平成23年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅱ

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さゆりおうじ
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1 平成 23 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究 Ⅱ 論文題目肥満マウスにおける桑葉の効果 Effect of mulberry leaf in the obesity mouse 臨床薬理学研究室 6 年 06P025 風間美緒 ( 指導教員 : 渡辺賢一 )

2 要旨日本肥満学会において肥満とは脂肪組織の過剰な蓄積状態と定義され Body Mass Index(BMI)(kg/m 2 ) 25 が肥満と規定されている近年生活習慣の変化から BMI25 以上の肥満が増加傾向にある糖尿病や高血圧脂質異常症などの様々な生活習慣病は肥満に起因し心筋梗塞や脳梗塞など命に係わる病気を引き起こす要因ともなる桑とはクワ科クワ属の総称で葉は蚕の飼料として使われている近年桑葉 (Murbelly: MB) はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR) シグナル経路に作用し肥満に対する効果があると報告されている PPAR はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の一種でありの 3 種類のサブタイプが存在する PPAR は様々な組織での脂質代謝に深く関与しているそこで今回の研究では肥満マウスを用いて % と % における肥満に対する効果の検討を行った方法として各群 6 匹のマウスに高脂質餌 (Hight Fad Diet32: 32) を与えたのち MB を食べさせ体重血糖値中性脂肪総コレステロールを測定し肝臓の Hematoxilin-eosin (HE) 染色と蛋白の発現を行った結果としては MB 投与群では肝臓における PPAR PPAR retinoid X receptor (RXR) の活性化を介して脂肪酸代謝と脂肪細胞の分化を促進し肥満を改善した特に群では体重の大きな減少や PPAR と RXR の発現が有意な上昇を見せていることから桑葉の濃度は 25% より 2.5% の方がより肥満の効果が高いと考えられたさらに中性脂肪や血糖値も改善したことから肥満だけでなく糖尿病やメタボリックシンドロームも改善させる効果があるのではないかと推定された

3 キーワード 1. 肥満 2. Body Mass Index (BMI) 3. 桑葉 (Murbelly: MB) 4. peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) 5. retinoid X receptor (RXR) 6. MF 餌 7. Hight Fad Diet () 8. Western Blotting 法 9. 血糖値 10. 中性脂肪 11. 総コレステロール 12.Hematoxilin-eosin(HE) 染色 13. LiverWeight (LW)/ Body Weight (BW) 14. 脂肪酸の酸化 15. 脂肪細胞の分化

4 目次 1. はじめに 1 2. 方法 1 3. 結果 3 4. おわりに 6 謝辞 7 引用文献 8

5 論文 1. はじめに日本肥満学会において肥満とは脂肪組織の過剰な蓄積状態と定義され Body Mass Index(BMI)(kg/m 2 ) 25 が肥満と規定されている 1) 近年食生活など生活習慣の変化から BMI25 以上の肥満が増加傾向にあり特に男性では約 30% を占め過去 30 年間で 2 倍に増えている 2) 肥満は糖尿病や高血圧高脂血症などの様々な生活習慣病を招きまた心筋梗塞や脳梗塞など命に係わる病気を引き起こす要因となる 3) ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (peroxisome proliferator-activated receptor: PPAR) はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の一種でありの 3 種類のサブタイプが存在する PPAR は脂質代謝において重要な役割を担っている特に PPAR は肝臓に多く存在し脂肪酸の酸化を促進しトリグリセリド合成を低下させると報告されている 4) 桑とはクワ科クワ属の総称で葉は蚕の飼料として用いられ糖尿病の予防や治療に生薬として用いられてきた 5) 最近の研究で桑葉は動脈硬化や高血圧肥満を予防する効果があると報告され機能性食品として期待されている 6) 特に肥満における効果では PPAR 経路に作用し肥満を改善させると報告されている 7) 本研究ではマウスを用いて桑葉の肥満に対する効果を検討した 2. 方法 2-1. 動物体重血糖値 Crlj:CD1(ICR) 雄マウス 7 週齢を 24 匹用いたマウスを 6 匹ずつ 4 群に分けたそれぞれの群の詳細は表 1 に記す各群において週 1 回体重を量り血糖値は初日と桑葉投与前と投与後に測った 1

