研究成果報告書

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1 様 式 C-19 科 学 研 究 費 補 助 金 研 究 成 果 報 告 書 平 成 21 年 6 月 4 日 現 在 研 究 種 目 : 基 盤 研 究 (C) 研 究 期 間 :2007~2008 課 題 番 号 : 研 究 課 題 名 ( 和 文 ) マイコプラズマ 肺 炎 におけるリンパ 球 関 連 宿 主 免 疫 応 答 の 解 析 研 究 課 題 名 ( 英 文 ) Analysis of host-defense mechanism in association to lymphocytes in Mycoplasma pneumoniae pneumonia 研 究 代 表 者 後 藤 元 (GOTO HAJIME) 杏 林 大 学 医 学 部 教 授 研 究 者 番 号 : 研 究 成 果 の 概 要 : これまでの 医 学 臨 床 の 現 場 での 観 察 から マイコプラズマ 肺 炎 は 患 者 の 免 疫 反 応 が 過 剰 に 起 こっているのではないか また マクロライド 系 抗 菌 薬 は 抗 菌 薬 としてで はなく その 過 剰 な 免 疫 反 応 を 抑 制 しているのではないか と 予 想 された そこで マイコプラズマ 肺 炎 マウスモデルを 3 種 類 作 成 し 解 析 した 結 果 重 症 のマイコプラズ マ 肺 炎 では 免 疫 反 応 が 関 与 していること さらに クラリスロマイシンには 免 疫 調 整 作 用 があることが 判 った 交 付 額 ( 金 額 単 位 : 円 ) 直 接 経 費 間 接 経 費 合 計 19 1,400, ,000 1,820, , , ,000 総 計 1,900, ,000 2,470,000 研 究 分 野 : 医 歯 薬 学 科 研 費 の 分 科 細 目 : 内 科 系 臨 床 医 学 キーワード: 感 染 症 シグナル 伝 達 微 生 物 内 科 網 羅 的 解 析 1. 研 究 開 始 当 初 の 背 景 マイコプラズマ 肺 炎 は 市 中 肺 炎 の 病 原 微 生 物 の 一 つ 肺 炎 マイコプラズマ Mycoplasma pneumoniae による 呼 吸 器 感 染 症 である 肺 炎 マイコプラズマの 感 染 症 は 一 般 には 自 然 経 過 で 治 癒 するが 一 部 の 患 者 で 重 篤 化 するこ とが 知 られている 近 年 肺 炎 マイコプラズ マが 喘 息 の 原 因 となる 可 能 性 が 指 摘 されて いる さらに 最 近 では ステロイドが 有 効 な 治 療 であることが 報 告 され 始 めている 以 上 より マイコプラズマ 肺 炎 は 一 般 の 細 菌 性 肺 炎 とは 異 なり 肺 炎 マイコプラズマによる 肺 炎 は 実 は 宿 主 免 疫 防 御 Host defense による 免 疫 の 異 常 ではないかと 考 えられる

2 さて マイコプラズマ 肺 炎 はマクロライドが 抗 菌 薬 の 選 択 肢 に 選 ばれる マクロライド 投 与 により 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 のリンパ 球 の CD4/CD8 比 が 変 化 したり 少 量 マクロライド 長 期 投 与 することによりびまん 性 汎 細 気 管 支 炎 diffuse panbronchiitis (DPB)が 改 善 す ることが 知 られており マクロライドにも 抗 菌 薬 以 外 の 作 用 として 免 疫 調 整 作 用 immunomodulatory effect の 存 在 が 想 定 され ている このように 考 えると 我 々が マイ コプラズマ 肺 炎 をマクロライド 系 抗 菌 薬 を 用 いて 治 療 してきた と 信 じてきたことは 実 は マイコプラズマが 惹 起 したホスト デ ィフェンスの 免 疫 異 常 をマクロライド 系 抗 菌 薬 の 免 疫 調 整 作 用 で 整 えた と 考 えられ た さらに マクロライド 耐 性 マイコプラ ズマによる 感 染 症 がマクロライドで 治 療 可 能 であることも 報 告 も 理 解 できる そこで 1マイコプラズマ 肺 炎 は 生 菌 でなくても 菌 体 成 分 のみで 発 症 する 2 上 記 の 炎 症 は マクロライド 系 抗 菌 薬 の 免 疫 調 整 作 用 で 治 療 可 能 である と 仮 説 がたてた 2. 