The Japan Society for Clinical Immunology

Size: px

Start display at page:

Download "The Japan Society for Clinical Immunology"

やすもりごちょう
4 years ago
Views:

1 Jpn. J. Clin. Immunol., 40 (1)35~39 (2017)C 2017 The Japan Society for Clinical Immunology 35 第 44 回総会ポスター賞受賞記念論文総説 ( 推薦論文 ) 推薦者 : 慶應義塾大学医学部先端科学研究所細胞上法研究部門河上裕 HLA クラス II 結合ペプチド探索法の開発 *1, 2, 宮寺浩子 3, 野口恵美子 *1, 溝上雅史 *2 *3, 徳永勝士 Development of an assay system for large scale analysis of HLA class II-binding peptides Hiroko Miyadera *1, 2, 3, Emiko Noguchi *1, Masashi Mizokami *2 and Katsushi Tokunaga *3 *1 Department of Medical Genetics, Faculty of Medicine, University of Tsukuba *2 Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine *3 Department of Human Genetics, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo (Accepted December 9, 2016) summary Genes encoding the human leukocyte antigens (HLA) are associated with diverse immunological disorders, including autoimmune diseases and infections. Recently, significant progresses have been made in the HLA typing technologies through the use of next generation sequencers. The reliable platforms for the SNP-based imputation of HLA genotypes have also been established. These technical advancements should enable further identification of HLA associations with diseases. One of the remaining questions is the mechanism through which HLA confer disease susceptibility. As a first step toward comprehensive understanding of functional variations among HLA allele products, we established a protocol to analyze the HLA-binding peptides through quantification of cell-surface HLA expression in an engineered cell line. In this article, we summarize the overview of the cell-surface HLA expression assay, which we plan to use for screening and collection of HLA-peptide interaction profiles for large sets of HLA alleles and peptides. Key words human leukocyte antigens (HLA); HLA-disease association; HLA-peptide interaction; HLA class II; autoimmune diseases 抄録ヒト白血球抗原 (human leukocyte antigens(hla)) 遺伝子は様々な免疫系疾患と非常に強く関連することが知られている. 近年,HLA の解析技術の進展および HLA の遺伝子型推定法 (imputation) の開発により,HLA と疾患との関連をより大規模に行うことが可能となりつつある. 一方,HLA が疾患と関連する機序については十分に解明されていない点が多く残されており, 今後, より多数の HLA アリルの機能性を明らかにする必要がある. その一つの試みとして著者らは HLA クラス II 結合ペプチドの探索および結合性の評価を多数のアリルについて行うためのアッセイ系を開発している. 本稿では, その研究背景と測定法の概要を紹介する. はじめに HLA は内在外来性ペプチドを抗原提示細胞表面に提示し,T 細胞の分化活性化制御を担う獲得免疫系の主要分子である.HLA 領域は第 6 染色体短腕部 (6p21) に位置し, 各座位の遺伝子が高度の多型を呈する.HLA クラス I のうち HLA-B では 3,200 *1 筑波大学医学医療系遺伝医学 *2 国立国際医療研究センター肝炎免疫研究センターゲノム医科学プロジェクト *3 東京大学大学院医学系研究科人類遺伝学分野アリル,HLA クラス II のなかでも最も多型性が高い HLA-DRB1 では 1,600 アリルがアミノ酸配列レベルで異なるアリルとして登録されている (IPD-IMGT/ HLA Release , )( ac.uk/ipd/imgt/hla/) 1).HLA 領域における多様性は HLA の機能的多様性と密接に関わっており, 免疫応答の個体差を生み出すと同時に, 集団レベルでの免疫応答の多様性をもたらしている. このような HLA の多様性は, 感染症をはじめとする様々な免疫系疾患に対する感受性抵抗性との関わりを通して維持されてきたと考えられている.HLA と疾患

