(2)GFP蛍 ロー ンにおい て は っき りと した蛍光 が 肉 眼で観 察 され 光 強度 ASKA library 開 発 時 にIPTG添 加 後 のGFPに 蛍 光 の 有 無 を 目 視 で 調 べ た. 全 体 で2,200を よる 超 えるク た. 生 育 へ の 影 響 とGFP

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1 SEMINAR ROOM セミナー 室 細 胞 の完全 理 解 に向 け て: 大 腸 菌 を用 い た シス テ ム バ イ オ ロ ジ ー の 現 状 と展 望 森 (2) 浩禎 奈良先端科学技術大学 院大学バイオサ イエンス研究科/ 慶 應義塾大学先端生命科 学研究所 (1)IPTG誘 開発リソースの性質からわかること 前 回 に 述 べ た よ う に, 導 に よ る生 育 へ の 影 響 100μM IPTG存 これ ま で に, 私 た ち はASKA もの が1,762ク Keio の が969ク (予 測 遺 伝 子 完 全 欠 失 株 ライ ブ ラ リー) 天 培 地 で の 生 育 を 目視 で 大 雑 把 に分 類 した と こ ろ, 生 育 に大 き な 阻 害 効 果 が 出 る library (予 測 遺 伝 子 ク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー) お よ び collection 在 下 のLB寒 ロ ー ン, 中 程 度 の 阻 害 効 果 が 見 られ る も ロ ー ン観 察 さ れ た. 一 方, を 構 築 した. GFP融 合 型 お よ び 非 融 合 型, そ して独 立 に い もの は683に 取 得 した 欠 失 株2株 ず つ, 合 計 で 約16,000株 育 を 調 べ る た め に, 一 晩培 養 液 を100倍 の研 究 リ と どまる (図9-A, B). ソ ー ス が 存 在 す る が, 生 育 な ど, 単 純 な 性 質 を 全 リ ソー の生 育 につ い て, 培 養 の 開 始 後2時 ス につ い て 解 析 す るだ け で も興 味 深 い 事 実 が浮 か び上 が る合 成 誘 導 後2時 る. イ ル を 図9-Cに 間 のOD600を ASKA ORFク library 影 響, (2)IPTGに 希 釈 し, 37 で 間 お よ びIPTGに IPTG誘 導 に よ る生 育 へ の よ る発 現 誘 導 時 のGFPの タ ンパ ク質 の 局 在 性 と生 育 阻害, (4)IPTG誘 タ ンパ ク質 の 電 気 泳 動 で の 発 現 量, 蛍 光 強 度, (3) 導 後 の 目的 の測 定 を 行 な っ た. ypfi, phel) よ 測 定 した. そ の プ ロ フ ァ 間 で の 増 殖 が2倍 以 下, あ る い は増 殖 が 見 られ な か っ た もの は5遺 伝 子 (yagj, ymfm, ロ ー ンラ イ ブ ラ リ ー に 関 して, (1)各 ク ロ ー ン を も つ 宿 主 の 生 育 と100μM さ らに詳 し く生 示 す. 培 養 開 始 後2時 1. ま っ た く影 響 が な 存 在 した. yagj と ymfmは yedx, フ ァー ジ 由来 の タ ンパ ク質 で あ る. さ ら に, OD600が ほ ぼ0.5に 達 した段 階 で100μM IPTGを 加 え, 2時 間 後 に再 びOD600を 測定 し, ク ロー ン化 遺 伝 子 産 物 の 増 産 の 細 胞 の生 育 へ の 影 響 を 調 べ た と こ ろ, 130の 遺 伝 子 に お い てIPTG添 加 後, これ らの解 析 は, す べ て ゲ ノ ム 配 列 お よ び ア ノ テ ー シ ョ 生 育 が 停 止 し, 1%以 ン情 報 の 改 定 前 の 段 階 で の 解 析 で あ り, 3,418遺 伝 子 に か っ た. 