課題番号 :27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発主任研究者名 : 宮寺浩子キーワード :B 型肝炎ウイルス (HBV) 慢性 B 型肝炎ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC

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うのすけおえづか
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1 課題番号 :27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発主任研究者名 : 宮寺浩子キーワード :B 型肝炎ウイルス (HBV) 慢性 B 型肝炎ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC テトラマー研究成果 : B 型肝炎慢性化ウイルス排除ワクチン応答はヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; HLA) クラス II と強く関連することから HLA クラス II の特定のアリルが HBs 抗原産生の誘導を介して B 型肝炎ウイルス (HBV) に対する免疫応答に大きく寄与すると考えられるこの一連の免疫応答に関わる HLA クラス II 拘束性エピトープおよびこれを認識する T 細胞を同定することが出来れば HBV に対する免疫応答の詳細を明らかにする糸口となるだけでなく B 型肝炎慢性化や再活性化等のリスクを予測する上でも有用であるそこで本研究では HLA クラス II の一つであり B 型肝炎慢性化との関連が報告されている HLA-DP に着目し HLA-DP 拘束性 HBV エピトープを同定し慢性 B 型肝炎の病態に伴う T 細胞免疫系の変動を明らかにすることを目的として研究を行ったまずHLA-DP 拘束性 HBVペプチドを同定するため HLA-DPが結合しうるペプチド領域を同定することとし組換えHLAタンパク質と合成 -ペプチドとの相互作用を解析するためのアッセイ系を確立した( 投稿準備中 ) 以下に示す日本人集団に高頻度に維持されるHLA-DPハプロタイプ6 種類のDPアリル産物を組換えタンパク質として発現した慢性肝炎抵抗性ハプロタイプ:HLA-DP0401 (DPA1*01:03-DPB1*04:01), HLA-DP0402 (DPA1*01:03-DPB1*04:02), HLA-DP0201 (DPA1*01:03-DPB1*02:01) 感受性ハプロタイプ:HLA-DP0501 (DPA1*02-DPB1*05:01), HLA-DP0901 (DPA1*02:01-DPB1*09:01) 中立性ハプロタイプ: HLA-DP0301 (DPA1*02:02-DPB1*03:01) これらのDPA1-DPB1ハプロタイプのアリル産物を組換えタンパク質として発現し各 HLA-DPアリル産物に結合するHBV 抗原ペプチド領域を表面抗原 (HBs) (59ペプチド), コア抗原 (HBc)(40ペプチド) をカバーする合成ペプチドライブラリーから探索したその結果特定のHLA-DPアリル産物に結合するHBs, HBc 領域を複数箇所同定した ( 投稿準備中 ) さらに短鎖ペプチドを用いた結合解析を行いこれらのウイルス抗原ペプチド配列とHLA-DPとの間の相互作用に大きく寄与するアミノ酸残基を推定したしかし疎水性ペプチドの場合は非特異的シグナルを生じるため測定が困難であり中でも数種類のペプチドについては合成困難のため測定を行うことが出来なかった HBs 抗原は疎水性領域が多いため半数以上のペプチドについてHLAとの結合アッセイを行うことが出来なかったこのため次に異なる評価系 (HLA 発現アッセイ ) で HLA-DP 結合領域の探索を行ったこの方法では HLAをペプチドとの融合タンパク質として培養細胞に発現し内部コントロール (GFP) を用いて細胞表面 HLA 発現量を定量化する (Miyadera, et al J. Clin. Invest.; 宮寺他 2016 日本臨床免疫学会会誌 ) HLAはペプチドと強く結合するほどタンパク質複合体が安定化し細胞表面に高発現する性質があるそのため細胞表面のHLA 発現量を測定することによりペプチドとの相互作用の相対的な強さを推測評価することが出来るこの方法を用いることにより疎水性領域を含むHBs, HBc 全領域についてHLAとの結合性を測定することが可能であった H28 年度はHLA 発現アッセイを用いて 3 種類のHLA-DPアリルについてHBs, HBc 抗原を対象としたHLA 結合領域探索を行い特定のHLA-DPにアリル特異的かつ強い相互作用を介して提示されうるHBs, HBc 抗原領域を複数箇所見出した当初の研究計画ではHLAテトラマーを作成することにより HLA-DP 拘束性 HBs, HBc 抗原ペプチドを認識するT 細胞を同定する予定であったが HLAテトラマー作製が困難であったため他の方法によって抗原特異的 T 細胞同定を進めることとした具体的には HLA-DPとの結合が示唆されたHBs, HBc 抗原領域についてHLA-DPとの融合タンパク質を作成し HLA- 抗原複合体として培養細胞表面に安定発現させるこれを抗原提示細胞として用いワクチン応答陽性健常人末梢血中の反応性 T 細胞をスクリーニングする平成 28 年度はこのための抗原提示細胞作成を開始した