2 36 日本臨床免疫学会会誌 (Vol. 40 No. 1) との関連は 1960 年代終わりから 1970 年代初頭にかけてリンパ腫や自己免疫疾患について見出され 2), その後, 様々な免疫系疾患においても HLA との強い関連が報告されている. これまでに感染症, 自己免疫疾患, アレルギー, 固形がん, 薬剤副作用 ( 重症薬疹 ) などを含む 100 以上の疾患において,HLA 領域が最も強い疾患感受性領域であることが見出されている. 臨床免疫学に関わるさまざまな関連分野の中で, HLA 遺伝子解析技術および疾患関連研究は近年急速に発展した領域の一つである.HLA タイピングに次世代シーケンサを用いることにより, 非コード領域の配列決定 (HLA アリルの 8 桁レベルでの同定 ) が可能となり 3), また,HLA 領域の SNP データを基にした HLA アリルの高精度予測法 (imputation) が日本人を含む各ヒト集団において開発されている 4, 5). これらの新規技術の確立により,HLA と疾患との関連解析をより大規模かつ詳細に行うことが可能となりつつあることから, 今後も HLA と疾患との関連についてより多くの知見が蓄積してゆくと予想される. HLA と疾患とが関連する機序については, 殆どの疾患についてまだ十分な知見が得られていないが, 多型の多くがペプチド結合溝に存在することから ( 図 1 ), 提示ペプチドのアリル間の違いが疾患感受性抵抗性に寄与すると考えられている. 例えば, 関節リウマチ,1 型糖尿病, セリアック病などではアミノ酸の一部が脱イミド化, 脱アミド化したペプチドや, 異なるペプチド間の融合により新たに形成されたペプチドが HLA に提示され T 細胞応答の標的となっていることが見出されており, 関節リウマチで図 1 HLA クラス II の構造 HLA クラス II は α へリックスと β シートの間のペプチド結合溝に, 約 9 30 残基のペプチドを提示する.HLA の多型はペプチドと相互作用する領域に集中しており,HLA アリル間では提示するペプチドのレパトアが異なる. はシトルリン化ペプチド (vimentin, aggrecan, 他 ), 1 型糖尿病ではインスリン ( 融合型ペプチド ), セリアック病では脱アミド化したグリアジンペプチドが CD4 陽性 T 細胞の標的として同定された 6 8). HLA が病態に関わる機序を解明するためには免疫学, 生化学, 構造生物学など幅広いアプローチが必要であるため, 機能解析が詳細に行われている HLA アリルは少数にとどまる. 今後,HLA と疾患との関連の機序を読み解くには, 個別の疾患研究に加え, 多数の HLA アリル産物の機能性を体系的に明らかにし, 疾患感受性抵抗性に関連する特性を同定するアプローチも有効である. このような観点から, 著者らは HLA クラス II のタンパク質安定性の網羅的解析を行い,HLA-DQ タンパク質低安定性と自己免疫疾患感受性との関連を見出した 9). さらに HLA 結合ペプチドレパトアについても体系的に解析評価する仕組みの確立を目指して, 現在, HLA 結合ペプチド探索法の開発を進めている. HLA-ペプチド結合アッセイ HLA 関連疾患の発症進行機序を明らかにするためには,T 細胞アッセイによる T 細胞エピトープ同定や,HLA 結合ペプチド溶出による抗原ペプチドの同定などの手法によって, 抗原特異的免疫応答に関わる自己非自己抗原ペプチドをつきとめる必要がある. これらの解析に加え,HLA と特定のペプチドとの結合親和性について知見を得る場合,HLA-ペプチド結合アッセイを行う. 一般的には,HLA ホモ接合細胞株から精製した HLA タンパク質または組換え HLA タンパク質を用いて,HLA と合成ペプチドとの相互作用の強さを測定する.HLA とペプチドとの相互作用の検出には ELISA や高速クロマトグラフィ (HPLC) などさまざまな方法が用いられている 10 13). 検出方法の違いはあるが, いずれの場合も基本的には HLA とペプチドとの結合親和性 ( 多くの場合, 標準ペプチドに対する 50% 結合阻害濃度 (IC50)) を測定することにより, 結合の強さを評価する.Immune Epitope Database( iedb.org/) 14) に収集されている MHC-ペプチド結合データ (MHC-Ligand Assays) の多くは, このような相互作用解析から得られたデータである. HLA-ペプチド結合アッセイは, 長年使われている方法であるが課題点もある. 例えば,IC50 を求めるためには各 HLA アリルについて, 適切なコン

HLA II 37 トロールペプチドを予め設定する必要がある. また, IC50 によって HLA アリル間のペプチド結合能の違いを評価することは困難である. 精製 HLA タンパク質を用いて解析を行う場合, その調整に多大な労力を要するため, 多数の HLA アリルを対象として解析を行うのは容易ではない.