対 す る解 析 で あ る. な お, ゲ ノ ム配 列 の修 正 お よ び そ れ hokd, yedx, に 伴 う遺 伝 子 領 域 の 改 訂 に よ り修 正 が 必 要 とな っ た ク に ま で 下 が った. ロー ンは, す で に修 正 を 終 え て い る. 質 か ペ リプ ラ ズ ム に 存 在 す る と考 え られ る タ ンパ ク質 群 さ ら に, 上 のOD値 7遺 伝 子 の増 加 は観察 され な (aaea, ydfq, tory) に関 して は, IPTG添 これ らの7遺 yger, ypfj, 加 後 濁 度 が半 分 伝 子 はす べ て 膜 タ ンパ ク を コー ドして い る. 774 化 学 と 生 物 Vol. 44, No. 11, 2006

2 (2)GFP蛍 ロー ンにおい て は っき りと した蛍光 が 肉 眼で観 察 され 光 強度 ASKA library 開 発 時 にIPTG添 加 後 のGFPに 蛍 光 の 有 無 を 目 視 で 調 べ た. 全 体 で2,200を よる 超 えるク た. 生 育 へ の 影 響 とGFPに ま と め た. IPTG添 よ る蛍 光 の 有 無 を 図9-Aに 加 に よ る発 現 誘 導 に よ って 生 育 に大 き な 阻 害 的 影 響 を 与 え る 遺 伝 子 で は, GFP蛍 光 が観察 され な い場 合 が 非 常 に多 い こ と が わ か る. そ れ らの 中 で 1,371も の 遺 伝 子 が, そ の遺 伝 子 産 物 の増 産 に よ り強 い 生 育 阻 害 を 示 し, か つGFPの 蛍 光 を観 察 す る こ とが で きな い. 細 胞 質 外 タ ンパ ク質 を コ ー ドす る と考 え られ る ORFの う ち, GFPに よ る蛍 光 が観 察 さ れ る もの は157 存 在 す る. ペ リ プ ラ ズ ム や 外 膜 に存 在 す る と考 え られ る タ ンパ ク質 に お い て もGFPの ら, プ ロ セ ス され てGFPド 蛍 光 が 観 察 され る こ とか メ イ ン が 切 り離 さ れ て い る 可 能 性 を 考 え な けれ ば な ら な い と思 わ れ る. (3)タンパ ク質 局 在 性 と生 育 阻 害 現 在 の 大 腸 菌 ア ノ テ ー シ ョ ン情 報 で は, 1,485のORF が 細 胞 質 以 外 の タ ンパ ク質 を コー ドして い る と予 測 され て い る(10).図9-Cに は ゲ ノ ム配 列 修 正 前 の ク ロ ー ン に よ る解 析 結 果 を示 して い るの で, ORFの 数 が違 う が, 当 時 1,154と 考 え られ て い た 細 胞 質 以 外 の タ ンパ ク質 の う ち 91%を 超 え る タ ンパ ク質 の 増 産 に よ って 強 い生 育 阻 害 が み られ る. 膜 タ ンパ ク質 の増 産 に よ る生 育 阻害 の機 構 は不 明 で あ る. さ らに, ASKA library を 用 い て網 羅 的 な タ ンパ ク質 局 在 性 解 析 が 遺 伝 学 研 究 所 の仁 木 博 士 ら に よ り進 め られ た. 多 コ ピー プ ラ ス ミ ドか らタ ンパ ク質 合 成 誘 導 を か け た 場 合, 正 常 な タ ンパ ク質 構 造 を と らず に変 性 タ ンパ ク 質 を 蓄 積 す る場 合 が 多 い. 