2 Subject No. :27 指 1303 Title :Development of T-cell staining reagent for study of immune responses in chronic hepatitis B Researchers :Hiroko Miyadera Key word :hepatitis B virus (HBV), chronic hepatitis B infection (CHB), human leukocyte antigens (HLA), HLA tetramer Abstract :Susceptibility to chronic hepatitis B (CHB) and responses against HBV vaccination are associated strongly with polymorphisms in human leukocyte antigen (HLA) class II region, indicating that HLA class II are one of the major factors that mediate adapted immune responses against HBV. To identify detailed mechanisms of HLA class II-mediated immune responses, we aim to identify HBs and HBc antigen peptides that are presented to HLA class II and are involved in T-cell mediated immunity and antibody production against HBV. As the first step, we established in vitro assay to identify HLA class II-restricted HBV peptides. First, we prepared recombinant proteins encoded by the six HLA-DP haplotypes that are maintained at high frequencies in the Japanese population. These recombinant proteins were then used for HLA-peptide binding assay using labeled synthetic peptides. The peptide libraries that cover the entire region of HBs and HBc antigens were designed and used for screening. The in vitro assay worked well for approximately half of peptides in the libraries but did not work for hydrophobic regions. Therefore, we next established alternative methods that can also be applicable for hydrophobic regions. Up to the present, we identified several regions of HBs and HBc antigens that can be presented to particular HLA-DP allele products. Using the identified HBs and HBc regions, we plan to search for HLA-DP-restricted T-cell epitopes. Researchers には分担研究者を記載する

国際開発研究費報告書 (H28 年度 ) 課題番号 27 指 1303 ( 主任研究者 : 宮寺浩子 ) 研究課題名慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発背景 1:B 型肝炎慢性化抵抗性感受性と関連する HLA-DPB1 アリルが同定された目的 : HLA-DP 拘束性 HBV 抗原ペプチド (T 細胞エピトープ ) を認識する抗原特異的 T

2014 PLoS One 背景 2: HLA クラス II がどのような機序で B 型肝炎慢性化の抑制促進に関わるのかその機序は不明である DP0401, DP0402 慢性化抑制と関連ウイルス排除と関連ワクチン応答と関連 DP0501, DP0901 慢性化と関連ワクチン不応答と関連 CTL 活性化 (Th1) B 細胞活性化 (Th2)?

3 国際開発研究費報告書 (H28 年度 ) 課題番号 27 指 1303 ( 主任研究者 : 宮寺浩子 ) 研究課題名慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発背景 1:B 型肝炎慢性化抵抗性感受性と関連する HLA-DPB1 アリルが同定された目的 : HLA-DP 拘束性 HBV 抗原ペプチド (T 細胞エピトープ ) を認識する抗原特異的 T 細胞を同定することにより B 型肝炎に対する免疫応答機序を解明する抗原特異的 T 細胞を染色するための試薬 (HLA テトラマー ) を開発し B 型肝炎の様々な病態での T 細胞の動態を明らかにする H28 年度進捗 : Modified from Nishida, Sawai et al PLoS One 背景 2: HLA クラス II がどのような機序で B 型肝炎慢性化の抑制促進に関わるのかその機序は不明である DP0401, DP0402 慢性化抑制と関連ウイルス排除と関連ワクチン応答と関連 DP0501, DP0901 慢性化と関連ワクチン不応答と関連 CTL 活性化 (Th1) B 細胞活性化 (Th2)? ウイルス排除中和抗体産生慢性肝炎 1. HLA-DP 提示 HBV 抗原の同定 HLA-DPアリル3 種類について HBs, HBc 抗原領域を対象とした結合スクリーニングを実施した 2. T 細胞エピトープ探索健常人末梢血 (HBVワクチン陽性者) を用いたT 細胞エピトープ探索を行うための HLA- 抗原複合体の安定発現株 ( 抗原提示細胞 ) の作成を開始した 3.T 細胞染色試薬 (HLAテトラマー) の大量調製系を確立する技術的な課題があり計画を一部変更した HLAテトラマーに代わる方法としてHLA- 抗原複合体の安定発現株 ( 抗原提示細胞 ) のパネルを作成しこれを用いたT 細胞染色を行うこととした

1. HLA-DP 提示 HBV 抗原の同定 HLA- ペプチド結合解析の測定法を二種類確立し HBs, HBc ライブラリーから HLA-DP アリル特異的に結合する領域を見出した今後 HLA 結合領域を対象として T 細胞エピトープを同定する 1 10

