Xcell Biosciences WHIITEPAPER EX VIVO と IN VIVO の結果が相反する時 : 何故 従来からの細胞培養法が不正確な 物学的結果を導くのか バイオ関連ラボでの検体数が増えているのもかかわらず 従来からのインキュベーターでは 細胞が増殖する本来の微小環境を正確に

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1 Xcell Biosciences WHIITEPAPER EX VIVO と IN VIVO の結果が相反する時 : 何故 従来からの細胞培養法が不正確な 物学的結果を導くのか バイオ関連ラボでの検体数が増えているのもかかわらず 従来からのインキュベーターでは 細胞が増殖する本来の微小環境を正確に再現できていません このことは 生体内と生体外条件下での細胞特性に相違が生じ 培養細胞を用いて得られた多くの研究結果に対して疑問が生じてきます 酸素 圧 レベル等の可変設定を可能とする新たな培養法は 細胞が存在する本来の環境をより正確に再現し より生物学的に関連する結果を導き出します 生体外での細胞増殖技術の開発は生物学を大幅に飛躍させ 研究者は生きた細胞を用いることにより それらの機能や性質 活性などをより理解できるようになりました しかし 細胞培養の 法や装置は それらが 年前に紹介されて以来 殆ど変わっていません 今 各研究室は現在使用している細胞増殖法 / インキュベーターを再考する必要があるかも知れません かなり小型の装置から大型の装置まで あるいは 独自のインキュベーターや メイソンジャーのような物から応急装備等も構築する必要があるかもしれません しかし いずれにしてもそれらのインキュベーターの基本技術は 1951 年に初めて 細胞株ラインを確 するために用いた技術から殆ど変わっていません 細胞培養は 世界中のアカデミック 製薬 / バイオテック施設のバイオラボに於いて基礎となる技術で 用いるインキュベーターはそれぞれの研究工程を遂 する上で非常に重要です しかし 近年は 細胞培養工程のより厳密な研究により 現在の技術では細胞の再現に限界がある事が明らかになりました おそらく 最も限界があるのは 今のインキュベーターでは殆どの細胞が存在している本来の微小環境を正確に再現できないことで その結果 それらを用いて得られた研究結果は 本来の細胞本性に正確に対応していません 実際 従来からのCO2インキュベーターで増殖した細胞では それらの遺伝 やタンパクの発現や 新たな細胞への分裂能 メタボリック過程等の重要な生物学的ファクターが変わってしまいます 細胞が新たな環境に短時間で適応することは 生物学者の間では常識になってきています

2 細胞が新たな環境に置かれた場合 例えその環境が体内や従来のインキュベーターに関係なく それら細胞の習性は変わります 結果として 細胞が本来の生物環境に存在しない状態になるため 研究者はこれらの対象細胞から意味のある結果を得る可能性を失う事になります RNA とタンパク発現 / 幹細胞分化はエピジ ェネティックと微小環境に影響されます 図 1 : 最初の我々体内の各細胞は同じDNAを含んでいます 皮膚細 転写 幹細胞 胞と脳細胞の違いは 含まれてい る RNA とタンパクの違いです 細胞の微小環境は 我々の体を構 成する全ての細胞に生じるトラン スクリプションとトランスレーシ ョン工程を制御するエピジェネテ ィック ファクターを調整します 転写 骨細胞 筋細胞 タンパク 培養の新たなアプローチは 細胞が存在する本来の微小環境とほぼ同一な状況の下 その細胞から生理的に関連する結果を生じさせることです この技術を用いて培養された細胞から得られたデータは 確実に本来の細胞の機能や生体内での挙動を示している事になります

3 体外 vs 体内 過去数年 多くの新たな研究を通して 生体内細胞から得られた結果と従来からの培養細胞から得られた結果には差異がある事が解明されてきています 例えば 幹細胞で特定の細胞タイプの些細な差異を認識するためには 非常に特定の環境が必要になります この環境を整えるのは 従来からの一般的な細胞培養技術で再現すことは殆ど不可能です 従来の培養装置で培養された腫瘍細胞では 患者から直接採取した腫瘍細胞とは異なるシグナルパターである事が認知せれて来ています 同様の傾向として 著名な科学論 に於いても発表されている様な生物学的結果でもしばしば整合性が無く そのことは 培養されている細胞のプロファイルの変化が不正確な結果を導き出す事が 少なくとも一部関連していると考えられています 研究者は 微小環境が細胞の機能の基本になっていることは 数 年もの間認知しています Francis Crickによる仮説として 分 生物学のセントラルドグマは DNAがRNAを造り RNAがタンパクを造る を前提としています この原理は 体内の全ての細胞は同じDNAを持っているが 皮膚細胞と脳細胞との違いは そのRNAとタンパクの違いで それは環境ファクターが一部関係している事が概念になっています 実際に Lawrence Berkeley National Laboratoryの肺癌研究者 Mina Bissell からの貴重な研究として それぞれの細胞独自の組織特異的機能が培養によって失われることを実証しています しかしながら 細胞固有性は失われる事はなく 培養時に細胞の微小環境を制御することで それぞれ独自の多くの組織特異的特性を 思い出す 事により造る事が出来る事を学びました とBissellは記述しています (Bissell と LaBarge ) 細胞の生体外研究は それらが生産したデータのみに価値がありますが もし そのデータが真実の生態を反映していなければ その価値は疑問になります 科学者は 細胞の自然環境により近づけられるよう どの様な状態がインキュベーターの最適な設定かを決める事を試みてきました 例えば Brown 大学の科学者は インキュベーター プレート (Li) を一般的な平面の状態ではなく 3 次元環境でニューロンを成 させました 彼らは その環境の違いだけから 数百もの遺伝 での発現パターンが異なる事を発 しました