基 本 的 にIPTGに 図9 ASKA library に よ る 生 育 へ の 影 響 とGFP蛍 光 (A, B) 0.1mM IPTGを 含 むLB培 地 で の生 育 へ の影 響 を, 阻害 な し, 中程 度, 強 い 阻害 の3段 階 に 分 類 し, そ れ ぞれ に お け る 蛍 光 の 強 度 を (A) の グ ラ フ に, ま た 予 想 さ れ る膜 タ ンパ ク質 と細 胞質 タ ンパ ク質 の 分 類 を (B) の グ ラ フ に示 す. (C) GFP非 融 合 型ASKA library に 関 して, 一 昼 夜 培 養 した もの を100倍 希 釈 し, 37, LB培 地 で培 養 開始 後2時 間 で のOD600の 値 に 対 して, 37, LB培 地 でOD600が 約0.5に 到 達 した段 階 で0.1mM のIPTG添 加 後2時 間 の 到 達 濁 度 を プ ロ ッ トした. 図10 GFP融 IPTG非 合 型ASKAク 存 在 下 で, GFP蛍 よ る合 成 誘 導 を か け ず に, 上 流 領 域 か ら の 漏 れ 程 度 の発 現 でGFP を 顕 微 鏡 下 で 観 察 す る こ とで, 対 象 タ ンパ ク質 の 細 胞 内 局 在 性 解 析 が 進 め られ た. 結 果 の 一 部 を 図10に 示 す (写 真 は仁 木 博 士 の提 供). この 写 真 か らわ か る よ う に, 細 胞 質 全 体 に広 が る もの の 他 に, 極 に偏 って 存 在 す る も の, 明 瞭 な ス ポ ッ トを 形 成 す る もの, 細 胞 表 層 に強 い 蛍 光 が 観 察 さ れ る もの, そ して核 様 体 に局 在 す る もの に大 き く ロ ー ン に よ る タ ンパ ク質 の 細 胞 内 局 在 光 を 利 用 して, 目的 タ ンパ ク質 の 局 在 を 調 べ た もの. な お, 写 真 は 国立 遺 伝 学 研 究所, 仁木宏典博士 によ り撮 影 さ れ た もの の提 供 を受 け た. 化学 と生物 Vol. 44, No. 11,

3 分 類 す る こ とが で き る. た だ, こ こで も膜 タ ンパ ク質 に 質 や 膜 に結 合 して い る と考 え られ る タ ンパ ク質 な ど は通 関 して は, 多 くの 問 題 を 抱 え て お り, 表 層 面 に強 い 蛍 光 常 の 精 製 方 法 で は 回収 が 難 しい. ま た, プ ロ セ ス され て を観 察 で き る約500の い る と思 わ れ る も の も存 在 した. そ の 一 部 を図11に ク ロー ンの 中 で 膜 タ ンパ ク質 と予 測 さ れ て い る もの は3分 の1程 度 に と ど ま る. (4)IPTG誘 す. 導 後 の 目 的 タ ンパ ク質 の 電 気 泳 動 で の 発 現 量 示 全 ク ロ ー ンに よ る タ ンパ ク質 精 製 で は, 図 に は示 さな い が, 修 正 を必 要 とす る遺 伝 子 を 除 い て, 1,568の 遺 伝 子 次 回 で 詳 し く述 べ る が, タ ンパ ク質 相 互 作 用 解 析 の た め に, す べ て の ク ロー ンに つ い て, IPTG誘 パ ク質 をNi-NTAカ 導 後 のタ ン ラ ム で 精 製 し, そ の 発 現 を 調 べ た. 産 物 は His tag を 用 い たNi-NTA樹 脂 に よ る回 収 が で き な か った. 1,568遺 伝 子 の 中 で 細 胞 質 に 局 在 す る タ ン パ ク質 を コ ー ドす る と考 え られ て い る遺 伝 子 は640存 在 そ の結 果, 多 くの細 胞 質 タ ンパ ク質 に 関 して は, 良 好 に し, そ れ 以 外 の928遺 増 産 お よ び 精 製 す る こ と が で き た. しか し, 膜 タ ンパ ク 胞 質 以 外 に存 在 す る と考 え られ て い る. N末 端 な ど の修 伝 子 の コ ー ドす る タ ンパ ク質 は細 正 (開 始 コ ドンの修 正) が必 要 な 遺 伝 子 群 に お い て, そ の タ ンパ ク質 を 同 じ方 法 で 観 察 で き な か っ た もの は375 遺 伝 子 存 在 す る. 