G A 70 80 90 100 110 120 G A F G P G F T P P H G G L L G W S P Q A Q G I L T T V P A A P P P A S T N R Q S G R Q P T P I S P P L R

R T G D P A P N M E N T T S 190 200 210 220 230 240 G F L G P L L V L Q A G F F L L T R I L T I P Q S L D S W W T S L N F L G G A

D Y Q G M L P V C P L L P G T S T T S T G P C K T C T I 310 320 330 340 350 360 P A Q G T S M F P S C C C T K P S D G N C T C I P

L S P F L P L L P I F F C L W V Y I 10 20 30 40 50 60 M Q L F H L C L I I S C S C P T V Q A S K L C L G W L W G M D I D P Y K E F

L M N L A T W V G S N L E D P A S R E L V V S Y V N V 130 140 150 160 170 180 N M G L K I R Q L L W F H I S C L T F G R E T V L E

Q S R E S Q C 1HLA- ペプチド結合測定により HLA-DP 結合 HBV 抗原ペプチドを同定した 2HLA 発現アッセイにより HBs, HBc 全領域から HLA 提示領域を見出した wikimedia.

を改変 ) TM4 TM3 1HLAII α 鎖安定発現株ビオチン化ペプチドアビジン -HRP DPA1 puro R 安定発現 Ni-NTA plate (96-well) 組換え HLA-DP DP0402 DP0401 DP0201 DP0301

Chen, manuscript in preparation 2HLAII β 鎖を一過性発現 ( レトロウイルスベクター pmxs-ig) 異なるウイルス濃度 (2~3 点 ) で感染 DPA1 DPB1 IRES GFP 一過性発現 puro R HLA

4 1. HLA-DP 提示 HBV 抗原の同定 HLA- ペプチド結合解析の測定法を二種類確立し HBs, HBc ライブラリーから HLA-DP アリル特異的に結合する領域を見出した今後 HLA 結合領域を対象として T 細胞エピトープを同定する M G G W S S K P R Q G M G T N L S V P N P L G F F P D H Q L D P A F G A N S N N P D W D F N P N K D H W P E A N Q V G A G A F G P G F T P P H G G L L G W S P Q A Q G I L T T V P A A P P P A S T N R Q S G R Q P T P I S P P L R D S H P Q A M Q W N S T T F H Q A L L D P R V R G L Y F P A G G S S S G T V N P V P T T A S P I S S I F S R T G D P A P N M E N T T S G F L G P L L V L Q A G F F L L T R I L T I P Q S L D S W W T S L N F L G G A P T C P G Q N S Q S P T S N H S P T S C P P I C P G Y R W M C L R R F I I F L F I L L L C L I F L L V L L D Y Q G M L P V C P L L P G T S T T S T G P C K T C T I P A Q G T S M F P S C C C T K P S D G N C T C I P I P S S W A F A R F L W E W A S V R F S W L S L L V P F V Q W F V G L S P T V W L S V I W M M W Y W G P S L Y N I L S P F L P L L P I F F C L W V Y I M Q L F H L C L I I S C S C P T V Q A S K L C L G W L W G M D I D P Y K E F G A S V E L L S F L P S D F F P S I R D L L D T A S A L Y R E A L E S P E H C S P H H T A L R Q A I L C W G E L M N L A T W V G S N L E D P A S R E L V V S Y V N V N M G L K I R Q L L W F H I S C L T F G R E T V L E Y L V S F G V W I R T P P A Y R P P N A P I L S T L P E T T V V R R R G R S P R R R T P S P R R R R S Q S P R R R R S Q S R E S Q C 1HLA- ペプチド結合測定により HLA-DP 結合 HBV 抗原ペプチドを同定した 2HLA 発現アッセイにより HBs, HBc 全領域から HLA 提示領域を見出した wikimedia.org pres1 HBs( 表面抗原 ) ペプチドライブラリー TM1 TM2 S pres2 HBc( コア抗原 ) ペプチドライブラリー HLA 発現アッセイの概要 (Miyadera, et al J. Clin. Invest. を改変 ) TM4 TM3 1HLAII α 鎖安定発現株ビオチン化ペプチドアビジン -HRP DPA1 puro R 安定発現 Ni-NTA plate (96-well) 組換え HLA-DP DP0402 DP0401 DP0201 DP0301 DP0501 DP0901 Mock HBs( 表面抗原 ) HBc( コア抗原 ) C. Chen, manuscript in preparation 2HLAII β 鎖を一過性発現 ( レトロウイルスベクター pmxs-ig) 異なるウイルス濃度 (2~3 点 ) で感染 DPA1 DPB1 IRES GFP 一過性発現 puro R HLA GFP Peptide [um] Peptide_#1 (HBs) z Peptide [um] Mock Peptide_#2 (HBc) DP*aa DP*bb DP*cc DP*dd DP*ee DP*ff 3HLA, GFP 発現量測定 GFP HLA GFP ( 内部コントロール ) Mock DP*aa DP*bb DP*cc DP*dd DP*ee DP*ff

