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1 1 個別研究例 Short Time Exposure (STE) 法の利用 花王株式会社安全性科学研究所安保孝幸

2 2 本日の発表内容 1. STE 法の背景 2. 代替法における毒物劇物除外申請の必須条件と STE 法による製剤 ( 希釈物 ) での濃度依存性と予測性 3. 毒物劇物除外申請された製剤 ( 希釈物 ) の STE 法による評価結果 4. 毒物劇物除外申請における STE 法の利用 本項目は公知化 ( 論文化 ) 致しますので そちらをご確認いただきたく宜しくお願い申し上げます

3 眼が傷害を受ける状況とその症状 3 紫外線 砂 ほこり 目を強く擦る 予想される眼に対する影響 感覚的な刺激 症状 薬品 シャンプー 洗剤 角膜傷害混濁 剥離 結膜傷害充血 浮腫 眼の痛み しみるかすみ 視力低下充血 浮腫涙 眼ヤニ 目薬 コンタクトレンズ

4 ウサギを用いた眼刺激性試験法 (Draize) 4 薬品が眼に入ったときの傷害性をウサギを使ってするテスト 液体であれば 100μL 固体であれば 100mg Draize 試験 点眼 方法 1. 薬品を点眼する 2. 経時的に眼の状態を観察する ( hrs~21days) 角膜 ( 混濁度 面積 )X5 虹彩 ( 炎症 )X5 結膜 ( 充血 浮腫 分泌物 )X2 *MAS: Maximum Average Score 最大平均評点 Draize スコアの最大値 : 110( 角膜部 80 虹彩部 10 結膜部 20) 3. 反応評点から MAS* を算出

5 ウサギを用いた Draize 試験の結果による GHS 区分方法 GHS 区分ウサギを用いた試験での条件区分の条件 Category 1 強度眼刺激性 腐食性 Category 2A 中等度眼刺激性 Category 2B 中等度眼刺激性 No category 区分外 パターン 1 角膜 虹彩 結膜に不可逆的な症状が発現し 21 日目までに回復しないまたは 角膜スコア 4 がいずれかの時点で確認される パターン 2 3 匹中 2 匹以上の個体で 1, 2, 3 日目のスコアの平均が CO 3 and/or IR 匹中 2 匹以上の個体で 1, 2, 3 日目のスコアの平均が下記のいずれかを満たし 21 日目までに完全に回復する CO 1 but <3 IR 1 but <1.5 CR 2, CC 2 3 匹中 2 匹以上の個体で 1, 2, 3 日目のスコアの平均が下記のいずれかを満たし 7 日目までに完全に回復する CO 1 but <3 IR 1 but <1.5 CR 2 CC 2 上記のいずれも満たさない パターン 1 が 1 匹以上あてはまる パターン 2 が 3 匹中 2 匹以上 * あてはまる 左記の条件が 3 匹中 2 匹以上 * あてはまる 3 匹中 1 匹が左記の条件を 1 匹が 2B の条件にあてはまる 左記の条件が 3 匹中 2 匹以上 * あてはまる 左記の条件が 3 匹中 2 匹以上 * あてはまる *: 3 匹中 2 匹以上 は ウサギの数が 3 匹以上の場合 4 匹中 3 匹以上 5 匹中 3 匹以上 6 匹中 4 匹以上のように全体のウサギの数の 2/3 以上を指す CO: Corneal opacity ( 角膜混濁 ), IR: Iritis ( 虹彩損傷 ), CR: Conjunctival redness ( 結膜発赤 ), CC: Conjunctival chemosis ( 結膜浮腫 ) 5

