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きみつぐほがり
5 years ago
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1 上原記念生命科学財団研究報告集, 24(2010) 147. ミクログリアを標的とした筋萎縮性側索硬化症の新規治療法開発竹内英之 Key words: 筋萎縮性側索硬化症, ミクログリア, 神経細胞死, グルタミン酸, ギャップ結合阻害剤名古屋大学環境医学研究所免疫系分野緒言筋萎縮性側索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis:als) は, 不可逆的かつ進行性の全身性運動麻痺を呈する, 悲惨な神経変性疾患の代表的疾患であり, 未だ有効な抑止療法, 根本治療が存在しない 1). 近年,ALS を含めた神経変性疾患の病態に, 活性化ミクログリアから放出されるグルタミン酸による興奮性神経傷害機序が大きく関与していることが明らかとなっているが 2-6), これまでの阻害剤では効果に乏しく, 治験の多くは断念された. 我々は, 活性化ミクログリアが, 活性化に伴って発現増加するギャップ結合のヘミチャンネルを介して, 大量のグルタミン酸を細胞外へ放出することを解明し, さらに, ギャップ結合阻害剤によって, 恒常性を乱すことなく, 活性化ミクログリアによる神経細胞死を抑制することに成功した 7,8). 既存のギャップ結合阻害剤は carbenoxolone(cbx) に代表されるグリチルリチン誘導体などであり, 直接実用化に向けて使用することも可能であるが, 中枢神経のみならず全身に分布するために, 長期投与における偽アルドステロン症候群の惹起が懸念される. そこで, これらをリード化合物として, 中枢神経系移行性の高いアナログを合成し, 後述の共培養スクリーニング評価系を用いて, 薬剤の絞り込み選別を行い, 新規ギャップ結合阻害剤 1 薬剤を得た (INI-0602; 国際特許出願番号 PCT/ JP2009/003351). 本研究では, この薬剤を用いて,ALS モデルマウスにおける ALS の新規治療法開発の検討を行った. 方法本研究は, 名古屋大学動物実験委員会および名古屋大学環境医学研究所倫理審査委員会において研究計画について承認を受け実施した. 1. マウス初代培養細胞を用いた共培養スクリーニング評価系マウス初代培養神経細胞は,C57BL/6J マウス第 17 日胎児大脳皮質から作成した 8). マウス初代培養ミクログリアは, C57BL/6J マウス新生仔大脳由来初代培養混合グリア細胞より振盪法によって作成した 9). ミクログリアの活性化には,1μg/ml リポ多糖 (LPS) を用いた. 神経細胞とミクログリアとの共培養系 ( 各 cell/500μl) を用いて, リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) またはギャップ結合阻害剤投与 (CBX または INI-0602 を, 各々 1, 10, 100μM) による培地中グルタミン酸濃度神経細胞死について投与 24 時間後に解析した 8). ギャップ結合阻害効果は, 振盪法 9) にて分離したマウス初代培養アストロサイトの単層培養を用いた scrape loading/dye transfer 法 10) で判定した. 2. モデルマウスによる薬効評価 10 週齢 C57BL/6J マウスの海馬グルタミン酸濃度をマイクロダイアリシス法にて連続測定した. 測定開始 1 時間後に, LPS(10μg/2μl) もしくは PBS 2μl をカニューレより直接投与し, 同時に,20 mg/ 体重 kg の INI-0602 または PBS を腹腔内投与した. ALS モデルマウスとして, ヒト superoxide dismutase 1 G93A 変異トランスジェニックマウス (SOD1 G93A 変異 Tg マウス ; Jackson Laboratory) を用いて, 薬効評価を行った. 発症初期の 7 8 週齢より,5, 10, 20, 40 mg/ 体重 kg の INI-0602 または PBS を週 3 回腹腔内投与した. 1

3. 統計学的解析生存解析を除く各グラフは, 各群の平均値 ± 標準偏差を示す. 有意差検定は,Student s t 検定もしくは一元配置分散分析にて行い,p<0.05 を有意水準とした. 生存解析は Kaplan-Meier 法にて, 有意差検定は log rank test にて行い,p<0.05 を有意水準とした. 結果新規ギャップ結合阻害剤 INI-0602 の薬効を確認するため, ギャップ結合阻害作用を定量的に評価したところ,CBX と同等の顕著な阻害効果を示した ( 図 1).