3 HLA II 37 トロールペプチドを予め設定する必要がある. また, IC50 によって HLA アリル間のペプチド結合能の違いを評価することは困難である. 精製 HLA タンパク質を用いて解析を行う場合, その調整に多大な労力を要するため, 多数の HLA アリルを対象として解析を行うのは容易ではない. 疎水性ペプチドを用いる場合, 溶解度が低いため実効濃度の誤差が大きいだけでなく, 非特異的シグナルを生じやすいという問題点もある. さらに, ペプチドの合成に要する時間とコストの問題も大規模な解析を進める上での障壁になりうる. このような理由から, これまでの HLA 結合ペプチド探索研究は, 比較的少数の HLA アリルと, 数種類 ~100 種類程度のペプチドとの組合せに限られている. 今後,HLA 結合ペプチド探索をより大規模に行うためには, 従来の方法と比較して定量性, 再現性が高く, 多数の HLA アリルに拡張可能な測定系が必要である. HLA 発現アッセイ HLA クラス II は,αβ サブユニット間の相互作用による安定化や高親和性ペプチド提示に伴う HLA- ペプチド複合体の安定化によって細胞表面発現量が上昇する 15, 16). 著者らは, このような HLA の特性を利用することによって HLA 結合ペプチド探索を行える可能性に着目し, HLA 発現アッセイを開発した. この測定系は元々,HLA タンパク質安定性の評価を目的として開発した方法であるが 9), HLA 結合ペプチド探索にも有用であったため, その一部を改良したものである. HLA 発現アッセイの概要を図 2,3 に示す. まず,HLA クラス II α 鎖安定発現株をマウス線維芽細胞株を宿主として樹立する. この株に HLA クラス II β 鎖とペプチドとの融合タンパク質を一過性に発現させる. この時,β 鎖のシグナル配列と mature 配列との間に, ペプチドをコードする配列を挿入することにより,HLA をペプチドとの融合タンパク質として発現させる.β 鎖とペプチドとの融合タンパク質は Kozono らにより考案され 17),HLA クラス II- ペプチド複合体のタンパク質構造解析に広く用いられている. 本研究で用いた β 鎖発現ベクター (pmxs-ig, レトロウイルスベクター ) 18) には IRES, GFP がコードされている. そのため,β 鎖発現ベクターの導入量に応じて GFP が細胞質で一過性発現する.α 鎖安定発現株に β 鎖発現ベクターを異なる 2 点以上の濃度で感染させ, 感染 48 時間後, 細胞表面に発現した HLA 量および, 細胞質に発現した GFP 量 ( 内部コントロール ) をフローサイトメータで測定する. 細胞表面 HLA 発現量と細胞内図 2 HLA クラス II タンパク質安定性の測定 1 HLA α 鎖の安定発現株を作製する ( 例として DQA1 安定発現株を示す ).α 鎖は単独では細胞表面に発現しない.2 β 鎖をコードする遺伝子 (DQB1)( N 末端にペプチドの配列を融合 ) および IRES-GFP を持つ発現ベクター (pmxs-ig) 18) をレトロウイルス発現系を用いて α 鎖安定発現株に感染させる.α 鎖と β 鎖とがヘテロ二量体を形成すると細胞表面に HLA が発現する. 感染した DQB1 発現ベクター量に応じて GFP が細胞質内に発現する.3 α 鎖安定発現株に DQB1 発現ベクターを複数の異なる濃度で導入する. 各濃度での GFP, HLA 発現量をフローサイトメータで測定し, 異なる濃度間での GFP 増分に対する HLA 増分を求める. この値 (HLA/GFP) を,HLA の細胞表面発現量の指標とする.(Miyadera et al を改変.)

4 38 日本臨床免疫学会会誌 (Vol. 40 No. 1) 図 3 HLA 発現アッセイによる HLA 結合ペプチドの探索 GFP 発現量の比 (HLA/GFP)( 図 2,3 中のグラフの傾き ) を算出し, この値を HLA 発現量の指標とした. 内部コントロールである GFP は β 鎖発現ベクターの導入効率を補正する目的で用いている. HLA との結合が弱いと考えられるペプチド ( ポリグリシン (9 mer, 12 mer) など ) をネガティブコントロールペプチドとして用いる. また, 特定のアリル (DQA1*01:02-DQB1*06:02) の HLA/GFP 値を毎実験日ごとに測定し, 実験間の標準化に用いている. HLA 発現アッセイを結合親和性が既知の数種類の HLA- ペプチドの組合せについて行ったところ, 親和性の強さに応じた HLA/GFP 値を得た ( 図 2 ). また, 従来の HLA-ペプチド結合アッセイで測定困難であった疎水性領域についても HLA 発現アッセイでは測定が可能であった ( 未発表データ ). これらの結果から,HLA 発現アッセイは HLA クラス II 結合ペプチドの探索と結合性の評価に有用であると考えている. HLA/GFP 値は HLA-ペプチド複合体の細胞表面発現量の相対的な指標であり, 主に HLA-ペプチド複合体の安定性を反映する.HLA-ペプチド複合体の安定性を決めるのは HLA タンパク質自体の安定性とペプチドの結合親和性であるため,HLA/GFP 値にはこの両者の情報が含まれる. このように, HLA/GFP 値は従来の相互作用解析で得られる IC50 値や結合親和性とは異なる指標であり, これらの既知のパラメータと比較可能な値に換算することは出来ない. HLA の細胞表面発現量は,HLA と T 細胞受容体との相互作用のアビディティの大きさに直接影響する主要なパラメータの 1 つである. このため HLA/ GFP 値は従来の相互作用解析で得られる生化学的パラメータよりも,HLA の機能性に, より直結したパラメータであり,HLA アリル間や異なる提示ペプチド間の結合性機能性の比較に適している. 今後, 測定系の最適化, 高速化をさらに進め, より多数の HLA アリルについて結合ペプチドプロファイルを明らかにする予定である.

