要旨グレープフルーツや夏みかんなどに含まれる柑橘類フラボノイドであるナリンゲニンは高脂血症を改善する効果があり肝臓においてもコレステロールや中性脂肪の蓄積を抑制すると言われている脂肪肝は肝臓に中性脂肪やコレステロールが溜まった状態で動脈硬化を始めとするさまざまな生活習慣病の原因となる脂肪肝

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さやえいさか
5 years ago
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1 平成 27 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ 脂肪肝の炎症におけるナリンゲニンの効果の研究 Effect of Naringenin in inflammation of the fatty liver 臨床薬理学研究室 6 年 10P040 曽我沙也加 ( 指導教員 : 渡辺賢一 )

2 要旨グレープフルーツや夏みかんなどに含まれる柑橘類フラボノイドであるナリンゲニンは高脂血症を改善する効果があり肝臓においてもコレステロールや中性脂肪の蓄積を抑制すると言われている脂肪肝は肝臓に中性脂肪やコレステロールが溜まった状態で動脈硬化を始めとするさまざまな生活習慣病の原因となる脂肪肝の原因としてアルコールの多飲糖分脂質の過剰摂取があるが最近脂肪肝を持つ患者の数十 % が非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH: non-alcoholic steatohepatitis) と呼ばれる疾患へと進行することが明らかになった NASH ではアルコール非依存性に肝実質が広範に線維化し更に肝硬変や肝細胞癌を発症する場合も多いナリンゲニンには肝脂肪の分解を促進する働きがあり脂肪肝の予防にも効果的であると言われている本研究では脂肪肝の炎症におけるナリンゲニンの作用について研究した肝臓の外観および肝組織の免疫染色の画像からナリンゲニンを投与することで脂肪の沈着が抑制されているウエスタンブロット法によりタンパク質の発現量の解析をした炎症作用に関連する p-iκbα INF-γと酸化ストレスを制御する Nrf2 に注目すると p-iκbα INF-γは NASH 群では Normal 群に比べ増加していたが Naringenin による治療群では減少していた Nrf2 では Normal 群に比べて NASH 群では減少しているが治療群では増加していたこれらのことからナリンゲニンは非アルコール性脂肪性肝炎の炎症に対して有効な作用を示すと考える

3 キーワード 1. ナリンゲニン 2. 脂肪肝 3. 肝細胞 4. 炎症 5. グレープフルーツ 6. 夏みかん 7. 抗酸化作用 8. 酸化ストレス 9. サイトカイン 10. フラボノイド

4 目次 1. はじめに 1 2. 実験内容 1 3. 結果 2 4. 考察 5 5. おわりに 5 謝辞 6 引用文献 7

5 論文 1. はじめに脂肪肝は肝臓に中性脂肪やコレステロールが溜まった状態で動脈硬化を始めとするさまざまな生活習慣病の原因となる脂肪肝の原因としてアルコールの多飲糖分脂質の過剰摂取があるが最近脂肪肝を持つ患者の数十 % が非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH:non-alcoholic steatohepatitis) と呼ばれる疾患へと進行することが明らかになった NASHではアルコール非依存性に肝実質が広範に線維化し更に肝硬変や肝細胞癌を発症する場合も多い NASH の正確な発症機序は依然として不明である脂肪肝の存在下に炎症とインスリン抵抗性が加わるとNASHに進行するという 2ヒットセオリーが提唱されているが実験的な確証はない 2) 本研究ではマウスを用いて NASH の炎症における柑橘類に含まれるフラボノイドの一種であるナリンゲニンの効果について研究した 2. 実験内容 2.1 使用動物マウスは Normal 群 NASH 群 Naringenin 治療群の 3 つの実験群に分けた生後 2 日目の新生児マウスに STZ 20 L(10mg/mL) を背中の皮下注射した生後 5 週目で高脂肪食 (High Fat Diet 32:HFD32) を 3 か月間摂取させたナリンゲニン (50mg/kg/day) は HFD32 を 2 か月間摂取してから開始され 1 か月間経口投与させた飼育期間中水と飼料は自由摂取とした 2.2 ウエスタンブロット法マウスから摘出した肝臓をポリトロンホモジナイザーで処理し bicinchoninicacid (BCA) 法で総タンパクの定量を行ったその後 2 sample buffer を加えてウエスタンブロッティングの試料とした各試料中の総タンパクを 10%SDS-polyaclylamidegel electrophoresis (SDS-PAGE) ゲルを用いて 150V 50 分で電気泳動し 12V 60 分でニトロセルロース膜に転写した転写後この膜のバンドを Poncean S で染色し確認した後 PBS で洗浄し 5% スキンミルクを用いて 1 時間 blocking を行った 1

1 次抗体として IFN-γ(1:1000) Nrf2(1:1000) IκBα(1:1000) 及び内部標準である glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) (1:2000) を 4 C の冷蔵室で一晩反応させた翌日に二次抗体として GAPDH 及び IFN-γに anti-mouse (1:5000) Nrf2, p-iκbα に