6 表 1 正常 () 群非治療 () 群桑葉 2.5% () 群桑葉 25% () 群普通の餌 (MF) 12 週間高脂質餌 (Hight Fad Diet32: 32) 8 週間 MF 4 週間 32 8 週間桑葉 (MB)2.5% 4 週間 32 8 週間桑葉 (MB)25% 4 週間 2-2. 血中脂質の測定エーテル麻酔下にてマウスの血液を取り出した血液は 4 度で 3000 回転で遠心し上清を取り総コレステロール中性脂肪を測った 2-3. Western Blotting 法による蛋白の発現取り出した肝臓を Lysis Buffer (50mM Tris HCl ph7.4, 200mM acl, 20mM af, 1mM a3vo4,2-mercaptoethnol, Protease inhibitor) 1mL にそれぞれの 0.1g の組織を砕いて入れホモジナイズした 4 度で 10 分 3000 回転で遠心し上清を取り原液とした原液と 2 Sample Buffer を 1:1 で混和し 95 度で 5 分間熱処理しサンプルとした 10(w/v)% Sodium dodecyl sulfate - polyaclylamide gel electrophoresis(sds-page) ゲルを用い電気泳動を行いニトロセルロース膜に転写したその後 1 TBS Tween20(20nM Tris, 137nM acl, 0.5% Tween-20) でメンブレンを洗浄し 5%Blocking スキンミルクを用い Blocking を行った ECLplas( アマシャム RP-2132) を調整し蛋白を検出した 1 次抗体は PPAR 抗体 1:500, PPAR 抗体 1:500, retinoid X receptor(rxr) 抗体 : 1:500. であるまた glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gapdh) 1:1000 をコントロールとした 1 次抗体は全て santa cruz 社の物である 2-4. 組織染色 (Hematoxilin-eosin:HE 染色 ) 肝臓を切り出し 10% ホルマリンで固定しパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し HE 染色を行った 2-5. 統計処理数値は平均値 ± 標準誤差で表し統計学的検討には one-way AOVA tukey 法 unpaired t-test 法を用い p < 0.05 を有意とした 2

7 3. 結果 3-1. 体重血糖値群では 12 週間徐々に体重が増加した MB 投与群では治療開始前の 8 週間は体重の増加が見られたが桑葉を投与開始後の 8 週目以後体重の減少が見られたまた群でも 8 週間体重が増加し 8 週目から体重の減少が見られたこれは群では 8 週目から餌を MF に変えたためだと考えられる ( 図 1-A) 血糖値の結果は群では初日に比べ 12 週間後血糖値が低下した群と群群では 8 週目まで血糖値の上昇が見られたが 8 週目以降は降下が見られた ( 図 1-B) A B 体重 45 (g) 血 160 糖値 140 (mg /dl) (wk) (wk) 図 1. マウスの体重と血糖値の推移 A: 体重縦軸 :g 横軸 : 週 (wk) B: 血糖値縦軸 :mg/dl. 横軸 : 週 (wk) :MF 12 週間 : 8 週間 MF 4 週間 : 8 週間 4 週間 : 8 週間 4 週間 3-2. 肝臓と体重比 (LW/BW) 群と群を比較すると群で有意に LW/BW 値は増加した (*p<0.05 vs..) しかし今回の研究において MB 投与群では群と比較して LW/BW 値の変化は見られなかった ( 図 2) 3

8 Triacylglycerol(mg/dL) Total Cholesterol (mg/dl) LW/BW 0.06 * * p<0.05 vs. 図 2. マウスの体重における肝臓の重さの比較 LW/BW: Liver Weight/ Body Weight. *p<0.05 vs 中性脂肪総コレステロール中性脂肪では群に比べ群で高値を示したが ( * p<0.05 vs..) MB 投与群では群と比べ低い値となった特に群では有意に減少した ( # p<0.05 vs..) ( 図 3-A) 総コレステロールは今回の研究においてどの群においても差は見られなかった ( 図 3-B) A B 150 * # * p<0.05 vs. ; # p<0.05 vs. 0 図 3. A: Triacylglycerol(mg/dL) B: Total Cholesterol(mg/dL) * p<0.05 vs. ; # p<0.05 vs 蛋白の発現 PPAR と RXR の発現量において群と比較して群では有意な減少が見られ ( * p<0.05 vs..) 群では群より有意に発現量が増加した ( # p<0.05 4

9 Liver RXR /GAPDH Liver PPAR /GAPDH Liver PPAR /GAPDH vs..) また RXR では群においても群と比較し発現量の有意な増加を示した (# p<0.05 vs..) ( 図 4-A.C) PPAR では発現量が群に比べ群で低下した MB 投与群では群と比較し発現量が増加した ( 図 4-B) A B PPARα PPARγ GAPDH GAPDH 25 # * * p<0.05 vs. ; # p<0.05 vs. 0 C RXRα GAPDH 80 # 60 # 40 * 20 0 * p<0.05 vs. ; # p<0.05 vs. 図 4. 肝臓での PPAR GAPDH(A) PPAR /GAPDH(B) RXR /GAPDH(C) の発現量 * p<0.05 vs. ; # p<0.05 vs HE 染色群では群と比べ細胞の形が乱れ細胞中に空洞 ( 脂肪沈着 ) が多く見られるまた MB 投与群では群と比べ細胞の形の乱れや脂肪沈着が改善したことが見られた ( 図 5) 5