研 究 の 目 的 上 記 の 仮 説 マイコプラズマ 肺 炎 は 生 菌 で なくても 菌 体 成 分 のみで 発 症 し マクロライ ド 系 抗 菌 薬 の 免 疫 調 整 作 用 で 治 療 可 能 であ る を 証 明 するため 菌 体 成 分 のみによるマ イコプラズマ 肺 炎 モデルをマウスを 用 いて 作 成 し 解 析 することを 目 的 とした 3. 研 究 の 方 法 マイコプラズマ 肺 炎 モデル C S K の 3 種 類 のモデルマウスを 用 いて 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 の 炎 症 細 胞 の 数 およびサイトカイン 濃 度 を 検 討 した 方 法 (1)マイコプラズマ 抽 出 液 マイコプラズマ 菌 体 は 培 養 増 殖 させたマ イコプラズマを 超 音 波 破 砕 し 遠 心 して 得 ら れた 上 清 を マイコプラズマ 抽 出 液 として 使 用 した (2)マウス マウスは BALB/c マウス( )を 用 いた マウスは SPF の 状 態 で 飼 育 し 杏 林 大 学 の 規 定 に 従 い 倫 理 的 かつ 動 物 愛 護 の 観 点 から 取 り 扱 われた 1)マウスモデルの 作 成 マウスモデル C 上 記 で 作 成 したマイコ プラズマ 抽 出 液 を 気 管 内 投 与 した マウス K マイコプラズマ 抽 出 液 をマウ ス 腹 腔 内 に 前 投 与 し その 後 さらにマイコプ ラズマ 抽 出 液 を 気 管 投 与 した マウスモデル S マイコプラズマ 抽 出 液 をアジュバントとともに 2 回 マウス 腹 腔 内 に 前 投 与 する その 後 気 管 よりマイコプラズ マ 抽 出 液 を 投 与 した 2)マウスの 解 析 マイコプラズマ 抽 出 液 を 気 管 投 与 を 施 行 した 日 より 第 1,2,4,7 日 に 採 材 解 析 し た また 薬 剤 投 与 を 行 う 場 合 は 気 管 投 与 した 日 から 採 材 まで 毎 日 薬 剤 を 経 口 投 与 す る 薬 剤 は クラリスロマイシンを 投 与 し 検 討 した また 比 較 の 為 デキサメサゾンも 投 与 し 検 討 した 採 材 と 解 析 は 気 管 支 肺 胞 洗 浄 を 行 い 洗 浄 液 中 の 炎 症 細 胞 の 数 的 評 価 を 施 行 し さら にサイトカインの 測 定 を 施 行 した また 肺 の 組 織 学 的 評 価 を 免 疫 染 色 も 含 めて 施 行 し た 3) 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 の 解 析

3 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 の 細 胞 は 総 数 と 細 胞 分 画 を 検 討 し さらにリンパ 球 については 表 面 マーカーをフローサイトメトリを 用 いて 解 析 した 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 中 のサイトカインは 主 と し て Enzyme-linked immunosorbent assay(elisa) 法 にて 測 定 した さらに 網 羅 的 な 測 定 も 行 った 肺 の 組 織 学 的 検 討 は パラフィン 切 片 ( 厚 さ=3μm)を 作 成 し 抗 サイトカイン 抗 体 で 染 色 した 4. 研 究 成 果 (1)マイコプラズマ 肺 炎 マウスモデルの 作 成 1.マウスモデル C 菌 体 成 分 を 単 回 投 与 したところ 大 きな 炎 症 反 応 は 得 られなかった 2.マウスモデル K 大 腸 菌 のリポ 多 糖 類 lipopolysaccharide とはことなり 肺 炎 マイコプラズマには 炎 症 を 惹 起 する 物 質 はあまり 含 まれない 為 マイ コプラズマの 持 続 感 染 と 似 た 病 体 を 作 成 す る 為 マイコプラズマ 抽 出 液 の 3 回 投 与 を 行 ったところ 炎 症 反 応 は 大 きくなり リンパ 球 の 集 簇 も 認 められた 3.