多 くの 場 合, N末 端 の 修 正 が必 要 な も の で あ る が, N末 端 の 予 測 の 間 違 い か ら, タ ンパ ク質 の 発現 が 見 られ な くな る もの も多 い よ うで あ る. す べ て を 確 認 した わ けで は な い が, 修 正 を 行 な う こ と で, タ ンパ ク質 の 発 現 を 観 察 で き る よ う にな っ た事 例 もあ る. プ ロ モ ー タ ー お よ び 翻 訳 シ グ ナル は ベ ク タ ー 由 来 で あ り, 本 来 の もの を利 用 して い るわ け で は な い が, 開 始 コ ドン は 重 要 で あ る こ とを 再 認 識 させ られ る結 果 で あ る. N末 端 の不 正 確 さ に よ る 翻 訳 産 物 の 量 の違 い は, 翻訳 産 物 の安 図11 GFPを ASKA Iibrary 除 いたASKA によ るタ ンパ ク質精 製 library を0.1mMのIPTGで 定 性 な ど を検 討 す る必 要 が あ る が, 本 当 の理 由 は不 明 で 誘 導 し, 細 胞 を 超 音 波 処 理 で 破 砕 後, Ni-NTAカ ラ ムで精 製 した ものを SDS-PAGEで 確 認 した. CodBな どは膜 タ ンパ ク質 で あ り, 可 溶 化 の 処 理 が必 要 で あ る た め に, 目的 産 物 の精 製 が で きて い な い な どの 問 題 は 存 在 す るが, 細 胞 質 タ ンパ ク質 に お い て は, ほ ぼ 問 題 な く, 簡 便 に精 製 が 可 能 で あ る. あ る. 2. Keio Keio collection collection は完 全 遺 伝 子 欠 失 を 目 的 と した デ ザ 組 換 え 候 補 株 は, 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 内 部 の プ ラ イ マ ー, 上 流 側 のORF, お よ び 下 流 側 のORF増 幅 に利用 し た 合 成DNAを 用 い て, genomic PCRを 行 な い, 予 想 通 りの ゲ ノ ム 構 造 を と って い るか ど う か を確 認 す る. 通 常8株 の 候 補 を取 得 し, そ れ ぞ れ につ い て 確 認 を 行 な う. 図12 欠 失 の 確 認 方 法 図10で 示 した 方 法 に よ り調 べ た, 予 想 通 りの構 造 を も った候 補 株 の頻 度 分 布. 図 欠 失 株 作 製 に お け る success rate 化 学 と生 物 Vol. 44, No. 11, 2006

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5 中 に は toxin と anti-toxin の 組 合 せ と考 え られ る タ ン な お, 今 回 は示 して い な い が, MOPS培 地 で の24時 パ ク質 の セ ッ トも存 在 し, anti-toxin と考 え られ る遺 伝 間 後 の 到 達 濁 度 も調 べ て お り, 一 部 の 欠 失 株 に お い て 子 が 必 須 遺 伝 子 と して 分 類 さ れ て い る場 合 が あ る. 大 腸 は, 48時 間 後 の濁 度 が 極 端 に 下 が る場 合 が 見 られ た. こ 菌 に は そ の よ うな遺 伝 子 セ ッ トが 現 在 releb, mazef れ は lysis が 起 こ って い る可 能 性 が 考 え られ る. な ど6組 予 想 され て い る. 