2 3. 統計学的解析生存解析を除く各グラフは, 各群の平均値 ± 標準偏差を示す. 有意差検定は,Student s t 検定もしくは一元配置分散分析にて行い,p<0.05 を有意水準とした. 生存解析は Kaplan-Meier 法にて, 有意差検定は log rank test にて行い,p<0.05 を有意水準とした. 結果新規ギャップ結合阻害剤 INI-0602 の薬効を確認するため, ギャップ結合阻害作用を定量的に評価したところ,CBX と同等の顕著な阻害効果を示した ( 図 1). 図 1. マウス初代培養アストロサイトにおけるギャップ結合阻害効果. A, scrape loading/dye transfer 法の蛍光顕微鏡写真. CBX および INI-0602 の投与濃度はともに 100μM. スケールバーは 100μm. B, 定量化したグラフ. 1 視野当たりの Lucifer Yellow 陽性細胞数にて評価を行った ( 各群 n=6). CBX および INI-0602 による有意なギャップ結合阻害効果が認められた. *, p<0.05 vs PBS. 2

3 続いて, 活性化ミクログリアによるグルタミン酸放出および神経細胞死に対する薬効について, ミクログリア神経細胞共培養系にて検討したところ, 用量依存的にグルタミン酸放出および神経細胞死の抑制効果を示し,100μM の濃度で, ほぼ完全に抑制した ( 図 2). 図 2. マウス初代培養ミクログリア神経細胞共培養系におけるグルタミン酸産生抑制効果および神経細胞死抑制効果. 薬剤投与後 24 時間での結果を示す ( 各群 n=6). PBS, PBS 処置群. LPS, 1μg/ml LPS 処置群. 100μM の CBX および INI-0602 投与において,PBS 処置群とほぼ同程度までグルタミン酸放出が抑制された. *, p<0.05 vs NT; **, p<0.05 vs LPS;, p<0.05 vs 1μM;, p<0.05 vs 10μM. さらに,in vivo での薬効評価として, マウス海馬グルタミン酸濃度をマイクロダイアリシス法によって連続的に測定した.PBS 投与群では,LPS 刺激後約 5 時間から海馬グルタミン酸濃度が増加し, 刺激後約 6 時間でプラトーに達したのに対し,INI-0602 投与群では有意にグルタミン酸増加が抑制された ( 図 3).CBX 投与群では有意な抑制効果は得られなかった ( 供覧データ示さず ). 3

4 図 3. マウス脳内におけるグルタミン酸放出の抑制効果. 薬剤投与前 30 分間の平均値を 100% として算出した, グルタミン酸濃度の百分率比を示す ( 各群 n=8). 20 mg/ 体重 kg の INI-0602 投与にて有意な脳内グルタミン酸放出抑制効果が認められた. *, p<0.05 vs PBS. 続いて, SOD1 G93A 変異 Tg マウスを用いて,ALS モデルでの薬効を検討した.PBS 投与群に比して,INI-0602 投与群では全ての用量で有意に生存期間が延長し, 病勢進行に伴う体重減少, 筋萎縮, 脊椎湾曲も抑制されていた ( 図 4). 薬効はベル型の用量依存性を示し,10 mg/ 体重 kg の用量で最も効果が高かった ( 図 4). 4

5 図 4. ALS モデルマウスにおける生存延長効果. A, 20 週齢のマウス写真. INI-0602 群では PBS 処置群に比して, 体重減少, 筋萎縮, 脊椎湾曲が抑制されている. B, Kaplan-Meier 生存解析グラフを示す ( 各群 n=24 ). 全ての用量で有意に生存期間の延長を認めた (p<0.0001). 薬効はベル型の用量依存性を示し,10 mg/ 体重 kg の用量で最も効果が高かった. 5