6 1 次抗体として IFN-γ(1:1000) Nrf2(1:1000) IκBα(1:1000) 及び内部標準である glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) (1:2000) を 4 C の冷蔵室で一晩反応させた翌日に二次抗体として GAPDH 及び IFN-γに anti-mouse (1:5000) Nrf2, p-iκbα に anti-rabbit (1:5000) を室温でそれぞれ 1 時間反応させその後 ECLplus を用いて X 線フィルムによる現像を行った感光させたバンドは Soicon Image による処理を行い数量化して評価を行った IFN-γ Nrf2 p-iκbα のタンパク発現量を GAPDH と比較した 2.3 免疫組織化学染色 (IHC) コラーゲン抗体を用いて免疫組織化学染色 (ImmunoHistoChemistry:IHC 染色 ) を行った光学顕微鏡にて肝臓の病理変化を観察した 2.4 Hematoxylin Eosin (HE) 染色肝臓の一部を 10% ホルマリン溶液で固定し組織片をパラフィン包埋するパラフィンブロックを薄切りして組織片を HE 染色しスライドを作製する標本は光学顕微鏡を用いて観察した 3. 結果 3.1 肝臓の外観図 1 摘出した肝臓の状態 Normal 群のマウスの肝臓は暗赤色をしているが NASH 群の肝臓は赤みが薄くなっている表面に凹凸が確認できる Naringenin による治療群の肝臓は NASH 群に比べて赤みが増しており表面の凹凸も少なくなっている 2

7 p-i B- /GAPDH Nrf2/GAPDH 3.2 ウエスタンブロット法によるタンパク質の発現各群のマウスから摘出した肝臓から IFN-γ Nrf2 のタンパク質の発現を解析した IFN-γでは Normal 群に比べて NASH 群では上昇しており Naringenin 治療群では減少していることより NASH 群での炎症を抑制していることがわかる Nrf2 では Normal 群に比べて NASH 群では減少しており Naringenin 治療群では増加していた Nrf2 GAPDH Normal NASH Nar Normal NASH Nar IκBα GAPDH 図 2 肝臓のタンパク発現量 3

8 3.3 IHC 染色図 3 肝臓の IHC 染色コラーゲン 1 抗体を用いて IHC 染色を行った Normal 群と NASH 群を比較すると NASH 群では褐色部分が確認できるコラーゲンタンパク質が増加していることがわかる治療群では NASH 群と比較してコラーゲンタンパクの発現が減少していた 3.4 HE 染色図 4 肝臓の HE 染色 NASH 群に多く見える白い部分が脂肪になっており治療群ではこれが減少していた 4. 考察 4

9 肝臓の外観より NASH 群には脂肪の沈着が見られるが治療群では改善している IHC 染色の画像でもコラーゲンタンパクが減少していることを確認したまた IFN-γ Nrf2 IκBα の発現を解析した IFN-γは炎症性サイトカインの一つでありリン酸化した IκBαはユビキチンリガーゼであるβTRCP 複合体によりユビキチン化されプロテアソームにおいて分解される. それによりそれまで IκBαと結合することでその活性が抑制されていた NF-κB が核へと移行し炎症性サイトカイン遺伝子の転写を誘導する 3) この2つのタンパク質の発現がナリンゲニンにより抑制されていた Nrf2は高等動物における酸化ストレス適応反応を統一的に制御しており Nrf2の活性化が, 様々な疾患の予防治療に有効とされている 4) この Nrf2 が NASH 群に比べて治療群で増加しているため酸化ストレスが減少されているしたがってナリンゲニンは脂肪肝で脂肪の蓄積を抑制肝機能の改善炎症を抑える効果があると考える 9. おわりに今回マウスを用いた実験で天然成分であるナリンゲリンで脂肪肝の脂肪沈着を抑制し炎症を抑えることがわかった NASH は生活習慣病の原因にもなるのでありナリンゲニンは高脂血症やメタボリックシンドロームにも効果があるとされている今後も臨床応用を目指した研究が期待される 5

10 謝辞実験論文作成についてご指導を賜りました新潟薬科大学臨床薬理学研究室の渡辺賢一教授張馬梅蕾助手 Mr. Somasundaram A に御礼申し上げます 6

11 引用文献 1. 田邉宏樹, ナリンゲニンの血中脂質組成改善作用 Vol.46 No フアルマシア宮崎徹, 肝疾患の予防または治療剤 2013 年 4 月 26 日 3. 岩崎秀典竹内理審良静男,IκB キナーゼ複合体は炎症性サイトカイン遺伝子 mrna の安定性を regnase-1 の分解を介し制御している 2011 年 11 月 24 日 4. 伊東健,Nrf2 酸化ストレス応答系による病態制御生化学第 81 巻第 6 号,pp ,2009 7

要旨肝臓内に中性脂肪の貯まった状態を脂肪肝といいアルコールをほとんど飲まない人に起こる脂肪肝を非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) と呼ぶ NAFLD には進行せず良性の経過をたどる単純性脂肪肝と炎症や架橋状線維化が起こり肝硬変そして肝細胞癌へと進行する可能性のある非アルコール性脂肪性

要旨肝臓内に中性脂肪の貯まった状態を脂肪肝といいアルコールをほとんど飲まない人に起こる脂肪肝を非アルコール性脂肪性肝疾患 (NAFLD) と呼ぶ NAFLD には進行せず良性の経過をたどる単純性脂肪肝と炎症や架橋状線維化が起こり肝硬変そして肝細胞癌へと進行する可能性のある非アルコール性脂肪性平成 27 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ 非アルコール性脂肪性肝炎におけるレスベラトロールの研究 Studies on lipid metabolism of resveratrol on non-alcoholic steatohepatitis 臨床薬理学研究室 6 年 10P065 樋口佳奈 ( 指導教員 : 渡辺賢一 ) 要旨肝臓内に中性脂肪の貯まった状態を脂肪肝といいアルコールをほとんど飲まない人に起こる脂肪肝を非アルコール性脂肪性肝疾患