必 須 遺 伝 子 と して 同定 され て い る もの の 中 で yefm, chpr や chps な ど も, 同様 の 可 能 新たな目的に応じた新規リソースの開発 性 が 考 え られ る(12). (2)欠 失 株 のLBお よ びMOPS培 地 で の生育 のプ ロ フ ァイ ル 扱 え る よ うに で き る こ と, (2)遺伝 学 的 に 遺 伝 子 産 物 の 発 す べ て の 遺 伝 子 欠 失 株 を37 に あ るLB培 地 で の22時 あ るMOPS+グ お い て, 栄 養 培 地 で 間 後 の 到 達 濁 度 と, 合 成 培 地 で ル コ ー ス培 地 に お け る48時 到 達 濁 度 を調 べ た MOPS培 私 た ち は これ ま で, (1)生化 学 的 に遺 伝 子 産 物 を 簡 便 に (図15). 間培養 後 の 大 半 の 欠 失 株 はLB培 地 とで 大 き な違 い は な く, 区画IVの か た ま る. LB培 地と ところに 地 で は増 殖 可 能 で あ るが, MOPS培 で は 増 殖 で き な い 一 群 の 欠 失 株 は グル ー プ3に 地 現 量 を 増 強 させ た り欠 損 さ せ る こ とを 目的 に, 全 予 測 遺 伝 子 の 遺 伝 子 ク ロ ー ン お よ び 欠 失 株 の作 製 を行 な った. 計 画 自身 は か な り古 く, 1997年 の ゲ ノ ム 配 列 決 定 終 了 時 以 前 よ り, ポ ス トゲ ノ ム研 究 の 方 向 と して 検 討 を進 め て い た. 実 際 に 開 発 に着 手 した の は1999年 で あ るが, 1990 年 代 に もた ら され た ゲ ノ ム研 究 関 連 の技 術 開 発 に よ り, ま とま っ 全 予 測 遺 伝 子 の ク ロー ン化 な ど, そ れ まで は到 底 思 い も て い る. これ ら は ア ミノ酸 や 核 酸 な ど を生 合 成 す る機 能 及 ば な か った 発 想 で 研 究 開 発 が 可 能 に な っ て き た 時 代 で を 失 った もの で あ る と考 え られ る が, そ の 中 で もア ミノ あ る. ま た, 全 体 を 見 る こ とで, さ らな る科 学 的 な 興 味 酸 合 成 に 関 与 す る と考 え られ る遺 伝 子 群 の 欠 失 株 は グ も膨 らみ, 新 た な 目 的 の た め の リ ソ ー ス 作 製 が 必 要 と ル ー プ3の 右 の ほ うに偏 る傾 向 が あ り, 核 酸 生 合 成 に関 な って き て い る. 実 際, こ れ ま で の ク ロー ンや 欠 失 株 に す る 欠 失 株 は左 の ほ うに偏 る傾 向 が み られ た. 興 味 深 い よ り創 出 され た デ ー タか ら さ らな る可 能 性 を 引 き 出 す た の は グ ル ー プ1に 存 在 す る欠 失 群 で, LB培 め の 新 た な リソ ー ス 作 製 が 必 要 と な って きて い る. 濁 度 が 低 い が, MOPS培 地 で は到達 地 で は高 くな る. 原 因 は不 明 で あ り, 今 後 の解 析 を待 た な け れ ば な らな い. 次 回 に詳 し く述 べ る予 定 で あ る が, 構 築 した プ ラ ス ミ ドク ロ ー ンを 用 い て, pull-down 法 に よ る網 羅 的 な タ ン パ ク質 相 互 作 用 解 析 が 行 な わ れ て い る(12).全 予 測 遺 伝 子 の ク ロ ー ンを 構 築 す る こ とで 可 能 と な った 解 析 で は あ る が, pull-down 法 と い う方 法 で bait タ ンパ ク質 を 精 製 す るた め, 可 溶 化 が必 要 な 膜 タ ンパ ク質 に関 して は そ の ほ とん ど を解 析 す る こ とが で き て い な い. 