6 考察以上から, 新規ギャップ結合阻害剤 INI-0602 の ALS に対する新規治療法としての可能性が示された. 最近,ALS における神経変性の機序として, 神経細胞自体の原因による神経細胞死 ( 自律性神経細胞死 ) の他に, グリア細胞 ( とくにミクログリア ) からの作用による神経細胞死 ( 非自律性神経細胞死 ) が示され 11,12), 我々の結果もこの機序の妥当性を裏打ちするものと考えられる. 最近, ギャップ結合を形成しないヘミチャンネルが水溶性低分子物質の細胞間隙への放出孔として注目されている 13). ミクログリアは, 活性化した状態ではアメーバ状に運動性が増加するため, 周囲の細胞との接着が粗になり, また, ヘミチャンネルの発現が著増している 7,14) ことと併せて, 他の細胞よりもより露出した状態のヘミチャンネルが多く, ギャップ結合阻害剤に対する親和性もより高いと考えられる. 実際, 本研究の結果において, ギャップ結合阻害剤の薬効はベル型の用量依存性を示しており, 高濃度では活性化ミクログリア以外の細胞のギャップ結合阻害効果を呈している可能性が示唆された. 今後は臨床応用へ向けて, より精密な至適用量, 投与法の設定等を行っていく予定である. 共同研究者本研究の共同研究者は, 名古屋大学環境医学研究所の溝口博之および錫村明生である. 最後に, 本研究を遂行するにあたり研究費の助成を賜りました公益財団法人上原記念生命科学財団に深謝申し上げます. 文献 1) Bruijn, L. I., Miller, T. M. & Cleveland, D. W.:Unraveling the mechanisms involved in motor neuron degeneration in ALS. Annu. Rev. Neurosci., 27 : , ) Barger, S. W. & Basile, A. S.:Activation of microglia by secreted amyloid precursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synaptic function. J. Neurochem., 76: , ) Kipnis, J., Avidan, H., Caspi, R. R. & Schwartz, M. : Dual effect of CD4 + CD25 + regulatory T cells in neurodegeneration: a dialogue with microglia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101: , ) Piani, D., Spranger, M., Frei, K., Schaffner, A. & Fontana, A. : Macrophage-induced cytotoxicity of N-methyl-D-aspartate receptor positive neurons involves excitatory amino acids rather than reactive oxygen intermediates and cytokines. Eur. J. Immunol., 22 : , ) Schwartz, M., Shaked, I., Fisher, J., Mizrahi, T. & Schori, H.:Protective autoimmunity against the enemy within:fighting glutamate toxicity. Trends Neurosci., 26: , ) Takeuchi, H., Jin, S., Suzuki, H., Doi, Y., Liang, J., Kawanokuchi, J., Mizuno, T., Sawada, M. & Suzumura, A.:Blockade of microglial glutamate release protects against ischemic brain injury. Exp. Neurol., 214: , ) Takeuchi, H., Jin, S., Wang, J., Zhang, G., Kawanokuchi, J., Kuno, R., Sonobe, Y., Mizuno, T. & Suzumura, A. : Tumor necrosis factor-α induces neurotoxicity via glutamate release from hemichannels of activated microglia in an autocrine manner. J. Biol. Chem., 281: , ) Takeuchi, H., Mizuno, T., Zhang, G., Wang, J., Kawanokuchi, J., Kuno, R. & Suzumura, A.:Neuritic beading induced by activated microglia is an early feature of neuronal dysfunction toward neuronal death by inhibition of mitochondrial respiration and axonal transport. J. Biol. Chem. 280: , ) Suzumura, A., Mezitis, S. G., Gonatas, N. K. & Silberberg, D. H.:MHC antigen expression on bulk isolated macrophage-microglia from newborn mouse brain : induction of Ia antigen expression by γ-interferon. J. Neuroimmunol., 15: , ) el-fouly, M. H., Trosko, J. E. & Chang, C. C.:Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp. Cell. Res., 168 : , ) Boillee, S., Yamanaka, K., Lobsiger, C. S., Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Kassiotis, G., Kollias, G. & Cleveland, D. W. : Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science, 312 : , ) Yamanaka, K., Chun, S. J., Boillee, S., Fujimori-Tonou, N., Yamashita, H., Gutmann, D. H., Takahashi, R., Misawa, H. & Cleveland, D. W. : Astrocytes as determinants of disease progression in inherited amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Neurosci., 11 : , ) Saez, J. C., Retamal, M. A., Basilio, D., Bukauskas, F. F. & Bennett, M. V. : Connexin-based gap junction hemichannels : gating mechanisms. Biochim. Biophys. Acta., 1711 : ,

7 14) Eugenin, E. A., Eckardt, D., Theis, M., Willecke, K., Bennett, M. V. & Saez, J. C. : Microglia at brain stab wounds express connexin 43 and in vitro form functional gap junctions after treatment with interferon-γ and tumor necrosis factor-α. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 98 : ,

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Untitled 上原記念生命科学財団研究報告集, 23(2009) 136. パーキンソン病における PGES の役割松尾由理 Key words: パーキンソン病, プロスタグランジン, 神経細胞死, ミクログリア, 炎症北里大学薬学部薬理学教室緒言パーキンソン病 (PD) はふるえと歩行障害を伴う疾病で, 黒質ドーパミン (DA) 神経の進行性の脱落により生じる. アルツハイマー病についで有病率の多い神経変性疾患であり,