗 体 法 上 記3方 法 と 同 様 に し て106/μlの 液100μlを 作 成, さ せ た 後, citrate buffer 血 小板 浮 遊 抗 血 清 を 加 え て 室 温1時 に て3回 洗 浄, 間反 応 100μlの MAIPA TBSに 抗体 再 浮 遊 さ せ てFITC標 (Tago社 製) 反 応 さ せ た.1回 し, FACScan を1: 識 ヤ ギ 抗 ヒ トIgG 200の 希 釈 で 加 え, 洗 浄 後, 500μlのTBSに (Becton-Dickinson 蛍 光 強 度 を 測 定, 再 浮遊 社 製) を 用 い て, 10, 000個 の デ ー タ をconsort30 に よ り解 析 し, mean channel を 算 出 した. 以 上 の 測 定 は, い ず れ も duplicate 常 血 清3例 30分 で 行 っ た.正 の 測 定 値 を 対 照 と し, そ の 平 均+3SD 以 上 を 陽 性 と判 定 し, 検 出 感 度 を 比 較 し た. 結 1. MACE 図1 と MAIPA にMACE い る.両 者 は, 抗 マ ウ スIgGの 図2 MACEお よびMAIPAに よ る 抗HPA 1a, 抗 HPA-4a抗 体 の検 出成 績.影 付 きの 部 分 は正 常 血清 果 の比較検 討 と MAIPA 平均 ±3SDの 範 囲を 示 す. の 測 定 原 理 を 示 して 基 本 的 に は 同 じ 原 理 で あ り, ヤ ギ 分 だ け MAIPA の 方 がMACE ABC-MACEの に 比 べ 反 応 さ せ る 抗 体 が 多 い こ と が わ か る. 図2に, 抗HPA-1a a(抗yukb)を MAIPAの MACEで (抗PlA1) よ び 検 出 感 度 を 検 討 し た 成 績 を 示 す. は 抗HPAllaお よ び も, 2, 5μlま で 検 出 可 能 で あ っ た.一 で は, 抗HPA-1aは5μlま 出 不 可 能 で あ っ た が, 体 と 方, MAIPA で 検 出 可 能, 2.5μlで 抗HPAl4aは1.3μ1ま 成 績 を 図3に り, 正 常 血 清 のO.D.は, お よ び 抗HPA-4 段 階 希 釈 し てMACEお の 間 に 差 が 認 め ら れ ず, 測 定, 検 出 が 不 可 能 で あ っ た. 検 で検 した が, 抗 血 清 の0.D. らに 希 釈 し て の検 討 に て, 抗HPA-4aは0.04μ1ま で 検 出 可 能, 0.02μl で は 検 出 不 可 能 で あ っ た (デ ー タ 省 略).こ よ り, ABC-MACEはMACEよ 8倍, に よ る検 出 は不 可 能 で あ った (デ-タ 省 略). 考 え ら れ た ま た, 図2か ら も 分 か る よ う に, びMAIPAの0.D.が 低 い た め, の 感 度 を 上 げ る た め, 体 を 体 に 変 え, ABC法 に て 検 出 し た.し か し, ABC-MAIPAに 正 常 対 照 もO.D.が2.0を 次 に これ ら の 系 ヤ ギ 抗 ヒ トIgG抗 b童otin標 識 ヤ ギ 抗 ヒ トIgG抗 よ 越 え, つ い て は, 抗 血 清 のO.D.と の こと り抗HPA-1aで 抗HPA-4aで64倍 HPA-1aで16倍, 全 体 にMACEお に増加 μlで も 検 出 可 能 と な っ た.さ はMAIPA の検 出 感 度 約4倍 で, ま た 抗HPA-4aは μlで ABC-MACE MACEの に よ の 著 明 な 増 加 が 認 め ら れ, 抗HPA-1aはOl3μlま 出 し得 た.な お 抗HPA-4aは, 2. 示 す, ABC法 検 出感 度 が優 れ て い る と MAIPA と 比 較 し て も, 抗 抗HPA-4aで32倍 優 れて い ると 考 え ら れ た 次 に, こ のABC-MACEの め, microtiter GPIIb/IIIa抗 plate 体) 特 異 性 を 確 認 す るた に 固 相 化 す る 抗 体 をAP2(抗 か らAP1 に 変 え 検 討 し た-抗HPA-1aお そ れ ぞ れ5μl用 (抗GPIb/IX抗 体) よ び 抗HPA-4aを い た と こ ろ, そ のO.D.は 抗HPA-