マウスモデル S さらに 免 疫 学 的 なメカニズムも 検 討 する ため アジュバントを 併 用 した その 結 果 形 質 細 胞 とリンパ 球 の 浸 潤 を 認 め 重 症 のヒ トマイコプラズマ 肺 炎 の 肺 組 織 と 非 常 に 類 似 した 組 織 所 見 となった 表 1. 各 マイコプラズマ 肺 炎 モデルの 比 較 モデル 名 称 C K S 投 与 回 数 単 回 3 回 3 回 アジュバント なし なし あり 好 中 球 & マ クロファージ リンパ 球 形 質 細 胞 さらに モデル S のリンパ 球 について 検 討 を 行 ったところ CD4/8 比 が 著 明 に 低 下 し CD8 優 位 であることがわかった( 図 1) 図 1.モデル S のリンパ 球 の 解 析 興 味 深 いことに 本 マウスにマクロライド 系 抗 菌 薬 であるクラリスロマイシンを 投 与 するとリンパ 球 の 数 の 減 少 のみならず 以 下 の 通 り CD4/8 比 が 増 加 した( 図 2) 以 上 3 種 類 のマウスモデルを 比 較 すると 表 1の 通 りとなる 図 2.マウス S にクラリスロマイシン 投 与 し 多 彩 のリンパ 球 の 解 析

4 このようにクラリスロマイシン 投 与 によ り CD4/8 比 が 改 善 した このことから クラ リスロマイシンが 免 疫 調 整 作 用 を 有 するこ とが 判 った 以 上 の 研 究 より 以 下 の 結 果 が 得 られた (1) 肺 炎 マイコプサズマの 菌 体 成 分 により 肺 炎 モデルを 作 成 することが 出 来 た 投 与 法 によりモデル C モデル S モデル K と 名 付 けた その 概 要 は 下 表 の 通 りである (2)その 肺 炎 モデルには リンパ 球 が 関 与 していることが 示 された (3)リンパ 球 は CD4 優 位 であるが クラリ スロマイシン 投 与 により CD4/CD8 比 を 変 化 さ せることが 可 能 である そして マイコプラズマ 肺 炎 の 菌 体 成 分 が 惹 起 した 過 剰 な 宿 主 免 疫 反 応 をマク ロライド 系 抗 菌 薬 の 免 疫 調 整 作 用 で 抑 制 しているという 臨 床 現 場 から 得 られ た 仮 説 がマウスモデルのレベルでは 正 しいことが 証 明 された 5. 主 な 発 表 論 文 等 ( 研 究 代 表 者 研 究 分 担 者 及 び 連 携 研 究 者 に は 下 線 ) 雑 誌 論 文 ( 計 5 件 ) 平 成 Sekine H, Taguchi H, Watanabe H, Kawai S, Fujioka Y, Goto H, Kobayashi H and Kamiya S Immunological analysis and pathological examination of gnotobiotic mice monoassociated with Mycoplasma pneumoniae J Med Microbiol 2009; 58: 査 読 有 2. 皿 谷 健 倉 井 大 輔 平 尾 晋 加 藤 愛 香 和 田 裕 雄 石 井 晴 之 飯 原 久 仁 子 藤 岡 保 範 蔵 田 訓 田 口 晴 彦 神 谷 茂 岡 輝 明 明 石 敏 中 垣 和 英 中 田 光 後 藤 元 マイコプラズマ 肺 炎 マウスモデルに 対 する Clarithromycin の 免 疫 調 節 作 用 の 検 討 Jpn J Antibios 2008; 61 (Supple A): 査 読 有 3. 倉 井 大 輔 皿 谷 健 和 田 裕 雄 平 尾 晋 明 石 敏 神 谷 茂 後 藤 元 マイコプラズマ 肺 炎 マウスモデルにおける IL-17 の 関 与 の 検 討 日 本 感 染 症 学 雑 誌 2008; 82: 査 読 有 4. 皿 谷 健 後 藤 元 マイコプラズマ 肺 炎 日 本 臨 床 2008; 別 冊 呼 吸 器 症 候 群 I: 査 読 無 平 成 倉 井 大 輔 和 田 裕 雄 皿 谷 健 石 井 晴 之 田 口 晴 彦 神 谷 茂 明 石 敏 後 藤 元 細 菌 感 染 の 病 原 因 子 マイコプラズマ 可 溶 性 抗 原 を 用 いた 肺 炎 モデルの 検 討 感 染 症 学 雑 誌 2007; 81: 査 読 有 学 会 発 表 ( 計 6 件 ) 平 成 倉 井 大 輔 皿 谷 健 和 田 裕 雄 平 尾 晋 明 石 敏 神 谷 茂 後 藤 元 マイコプラズマ 肺 炎 マウスモデルにおける IL-17 の 関 与 の 検 討 第 83 回 日 本 感 染 症 学 会 総 会 ( 東 京 平 成 21 年 4 月 24 日 ) 2. Hirao S, Saraya T, Kurai D, Wada H, Ishii H, Kurata S, Taguchi H, Kamiya S, Akashi T, Nakagaki K, Nakata K and Goto H Comparison of immune-modulating effects