膜 タ ンパ ク質 に 関 して は, 別 の 方 法 を 検 討 す る必 要 が あ り, そ の た め の リ ソ ー ス 開 発 を 検 討 して い る. これ ま で, 私 た ち は 全 予 測 遺 伝 子 の単 一 遺 伝 子 欠 失 株 を作 製 した が, 遺 伝 的 ネ ッ トワー ク解 明 の た め, 新 た に 単 一 遺 伝 子 欠 失 の 組 合 せ に よ る合 成 致 死 遺 伝 子 の組 合 せ 同定 を 行 な う予 定 で あ る. そ の た め に は, これ ま で の 欠 失 株 が もつ 薬 剤 耐 性 形 質 を 他 の薬 剤 耐 性 形 質 に変 え る必 要 が あ る. 現 在, そ れ を 目的 の 中心 と して, さ らに用 途 を 拡 張 で き る よ う な遺 伝 子 欠 失 株 の 作 製 を 開 始 した と こ 図15 欠 失 株 のLB培 地22時 間 後 とMOPS+グ 地 で の48時 間 後 の 到 達 濁 度 の プ ロ フ ァイ ル 全 欠 失 株 をLB培 地 で37, ル コー ス 培 22時 間 培 養 後 の 到 達 濁 度 (OD600) とMOPS+グ ル コー ス培 地 で37, 48時 間後 の到 達 濁 度 の プ ロ フ ァ イ ル. グ ル ー プ1はLB培 地 で は 到 達 濁 度 が 低 い が, MOPS培 地 に お い て は高 くな る. グル ー プ3に お い て は, その 逆.大 半 は遺 伝 子 欠 失 に よ る到 達 濁 度 の影 響 を 受 け ず に, 区 画 IVに 分 布 す る. 778 ろ で あ る. 主 な 目的 は, (1)合成 致 死 遺 伝 子 群 同 定, (2)単 一 細 胞 にお け る遺 伝 子 発 現, (3)簡 便 な 欠 失 同 定 の た め の 分 子 マ ー カ ー の 導 入 (バ ー コー ド) で あ る. この 欠 失 株 を 利 用 す れ ば, 単 一 細 胞 に お い て 目的 の 遺 伝 子 発 現 を観 察 で き る. す べ て の 遺 伝 子 の 発 現 を 生 き た単 一 細 胞 で モ ニ タ ー で き る よ う にな る 日 もそ う遠 くは な い. 化 学 と生 物 Vol. 44, No. 11, 2006

6 Blattner, R.R. Chaudhuri, J.D. Glasner, T. Horiuchi, I. M. Keseler, T. Kosuge, H. Mori, N.T. Perna, G. Plunkett, 3rd, K.E. Rudd, M.H. Serres, G.H. Thomas, N.R. Thomson, D. Wishart & B.L. Wanner: Nucleic Acids Res., 34, 1 (2006). 11) T. Baba, T. Ara, M. Hasegawa, Y. Takai, Y. Okumura, M. Baba, K.A. Datsenko, M. Tomita, B.L. Wanner & H. Mori: Mol. Syst. Biol., 2, (2006). 12) M. Arifuzzaman, M. Maeda, A, Itoh, K. Nishikata, C. Takita, R. Saito, T. Ara, K. Nakahigashi, H.C. Huang, A. Hirai, K. Tsuzuki, S. Nakamura, M. Altaf-Ul-Amin, T. Oshima, T. Baba, N. Yamamoto, T. Kawamura, T. Ioka- Nakamichi, M. Kitagawa, M. Tomita, S. Kanaya, C. Wada & H. Mori: Genome Res., 16, 686 (2006). 10) M. Riley, T. Abe, M.B. Arnaud, M.K. Berlyn, F.R.

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