4 日本輸 血 学会 雑 誌 第39巻 第4号 723 A anti-hpa-ta anti-hpa-4a A anti-hpa-1a anti-hpa-la B B 図3 ABC-MACEに 体 の検 出 成績 8μlよ よ る 抗HPA-1a, (A: 抗HPA-1a, り段 階 希 釈, B: 抗HPA-1a, を1-3μlよ り段 階 希 釈).影 均 士3SDの 範 囲 を 示 す. 体を 体 付 きの部 分 は正 常血 清平 図4 FCMに よ る 抗HPA-1a, 出 成 績 (A: 1aで0.786, 抗HPA-4aで0.812で の 平 均+3SD(0.846)以 3. FCMに FCMは, あ り, 正 常 血 清 下 で あ った. B: 体 の検 体 を20μ1よ を20μlよ 体 を1-3μ1よ を1.3μlよ り段 階 希 釈). 釈).影 影 付 き の 部 分 は 正 常 血 清 平 均 ±3SDの 範囲 よ る検 出 感 度 GPに 特 異 的 な 抗 体 を検 出 す る方 法 と 反 応 系 がMACEと よ く似 て い る こ とか ら, ABC- MACEとFCMの 検 出 感 度 を 比 較 検 討 した.今 回 用 い た 抗 血 清 は 抗HLA抗 め, 抗HLA抗 体 を含 ん で い な いた 体 の 影 響 は な い もの と考 え られ る. 示 す よ うに, FCMに お い て は抗HPA-1a は, 2.5μlま で, 抗HPA-4aは0.08μlま B)検 り段 階 希 釈, を 示 す. は 言 え な い が, 比 較 的 よ く使 わ れ て い る こ と と, 図4に 抗HPA-1a, 出 可 能 で あ った.以 はFCM で (図4 上 の 成 績 よ り, ABC- MACE (図3) HPA-1a で は 約8倍 HPA-4a で は ほ ぽ 同程 度 か そ れ 以 上 の 検 出感 度 で あ る と考 え られ た. (図4) と比 べ て も, 抗 検 出 感 度 が 優 れ て お り, 抗 考 案 血 小 板 特 異 抗 原 に 対 す る 同 種 抗 体 の 検 出 と, そ の 対 応 抗 原 を 同 定 す る 方 法 と し て は, 量mmunoprecipitation 法 や immunoblot 法 が 知 られ て い る7)8).し か し, 両 者 と も特 殊 な 検 査 法 で 手 技 が 煩 雑 で あ り, immunoprecipitation 法 で は ア イ ソ トー プ が 必 要 で あ る こ と, immunoblot HPA-2やHPA-5に い こ と等 の 欠 点 が あ る7).近 immunobead 法 で は 対 す る同種抗 体 を検 出で きな assay, MACE, 年 に な り考 案 さ れ た MAIPA 等 モ ノク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い て 血 小 板 膜GPに 対 す る抗 体 を 検 出 す る 方 法 は, 比較 的手技 上 記2法 に 比 べ, も 容 易 で あ り, 日常 的 検 査 法 と し て 有 用 で あ る と 考 え ら れ る.し か し な が ら, これ らの 検 出法 の 抗
5 724 Japanese Journal of Transfusion Medicine, Vol. 39. No. 4
6 , ) McMillan, R.: Antigen-specific assays in immune thrombocytopenia. Transfusion Medicine Reviews, 4: , ) Tomiyama, Y., Tike, H., Ikeda, H., Mitani, T., Furubayashi, T., Mizutani, H., Yamamoto, N., Tandon, N.N., Sekiguchi, S., Jamieson, G.A., Kurata, Y., Yonezawa, T. and Tarui, S.: Identification of the platelet-specific alloantigen, Naka, on platelet membrane glycoprotein IV. Blood, 75(3): , ) Kiefel, V., Santoso, S., Katzmann, B. and Mueller-Eckhardt, C.: A new platelet-specific alloantigen Bra. Vox Sang., 54: , ) Kiefel, V., Santoso, S., Katzmann, B. and Mueller-Eckhardt, C.: The Bra/Brb alloantigen on human platelets. Blood, 73(8): , ) Take, H., Tomiyama, Y., Shibata, Y., Furubayashi, T., Honda, S., Mizutani, H., Nishiura, T., Tsubakio, T., Kurata, Y., Yonezawa, T. and Tarui, S.: Demonstration of the heterogeneity of epitopes of the plateletspecific alloantigen, Baka. Br. J. Haematol., 76: , 1990.
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