5 among clarithromycin, dexamethasone, and levofloxacin on the murine model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia. (Abstract presented in ERS 2008 in Berlin, Germany, 14 Oct 2008) 3. 平 尾 晋 和 田 裕 雄 皿 谷 健 三 倉 真 一 郎 倉 井 大 輔 石 井 晴 之 中 垣 和 英 明 石 敏 後 藤 元 マイコプラズマ 菌 体 抽 出 物 による 炎 症 反 応 に 対 するクラリスロマイシンの 効 果 に ついて 第 83 回 日 本 感 染 症 学 会 ( 東 京 2009 年 4 月 23 日 ) 平 成 倉 井 大 輔 和 田 裕 雄 皿 谷 健 石 井 晴 之 田 口 晴 彦 神 谷 茂 明 石 敏 後 藤 元 細 菌 感 染 の 病 原 因 子 マイコプラズマ 可 溶 性 抗 原 を 用 いた 肺 炎 モデルの 検 討 第 82 回 日 本 感 染 症 学 会 総 会 ( 松 江 市 2007 年 4 月 17 日 ) 5. Kurai D, Saraya H, Wada H, Ishii H, Goto H, Iihara K, Fujioka Y, Taguchi S, Kmiya S, Oka T, Nakagaki K, Nakata K and Akashi T Involvement of lymphocytes in Mycoplasma pneumoniae pneumonia is associated with elevation in KC, IL-6 and TNF-alpha levels in bronchoalveolar lavage fluid. Eur Respir J 2007; 30: 722s (Presented in ERS 2007 in Stockholm, Sweden, 19 September 2007) 2007; 176: A876 (Presented in ATS 2007 in San Francisco, 22 May 2007) 図 書 ( 計 0 件 ) 産 業 財 産 権 出 願 状 況 ( 計 0 件 ) 取 得 状 況 ( 計 0 件 ) その 他 特 記 事 項 なし 6. 研 究 組 織 (1) 研 究 代 表 者 後 藤 元 (Goto Hajime) 杏 林 大 学 医 学 部 教 授 研 究 者 番 号 : (2) 研 究 分 担 者 ( 平 成 19 ) 和 田 裕 雄 (WADA HIROO) 杏 林 大 学 医 学 部 助 教 研 究 者 番 号 : 飯 原 久 仁 子 (IIHARA KUNIKO) 杏 林 大 学 医 学 部 准 教 授 研 究 者 番 号 : 中 垣 和 英 (NAKAGAKI KAZUHIDE) 日 本 獣 医 生 命 科 学 大 学 獣 医 学 部 准 教 授 研 究 者 番 号 : (3) 連 携 研 究 者 ( 平 成 20 ) 和 田 裕 雄 (WADA HIROO) 杏 林 大 学 医 学 部 助 教 研 究 者 番 号 : Saraya T, Wada H, Kurai D, Ishii H, Aoshima M, Horie S, Oka T, Iihara K, Fujioka Y, Kurata S, Taguchi H, Kamiya S, Nakata K, Nakagaki K, Akashi T and Goto H Involvement of lymophcytes in the murine model of Mycoplasma pneumoniae pneumonia Am J Respir Crit Care Med

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