6 6 STE 法の眼刺激性メカニズムにおける着眼点 眼刺激性を精度良く評価 角膜の損傷 組織 ( 角膜 ) 表層の細胞 眼刺激性評価には短時間曝露時の細胞損傷の評価が重要 簡便な方法での評価 簡便な単層培養細胞の試験を選択 実際の曝露条件 50 µl 点眼液の排出時間 (80% 排出 ) ヒト :1~2 分 ウサギ :3~4 分 眼内滞留時間は 5 分以内 眼刺激性は 最初に最表面の上皮細胞に接触 刺激の有無は表面細胞の損傷 従来の単層培養細胞の試験は非水溶性 ( 油溶性 ) 物質の評価に課題 ( 培地中は分離や油分の浮遊により細胞へ接触しない ) 短時間曝露 油溶性物質を溶媒として使用可 Short Time Exposure(STE) 法を開発 (Mikkelson et al., 1973) (Maurer et al., 2002)

7 OECD テストガイドライン承認までの道 試験法開発 プロトコル最適化 データセット構築 論文化 (Takahashi et al., 2008) SOP 作成 共同研究 バリデーション 2 施設共同研究 (Takahashi et al. 2009) 3 施設共同研究 (Takahashi et al. 2010) 5 施設での 1 st validation study (Sakaguchi et al. 2011) 3 施設での 2 nd validation study (Kojima et al. 2013) 国際的な Peer review (ICCVAM) 希釈物および混合物も含めた評価も実施 STE Summary Review Document 作成 (2013.6) OECD テストガイドライン化に向けた取り組み Draft Test Guideline の作成 世界各国からの膨大なコメント 修正への対応 専門家会議 電話会議での説明 OECD テストガイドライン承認 (TG491) 7

8 STE 法 (TG491) の概要 試験方法 細胞培養曝露 5 分間細胞生存率測定 ウサギ角膜由来株化細胞 (SIRC) 曝露濃度 5%, 0.05% 試験溶媒 : 生理食塩水 5% DMSO/ 生理食塩水 ミネラルオイル DMSO; Dimethyl sulfoxide 色素生成量測定 (MTT 法 ) 細胞生存率 (%) (Takahashi et al., 2008) 予測モデル Cell viability GHS* classification At 5% At 0.05% 70% 70% Category 1** 70% > 70% No prediction can be made (No pred) > 70% > 70% No Category (NC) * GHS: Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals **Category1: 強度眼刺激性 (OECD TG491., 2015) 曝露時間 曝露濃度 予測モデルは GHS 区分の対応性から検討して設定単一化学物質および希釈物 1) 混合物 1, 2) も評価可能な試験法として TG 化 1) OECD TG491 2) Saito et al.,

9 STE 法の適用限界 9 1) 高揮発性物質 > 6kPa (25 ) e.g. Acetone, Ethanol, Isopropanol, Methyl acetate 調製 曝露の際 揮発によって評価物質が揮散する可能性 2) 活性剤を除く固体 e.g. Ammonium nitrate, Potassium sorbate, Sodium salicylate in vivo の物理的な刺激を捉えられなかった可能性 2 つのカテゴリーを上記の理由から適用限界として設定

10 10 本日の発表内容 1. STE 法の背景 2. 代替法における毒物劇物除外申請の必須条件と STE 法による製剤 ( 希釈物 ) での濃度依存性と予測性 3. 毒物劇物除外申請された製剤 ( 希釈物 ) の STE 法による評価結果 4. 毒物劇物除外申請における STE 法の利用

11 代替法における GHS 区分の現状 11 Cat. 1 または NC のみ区分可能 Cat. 2 は区分不可 GHS 区分 BCOP (TG437) ICE (TG438) FL (TG460) STE (TG491) Cat. 1 Cat.2 No Category 毒物劇物指定および指定除外申請の現状 GHS 区分 in vivo in vitro Cat. 1 毒劇物指定毒劇物指定 Top-down 方式 Cat. 2 No Category 指定除外 指定除外 Bottom-up 方式

12 GHS 区分における STE 法予測モデルの意味合い 12 STE 法は 2 つの濃度によって GHS を区分 0.05% は Cat. 1 と No pred の区分に関与 (Top-down 方式に関与 ) 5% は NC と No pred の区分に関与 (Bottom-up 方式に関与 ) Cell viability At 5% At 0.05% GHS classification 70% 70% Category 1 70% > 70% No prediction can be made (No pred) > 70% > 70% No Category (NC)