4 圧 と低酸素 細胞の微小環境を再現するために特に重要な2 種のファクターは 圧 と低酸素です 最も一般的なインキュベーターでは 例えば哺乳類細胞を 5%CO2 85% 湿度 37 で培養します この固定された1 種類のみの条件では より確実な細胞本来の環境にするためのファクターを調整することは出来ません Johns Hopkins UniversityのGregg Semenzaラボに於いて 多くの転写因 は低酸素で誘発されることを最初に発 しました その後 酸素レベルは胚発生から癌細胞 (lyer) を含む全ての成熟細胞の働きの工程において 多くの遺伝 の制御に重要である事を突き止めました この最初の発 から 多くの研究者がこれらの低酸素 - 制御転写因 を研究し どの位の酸素レベルが細胞の挙動に影響するかをより深く理解出来るようになりました Xcell Biosciencesは 細胞の微小環境に対して特定の低酸素と圧 レベルの重要性を細胞バイオロジー分野で実証した結果から 細胞培養に新たな提案を致します 酸素と圧 のレベルの調整により 細胞本来の生育環境を正確に反映したシステムを開発しました 例えば 癌細胞は1% 酸素と約 4psiの環境で良く反応しますし 一 皮膚細胞は 20% 酸素とほんの1psiが理想的な環境になります 更なる研究により 圧 や酸素レベルの些細な変化でも ある細胞にはストレスを掛け 数時間のうちにその遺伝 発現に変化が生じるのが分かりました ( 図 2) 20 % O2 / 0 psi 1 % O2 / 2 psi 図 2. 膵臓がん細胞株 (PANC-1) を転移しやすい擬態状態 ( 低酸素で 圧 ) で培養した結果 免疫治療のターゲットである PD-L1 ( 右図 ) の発現が減少した このような培養条件の変化から 膵臓がんの転移疾患の進 状態を 免疫治療の耐性から予期できないだろうか?

5 Xcell Biosciences の装置 Avatar システム は酸素 圧 温度 及び CO2 レベルが自由に調整可能で 細胞本来の生存環境を造れます システムは 複数のテストを通じて 期間これらの独自の状態を維持できるのを実証し ています Avatar システムで成 した細胞は 従来からのインキュベーター と 較してより確実に多量に増殖し 生物学的特性が生体内での特性とより 正確に適合する事を実証しています 装置は 一般的なインキュベーターよ り小型で クリーンベンチの中にも入ります また ガスの消費が少なく 一般的な細胞培養法以上に効率的なワークフロ ーで 最適な条件を決定するために多くの異なる条件で細胞培養の検討を えます Avatar システムでの結果 Avatar システムの評価として 一般的なインキュベーターより格段に優れていることを証明するために 多くの細胞をそれぞれの本来の環境で培養しました 腫瘍の遺伝 発現研究の為に 癌細胞を 元々の腫瘍と同じ発現パターンを生じない標準の細胞培養条件で培養し Avatar システムでは 対象細胞が生体内条件と適合する発現プロファイルを生じる条件で培養しました ある研究で 前 腺がん患者から循環腫瘍細胞 (CTCs) を回収し Avatar システムで 1 週間培養しました ( Xcell ポスター, Genitourniary Cancers Symposium 2016 ) 他の発 と共に チームは CXCR-4 の発現上昇は転移がんに共通してシグナリングや一貫した機能を調整するが そのことは従来のインキュベーターを用いた癌細胞では検出されていなかった事を 出しました 更に 同一患者から得られた個々の細胞から成 した各コロニーは異なる遺伝 発現パターンを生じていたことを つけました このことは 個々の細胞は培養中に組織特異的特性を失っていない事を示しています ( 図 3) 他の評価では 前 腺がん細胞株と末梢 単核細胞を用い ある範囲の低酸素と圧 レベルで培養し 遺伝 とタンパクの発現の差を調べました その結果 本来の環境ではない条件の下では 細胞は異なる免疫治療ターゲットが発現し 生体内では通常は つけられないパスウエイで活性化している事を発 しました ( Xcell ポスター, AACR2015 ) 図 3. Avatar システムで培養した肺がん CTC での発現パターンが 骨転移表現型と一致している ( CXCR4 シグナル伝達 )

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検体採取 患者の検査前準備 検体採取のタイミング 記号 添加物 ( キャップ色等 ) 採取材料 採取量 測定材料 P EDTA-2Na( 薄紫 ) 血液 7 ml RNA 検体ラベル ( 単項目オーダー時 ) ホンハ ンテスト 注 外 N60 氷 MINテイリョウ. 採取容器について 0 0868010 8. その他の検体検査 >> 8C. 遺伝子関連検査 >> minor bcr-abl, mrna quantitative 連絡先 : 3664 基本情報 8C127 minor bcr-abl 分析物 JLAC10 診療報酬 識別 9962 mrna 定量 材料 019 全血 ( 添加物入り ) 測定法 875 リアルタイムRT-PCR 法 結果識別 第 2 章 特掲診療料 D006-2

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