10 100X 200X 図 5. マウスの肝細胞の脂肪沈着度の比較 100 は 100 倍 200 は 200 倍 4. おわりに PPAR はステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体の一種でありの 3 種類のサブタイプが存在する PPAR は RXR とヘテロダイマーを形成し標的遺伝子のペルオキシソーム増殖剤応答領域 (peroxisome proliferator response element: PPRE) に結合して転写活性を制御している PPAR はおもに心臓や肝臓など脂肪酸酸化が盛んな臓器に多く存在しミトコンドリアでの脂肪酸の酸化に関与している 8) 9 ) PPAR は体内組織の広範囲に発現しているが骨格筋における酸化や脂肪組織での脂質代謝に関与している 10) PPAR は脂肪組織に多く存在し脂肪細胞の分化を促進し血中トリグリセリドの低下をもたらす 11) 桑とはクワ科クワ属の総称で葉は古くから中国で糖尿病の予防や治療に生薬として用いられていた 5) 最近の研究によると高脂肪食を与えたラットに桑葉を投与すると PPAR シグナル経路の発現や脂肪酸の酸化の促進や脂肪形成が抑制されるという報告があり 7) また桑葉に含まれる 1-デオキシノジリマイシンという -グルコシダーゼ阻害作用を持ち抗糖尿病効果がある成分がラットの肝臓において酸化を活性化させ脂肪蓄積を抑制したと報告されている 12) 今回の研究において桑葉は肝臓における PPAR とそのヘテロダイマーである RXR PPAR を活性化し脂肪酸代謝と脂肪細胞の分化を促進し肥満を改善することが判明した特に PPAR RXR の発現量で有意な上昇を示したことから肝臓で桑 6

11 葉はより PPAR に作用を示すのではないかと考えられる桑葉の濃度を比較した結果では群で体重の大きな減少や PPAR と RXR の発現が有意な上昇を見られていることから桑葉の濃度は 25% より 2.5% の方がより肥満の効果が高いと考えられるさらに中性脂肪や血糖値も改善したことから肥満だけでなく生活習慣病である糖尿病やメタボリックシンドロームも改善させる効果があるのではないかと推定された謝辞実験論文作成についてご指導を賜りました新潟薬科大学臨床薬理学研究室の渡辺賢一教授張馬梅蕾助手にお礼を申し上げます 7

12 引用文献 1. 大原毅. メタボリックシンドロームの病態と診断肥満/ 脂肪肝. 内科. 99, 31-34(2007). 2. 村上義孝, 三浦克之, 上島弘. 我が国における肥満の動向. 日本臨床. 67, (2009). 3. 細田公則, 井田みどり, 平田雅一, 中尾一和. 肥満の概念と分類. 日本臨床. 67, (2009) 4. 福井智康, 平野勉. Ⅱ-3 高脂血症 PPARs と脂質代謝. 生活習慣病と PPARs (2007). 5. 松浦寿喜, 吉川友佳子, 升井洋至, 佐野満昭. 各種健康茶のラットにおける糖質吸収抑制作用. 薬学雑誌. 124, (2004). 6. 横出正之. 6. 脂質代謝と抗加齢医学. 日本老年医学雑誌. 45, (2008). 7.Kobayashi Y., Miyazawa M., Kamei A., Abe K., Kojima T.,Ameliprative Effects of Mulberry (Morus alba L.) Leaves on Hyperlipidemia in Rats Fed a High-Fat Diet: Induction of Fatty Acid Oxidation, Inhibition of Lipogenesis, and Suppression of Oxidative Stress. Biosci.Biotechnol. Biochem, 74, (2010). 8. 田中直樹, 杉山栄子, 青山俊文, Peroxisome proliferator-activated receptor(ppar). 日本臨床. 59, (2001). 9. 田中直樹, 青山俊文. 型ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体 (PPAR ): 脂肪肝疾患との関連. 信州医誌. 56, (2008). 10. 田中十志也. PPAR とメタボリックシンドローム. 日薬理誌. 128, (2006) 11. 島野仁. PPAR,, によるエネルギー代謝調節と脂肪蓄積. 現代医療. 36, (2004). 12. Tsuduki T., akamura Y., Honma T., akagawa K., Kimura T., Ikeda I., Miyazawa T., Intake of 1-deoxynojirimycin suppresses lipid accumulation through activation of the beta-oxidation system in rat liver. J Agric Food Chem, 25, (2009). 8

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規

られる糖尿病を合併した高血圧の治療の薬物治療の第一選択薬はアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬とアンジオテンシン II 受容体拮抗薬 (ARB) であるこのクラスの薬剤は単なる降圧効果のみならず様々な臓器保護作用を有しているが ACE 阻害薬や ARB のプラセボ比較試験で糖尿病の新規論文の内容の要旨論文題目アンジオテンシン受容体拮抗薬テルミサルタンのメタボリックシンドロームに対する効果の検討指導教員門脇孝教授東京大学大学院医学系研究科平成 19 年 4 月入学医学博士課程内科学専攻氏名廣瀬理沙要旨背景目的わが国の死因の第二位と第三位を占める心筋梗塞や脳梗塞などの心血管疾患を引き起こす基盤となる病態として過剰なエネルギー摂取と運動不足などの生活習慣により内臓脂肪が蓄積する内臓脂肪型肥満を中心に