13 毒物劇物除外申請するための代替法の必須条件 13 区分結果が Cat. 1 No pred では除外不可 代替法を用いる毒物劇物除外申請には Bottom-up 方式 (5% 濃度での細胞生存率 ) が必要 必須条件 指定除外申請濃度のような製剤 ( 希釈物 ) において STE 法で NC と評価した物質が in vivo で NC であること (Negative Predictive Value 100%) STE 法で NC と評価した物質が in vivo で Cat. 1 でないこと (NC Cat.1 過大評価率 0%)

14 STE 法による眼刺激性評価結果 STE STE STE Substance name CAS RN GHS a Cell viability (%) Substance name CAS RN GHS a Cell viability (%) Substance name CAS RN GHS a Cell viability (%) GHS GHS GHS 5% 0.05% 5% 0.05% 5% 0.05% 1-Chloroctan-8-ol Cat No pred Isopropyl acetoacetate Cat. 2B No pred Glycidyl methacrylate NC No pred 1-Dodecanaminium, N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) Cat No pred Monoethanolamine (10% in water) Cat. 2B No pred Isobornyl acetate NC NC N,N- dimethyl-, inner salt (30% in aqueous solution) 2-Hydroxy isobutyric acid ethyl ester Cat No pred n- Butanal b Cat. 2B No pred Isononylaldehyde NC No pred 2-Methylbutyric acid Cat No pred S- Bioallethrin Cat. 2B N/A Isooctyl acrylate NC NC 2-Naphthalenesulfonic acid,6-hydroxy-,monosodium salt, polymer with formaldehyde and Cat No pred Toluene >Cat. 2B NC Isopropyl bromide b NC NC hydroxymethylbenzenesulfonic aid monosodium salt (24% in water) (3-Aminopropyl)triethoxy silane Cat No pred 1,2,3-Trichloropropane NC NC Isopropyl myristate NC NC 4-tert- Butylcatechol (85% in methanol) Cat. 1 N/A 1,2,4-Trimethylbenzene NC NC Isopropyl myristate (10% in water) NC N/A Acetic acid (10% in water) Cat No pred 1,2,6-Hexanetriol NC NC Kerosine NC NC Benzalkonium chloride Cat Cat. 1 1,3-Dibromopropane NC NC Lactic acid (10% in water) NC No pred Benzalkonium chloride (10% in water) Cat Cat. 1 1,3-Di-iso-propyl benzene NC NC Methanol b NC NC Benzalkonium chloride (5% in water) Cat No pred 1,4-Dibromobutane NC NC Methylal b NC NC Benzethonium chloride (10% in water) Cat Cat. 1 1,5-Dibromopentane NC NC Methyl amyl ketone NC NC Benzene, 1,1'-oxybis-, tetrapropylene derivs., Cat Cat. 1 1,5-Hexadiene b NC NC Methyl cyclopentadiene dimer NC NC sulfonated, sodium salts (48% in water) Benzyl alcohol Cat. 1 N/A 1,6-Dibromohexane NC NC Methyl cyclopentane b NC NC bis-(3-aminopropyl)-tetramethyldisiloxane Cat Cat. 1 1,9-Decadiene NC NC Methyl isobutyl ketone NC NC Butanol Cat No pred 1-Bromo-4-chlorobutane NC NC Methyl tetraglycol NC NC Butyl cellosolve Cat No pred 1-Ethyl-3-methylimidazolium ethyl sulphate NC NC Methyl triglycol NC NC Butylnaphthalenesulfonic acid sodium salt (34% in Cat No pred 1-Methylpropylbenzene NC NC Methyl trimethyl acetate NC NC water) Cetyl pyridinium bromide (10% in water) Cat Cat. 1 1-Nitropropane NC N/A Metolachlor NC NC Cetyl pyridinium bromide (6% in water) Cat No pred 2,2-Dimethyl-3-pentanol NC NC m- Methoxthybenzaldehyde NC No pred Cetyl pyridinium chloride (10% in water) Cat Cat. 1 2-(2-Ethoxy ethoxy) ethanol NC NC m- Phenylene diamine (10% in water) NC NC Cetyl trimethyl ammonium bromide (10% in water) Cat Cat. 1 2,4-Dicyano-1-butene NC No pred n- Amyl bromide NC NC Cyclohexanol Cat No pred 2,4-Pentanediol NC NC n- Butyl acetate NC NC Di(2-ethylhexyl)sodium sulphosuccinate (10% in Cat No pred 2,4-Pentanedione