5 HLA II 39 おわりに HLA と疾患との関連解析に加え, 結合ペプチドレパトアなどの HLA の機能的多様性についての知見が蓄積することにより, 今後,HLA 遺伝子型に基づいた予防法治療法の開発が大きく進展することが期待される. 謝本研究は文部科学省科学研究費補助金 (16KT 0117, ), 日本医療研究開発機構肝炎等克服緊急対策研究事業, 厚生労働省国際医療研究開発事業の助成を受けて行われた. レトロウイルスベクター (pmxs) およびパッケージング細胞 (PLAT-E) は北村俊雄先生 ( 東京大学医科学研究所 ) にご供与いただいた. 本研究は多くの先生方との共同研究の成果によるものであり, この場を借りて深謝したい. 文 1) IPD-IMGT/HLA Database ( ipd/imgt/hla/). 2) Dausset, J., et al.: The association of the HL-A antigens with diseases. Clinical Immunology and Immunopathology. 3: , ) Hosomichi, K., et al.: The impact of next-generation sequencing technologies on HLA research. J Hum Genet. 60: , ) Khor, S.S., et al.: High-accuracy imputation for HLA class I and II genes based on high-resolution SNP data of population-specific references. Pharmacogenomics J. 15: , ) Okada, Y., et al.: Construction of a populationspecific HLA imputation reference panel and its application to Graves disease risk in Japanese. Nat Genet. 47: , ) Scally, S.W., et al.: A molecular basis for the association of the HLA-DRB1 locus, citrullination, and rheumatoid arthritis. J Exp Med. 210: , 辞献 7) Delong, T., et al.: Pathogenic CD4 T cells in type 1 diabetes recognize epitopes formed by peptide fusion. Science. 351: , ) Stamnaes, J., Sollid, L.M.: Celiac disease: Autoimmunity in response to food antigen. Semin Immunol. 27: , ) Miyadera, H., et al.: Cell-surface MHC density profiling reveals instability of autoimmunity-associated HLA. J Clin Invest. 125: , ) Rothbard, J.B., Busch, R.: Binding of biotinylated peptides to MHC class II proteins on cell surfaces. Curr Protoc Immunol. Chapter 18: Unit 18 1, ) Buus, S., et al.: Measurement of peptide-mhc interactions in solution using the spin column filtration assay. Curr Protoc Immunol. Chapter 18: Unit 18 4, ) Hammer, J., et al.: Precise prediction of major histocompatibility complex class II-peptide interaction based on peptide side chain scanning. J Exp Med. 180: , ) Southwood, S., et al.: Several common HLA-DR types share largely overlapping peptide binding repertoires. J Immunol. 160: , ) Immune Epitope Database ( 15) Nelson, C.A., et al.: Peptides determine the lifespan of MHC class II molecules in the antigenpresenting cell. Nature. 371: , ) Arneson, L.S., et al.: Hydrogen bond integrity between MHC class II molecules and bound peptide determines the intracellular fate of MHC class II molecules. J Immunol. 167: , ) Kozono, H., et al.: Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides. Nature. 369: , ) Kitamura, T., et al.: Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp Hematol. 31: , 2003.

4. 発表内容 : [ 研究の背景 ] 1 型糖尿病 ( 注 1) は主に免疫系の細胞 (T 細胞 ) が膵臓の β 細胞 ( インスリンを産生する細胞 ) に対して免疫応答を起こすことによって発症します特定の HLA 遺伝子型を持つと 1 型糖尿病の発症率が高くなることが日本人欧米人ア

4. 発表内容 : [ 研究の背景 ] 1 型糖尿病 ( 注 1) は主に免疫系の細胞 (T 細胞 ) が膵臓の β 細胞 ( インスリンを産生する細胞 ) に対して免疫応答を起こすことによって発症します特定の HLA 遺伝子型を持つと 1 型糖尿病の発症率が高くなることが日本人欧米人ア免疫タンパク質の不安定さが自己免疫疾患のかかりやすさに関係 - 定説とは異なる発症機序の可能性 - 1. 発表者 : 宮寺浩子 ( 東京大学大学院医学系研究科国際保健学専攻人類遺伝学分野助教 ( 研究当時 )) ( 現国立国際医療研究センター肝炎免疫研究センター上級研究員 ) 徳永勝士 ( 東京大学大学院医学系研究科国際保健学専攻人類遺伝学分野教授 ) 大橋順 ( 筑波大学医学医療系准教授 (