5 研究発表及び特許取得報告について課題番号 : 27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するための T 細胞染色試薬の開発主任研究者名 : 宮寺浩子論文発表論文タイトル著者掲載誌掲載号年 HLA クラス II 結合ペプチドの探索同定法の開発宮寺浩子野口恵美子溝上雅史徳永勝士日本臨床免疫学会会誌 Vol. 40 No 年学会発表タイトル発表者学会名場所年月 Stability profiling of HLA class II protein for disease association studies Hiroko Miyadera, Jun Ohashi and Katsushi Tokunaga The 13th International Congress of Human Genetics 京都 2016 年 4 月 A large scale screening of HLA-class IIbinding peptides from HBs and HBc peptide libraries Hiroko Miyadera, Yuki Okabe, Cindy Chen, Katsushi Tokunaga, Masashi Mizokami The American Association of Immunologist (AAI) annual meeting 米国 2016 年 5 月 HLA-DP 提示 HBs HBc 抗原領域の探索宮寺浩子岡部由紀 Cindy Chia- Jung Chen 徳永勝士考藤達哉溝上雅史第 52 回日本肝臓学会総会幕張 2016 年 5 月 HLA class II protein stability and disease susceptibility. Miyadera, J. Ohashi, and K. Tokunaga 16th International Congress of Immunology 豪州 2016 年 8 月 HLA 結合ペプチドの大規模探索法の開発宮寺浩子徳永勝士野口恵美子第 44 回日本臨床免疫学会総会東京 2016 年 9 月 HLA クラス II 提示 B 型肝炎ウイルス抗原領域の探索宮寺浩子岡部由紀 Cindy Chia- Jung Chen 徳永勝士溝上雅史第 25 回日本組織適合性学会大会札幌 2016 年 10 月 Large scale analysis of HLA-peptide interactions H. Miyadera, Y. Okabe, K. Tokunaga, and E. Noguchi 66th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics カナダ 2016 年 10 月

6 研究発表及び特許取得報告についてその他発表 ( 雑誌テレビラジオ等 ) タイトル発表者発表先場所年月日該当なし特許取得状況について出願申請中のものは ( ) 記載のこと発明名称登録番号特許権者 ( 申請者 ) ( 共願は全記載 ) 登録日 ( 申請日 ) 出願国該当なし該当がない項目の欄には該当なしと記載のこと主任研究者が班全員分の内容を記載のこ

4. 発表内容 : [ 研究の背景 ] 1 型糖尿病 ( 注 1) は主に免疫系の細胞 (T 細胞 ) が膵臓の β 細胞 ( インスリンを産生する細胞 ) に対して免疫応答を起こすことによって発症します特定の HLA 遺伝子型を持つと 1 型糖尿病の発症率が高くなることが日本人欧米人ア

4. 発表内容 : [ 研究の背景 ] 1 型糖尿病 ( 注 1) は主に免疫系の細胞 (T 細胞 ) が膵臓の β 細胞 ( インスリンを産生する細胞 ) に対して免疫応答を起こすことによって発症します特定の HLA 遺伝子型を持つと 1 型糖尿病の発症率が高くなることが日本人欧米人ア免疫タンパク質の不安定さが自己免疫疾患のかかりやすさに関係 - 定説とは異なる発症機序の可能性 - 1. 発表者 : 宮寺浩子 ( 東京大学大学院医学系研究科国際保健学専攻人類遺伝学分野助教 ( 研究当時 )) ( 現国立国際医療研究センター肝炎免疫研究センター上級研究員 ) 徳永勝士 ( 東京大学大学院医学系研究科国際保健学専攻人類遺伝学分野教授 ) 大橋順 ( 筑波大学医学医療系准教授 (

課題番号 :27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発 主任研究者名 : 宮寺浩子 キーワード :B 型肝炎ウイルス (HBV) 慢性 B 型肝炎 ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC

課題番号 :27 指 1303 研究課題名 : 慢性 B 型肝炎の病態変動を検出するためのT 細胞染色試薬の開発主任研究者名 : 宮寺浩子キーワード :B 型肝炎ウイルス (HBV) 慢性 B 型肝炎ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens; (HLA)), MHC