NC No pred n- Hexane b NC NC water) Diethylethanolamine Cat No pred 2-Ethoxyethanol NC NC n- Hexyl bromide NC NC Diethylethanolamine (50% in water) Cat No pred 2-Ethylhexanoyl chloride NC No pred Nitrobenzene NC NC Diethylethanolamine (25% in water) Cat No pred 2-Methoxyethanol NC NC n,n- Dimethylguanidine sulfate NC NC Distearyl dimethylammonium chloride Cat No pred 2-Ethoxyethyl methacrylate NC NC n- Octyl bromide NC NC Domiphen bromide (10% in water) Cat Cat. 1 2-Ethylhexyl p- dimethylamino benzoate NC NC Octadecyl isocyanate NC N/A 2-Ethylhexyl p- dimethylamino benzoate (10% in (Ethylenediamine propyl)trimethoxysilane Cat No pred NC N/A p- Chlorobenzotrifluoride NC NC water) Ethylhexyl acid phosphate ester Cat Cat. 1 2-Ethylhexyl thioglycolate NC NC Pentaerythritol, propoxylated NC NC Hydroxyethyl acrylate Cat No pred 2-Methoxy-3,4-dihydropyran NC No pred Perfluoro-n- hexane NC N/A Isobutyl alcohol Cat No pred 2-Methylpentane b NC NC Petroleum ether NC NC Lactic acid Cat No pred 3,3-Dimethylpentane b NC NC Piperonyl butoxide NC NC Lauric acid Cat No pred 3-Ethyl toluene NC NC p- Methyl thiobenzaldehyde NC N/A Lauryldimethylamine oxide (35% in water) Cat Cat. 1 3-Methoxy-1,2-propanediol NC NC Polyethylene glycol NC NC Methoxyethyl acrylate Cat No pred 3-Methylhexane b NC NC Polyethylene glycol 400 (10% in water) NC NC n- Octylamine Cat Cat. 1 3-Phenoxy benzaldehyde NC NC Polyethylene glycol NC NC Polyoxyethylene(10) polyoxypropylene(1.5) laurylmyristyl ether Cat Cat. 1 3-Phenoxy benzyl alcohol NC N/A Polyethylene glycol dimethylether NC NC Potassium laurate Cat Cat. 1 4-Bromophenetole NC NC Polyethylene glycol monolaurate NC No pred Polyoxyethylene(13) (mono-, di-, tri-)styrenated Sodium lauryl sulfate (15% in water) Cat Cat. 1 Acid Red 92 (1% in water) NC No pred NC Cat. 1 phenyl ether Sodium polyoxyethylene(3) lauryl ether sulfate (25.5% Cat Cat. 1 Allyl methacrylate NC NC Polyoxyethylene(14) tribenzylated phenyl ether NC NC in water) Polyoxyethylene(19) (mono-, di-, tri-)styrenated Stearyl trimethylammonium chloride (10% in water) Cat No pred Amyl acetate NC NC NC NC phenyl ether Tetraethylene glycol diacrylate Cat No pred Benzotrichloride NC NC Polyoxyethylene(40) hydrogenated castor oil NC NC Triethanolamine polyoxyethylene(3.0) lauryl ether Cat Cat. 1 Benzyl alcohol (1% in water) NC N/A Polyoxyethylene(160) sorbitan triisostearate NC NC sulfate (40% in water) Triton X Cat Cat. 1 Bicyclo [2,2,1]hept-5-ene-2-carbonitrile NC NC Polyoxyethylene hydrogenated castor Oil (60E.O.) NC NC 1-Octanol Cat. 2A No pred bis-(3-triethoxisilylpropyl)-tetrasulphide NC NC Potassium oleate (16% in water) NC No pred Brij-35 (10% in water)) (Polyoxyethylene 23 lauryl 2,6-Dichlorobenzoyl chloride Cat. 2A NC NC NC Propiconazole NC No pred ether) 2-Benzyloxyethanol Cat. 2A No pred Bromo-2-butane b NC NC Propylene glycol NC NC 2-Ethyl-1-hexanol Cat. 2A No pred Calcium thioglycolate (10% in water) NC NC Silan 108 (Trimethoxyoctylsilane) NC NC Acetone b Cat. 2A No pred Cellosolve acetate NC NC Silicone Y-4081 (Hexamethyldisiloxane) NC NC Cetyl pyridinium bromide (1% in water) Cat. 2A No pred Cetyl pyridinium bromide (0.1% in water) NC NC Sodium chloride isotonic solution NC NC Chlorhexidine gluconate (20% in water) Cat. 2A N/A Cetyl pyridinium chloride (0.1% in water) NC No pred Sodium lauryl sulphate (3% in water) NC No pred Cyclopentanol Cat. 2A No pred cis- Cyclooctene NC NC Sodium lauryl sulphate (1% in water) NC No pred Sodium polyoxyethylene laurylether sulphate (27% in Deoxycholic acid Na salt (10% in water) Cat. 2A No pred Cyclohexanone NC No pred NC Cat. 1 water) Ethanol b Cat. 2A No pred Di-isobutyl ketone NC NC Sodium salicylate (10% in water) NC NC Ethyl trans-3-ethoxyacrylate Cat. 2A NC Di-isopropanolamine (10% in water) NC NC Sorbitan monolaurate NC No pred Furfural Cat. 2A No pred Dimethyl carbonate b NC No pred Styrene NC NC gamma-butyrolactone Cat. 2A No pred Dimethyl hydropolysiloxane NC NC Thiodiglycol NC NC Isopropanol b Cat. 2A No pred Dimethyl sulfoxide NC NC Trichloroacetic acid (3% in water) NC No pred Lauryl sulphobetaine (10% in water) Cat. 2A No pred Di-n- propyl disulphide NC NC Tricresyl phosphate NC NC Methyl acetate b Cat. 2A No pred Dioctyl ether NC NC Triethanolamine NC NC Methyl cyanoacetate Cat. 2A No pred Dodecane NC NC Triethanolamine (10% in water) NC NC Methyl ethyl ketone b Cat. 2A No pred Ethanol (10% in water) NC NC Triethanolamine orthovanadate (30% in water) NC N/A Naphthalenesulfonic acid, butyl-, polymer with formaldehyde and 2-naphthalenesulfonic acid, sodium Cat. 2A No pred Ethyl acetate b NC NC Triethanolamine orthovanadate (3% in water) NC N/A salt n- Hexanol Cat. 2A No pred Ethyl acetoacetate NC No pred Triethoxyoctylsilane NC NC Polyoxyethylene(20) hydrogenated tallow amine >Cat. 2A Cat. 1 Ethylene glycol diethyl ether NC NC Triethylene glycol NC NC Polyoxyethylene(23) lauryl ether Cat. 2A No pred Ethylhexyl salicylate NC NC Trifluoroethyl methacrylate NC NC Propasol Solvent P Cat. 2A No pred Ethyl thioglycolate NC NC Triisooctylamine NC NC Sodium hydroxide (1% in water) Cat. 2A No pred Ethyl trimethyl acetate NC NC Trimethoxy(3,3,3-trifluoropropyl)silane NC NC Sodium lauryl sulfate >Cat. 2A Cat. 1 Fungitrol zinc 8% fungicide (Zinc naphthenate) NC NC Triphenyl phosphite NC NC Triton X-100 (5% in water) Cat. 2A No pred Furan b NC NC Triton X-100 (1% in water) NC No pred 2-Methyl-1-pentanol Cat. 2B No pred gamma-chloropropyltrimethoxy silane NC No pred Tween NC NC 2-Pseudoionone Cat. 2B No pred gamma-glycidyloxypropyltrimethoxy silane NC NC Tween NC NC 3-Chloropropionitrile Cat. 2B N/A gamma-mercaptopropyl trimethoxy silane NC NC Tween 80 (10% in water) NC NC Butyl Dipropasol Solvent Cat. 2B No pred gamma-methacryloxypropyltrimethoxy silane NC NC Vinyl 2-ethylhexanoate NC NC Diethyl toluamide Cat. 2B No pred Genomoll P (Tris(2-chloroethyl) phosphate) NC No pred Vinyl trimethoxy silane NC No pred Ethyl-2-methyl acetoacetate Cat. 2B No pred Glycediol NC No pred Vinyl tris (beta-methoxyethoxy) silane NC NC Glycolic acid (10% in water) Cat. 2B No pred Glycerol NC NC Xylene NC NC Isobutanal b Cat. 2B No pred Glycerol (10% in water) NC NC (Abo et al., 2018) 14

15 STE 法における化学物質 (224 種 ) の GHS 区分予測性 15 in vivo GHS STE Cat. 1 No pred NC Cat Cat NC STE 法で NC と評価した物質が in vivo で NC であった (117/120) (Negative Predictive Value 100%) STE 法で NC と評価した物質が in vivo で Cat. 1 なし (0/120) (NC Cat.1 過大評価率 0%)

16 STE 法における希釈製剤の GHS 区分 ( 濃度依存性 ) Substance name CAS RN in vivo GHS 5% 0.05% Cetyl pyridinium bromide (10% in water) Cat Cat. 1 Cetyl pyridinium bromide (6% in water) Cat No pred Cetyl pyridinium bromide (1% in water) Cat. 2A No pred Cetyl pyridinium bromide (0.1% in water) NC NC Cetyl pyridinium chloride (10% in water) Cat Cat. 1 Cetyl pyridinium chloride (0.1% in water) NC No pred STE Cell viability (%) GHS Sodium lauryl sulfate (15% in water) Cat Cat. 1 Sodium lauryl sulphate (3% in water) NC No pred Sodium lauryl sulphate (1% in water) NC No pred in vivo の濃度依存性は STE 法でも同様の傾向 STE 法で NC と評価した物質が in vivo で NC であった STE 法で NC と評価した物質が in vivo で Cat. 1 なし (NC Cat.1 過大評価率 0%) 希釈製剤においても毒性を検出 16

17 STE 法における希釈製剤の GHS 区分予測性 種の希釈物質を評価 ( 濃度 : 50%~0.1%) in vivo GHS STE Cat. 1 No pred NC Cat Cat NC STE 法で NC と評価した物質が in vivo で NC であった (12/12) (Negative Predictive Value 100%) STE 法で NC と評価した物質が Cat. 1 なし (0/12) (NC Cat.1 過大評価率 0%)

18 18 本日の発表内容 1. STE 法の背景 2. 代替法における毒物劇物除外申請の必須条件と STE 法による製剤 ( 希釈物 ) での濃度依存性と予測性 3. 毒物劇物除外申請された製剤 ( 希釈物 ) の STE 法による評価結果 4. 毒物劇物除外申請における STE 法の利用

19 毒物劇物除外申請における STE 法の利用 STE 法は毒物劇物指定物質および製剤 ( 希釈物 ) においても STE 法で NC と評価した物質は高い精度で NC として区分 (Negative Predictive Value 100%) STE 法で NC と評価した物質に Cat. 1 なし (NC Cat.1 過大評価率 0%) 判定基準 原体が STE 法の適用限界でないことを確認 除外申請濃度の希釈物 : 結果が Cat. 1 申請濃度では除外不可 No pred 申請濃度では除外不可 (OECD GD 263* に従い 他の試験法での再評価の可能性 ) NC 申請濃度で除外可能 *: 眼刺激性 Integrated Approach on Testing and Assessment (IATA) に関する資料 19