標準化とは? JIS Z 8002:2006 ( 標準化及び関連活動 - 一般的な用語 ) 実在の問題又は起こる可能性がある問題に関して 与えられた状況において最適な秩序を得ることを目的として 共通に かつ 繰り返して使用するための記述事項を確立する活動 注記 1 この活動は 特に規格を作成し 発行

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1 sysmex 第 5 回 Food Forum 微生物試験法の 標準化とは 2014 年 11 月 13 日品川プリンスホテル 公益財団法人認定センター 日本適合性認定協会 食品試験プログラムマネジャー 森曜子 1

2 標準化とは? JIS Z 8002:2006 ( 標準化及び関連活動 - 一般的な用語 ) 実在の問題又は起こる可能性がある問題に関して 与えられた状況において最適な秩序を得ることを目的として 共通に かつ 繰り返して使用するための記述事項を確立する活動 注記 1 この活動は 特に規格を作成し 発行し 実施する過程からなる 注記 2 標準化がもたらす重要な利益は 製品 プロセス及びサービスが意図した目的に適するよう改善されること 貿易上の障害が取り払われること 及び技術協力が促進されることである 2

3 標準化とは? 人が集団で生活するために必要なもの 自然発生的に標準化の概念が芽生えた 村の掟 物を比較する 作るための物差し 3

4 現代における標準化とは? グローバル社会における取り決めの策定 国際規格 規格への適合性評価の方法 4

5 世界貿易機関 (World Trade Organization) 1995 年 1 月 1 日設立 基本方針 自由な通商 無差別 多角的通商体制 5

6 WTO 協定附属書 1A 物品の貿易に関する多角的協定 (13) TBT 協定 ( 貿易の技術的障害に関する協定 ) SPS 協定 ( 衛生及び植物検疫に係る措置に関する協定 ) 国際規格を基にした国内規格の策定の原則 規格作成の透明性の確保 科学的根拠 リスク評価 適合性評価 ( 科学的根拠 ) ISO( 国際標準化機構 ) 6

7 SPS 協定とは? WTO 協定の 1 つ食品安全 動植物の健康に関するすべてを対象 食品の安全 Codex 委員会が制定した基準 勧告 ガイドライン 動物の健康 人畜共通伝染病 国際獣疫事務局 (OIE) による基準 勧告 ガイドライン 植物の健康 国際植物防疫条約事務局 (IPPC) の下で作成された基準 勧告 ガイドライン 7

8 Codex 委員会 Codex Alimentarius Commission (CAC) 国際連合食糧農業機関 (FAO) と世界保健機関 (WHO) が 1963 年に設立 食品の国際規格 基準 (Codex 規格 ) を策定 A) 食品の安全に関する基準消費者の健康を保護することを目的とする B) 食品の品質に関する規格公正な貿易を促進することを目的とする 8

9 Codex 委員会 Codex Alimentarius Commission (CAC) 一般問題部会 (10 部会 ) 一般原則 食品衛生 分析 サンプリングなど 個別食品部会 (12 部会 ) 生鮮果実 野菜 魚類 水産製品 乳 乳製品など 特別部会 ( 現在設置なし ) 地域調整部会 (6 部会 ) 9

10 Codex 委員会 Codex Alimentarius Commission (CAC) 一般問題部会 (10 部会 ) での主要議題 食品衛生部会 (CCFH) CAC/GL21 食品中の微生物基準の設定と運用に関する原則 分析 サンプリング部会 (CCMAS) 国際食品貿易におけるサンプリング及び検査の原則 コーデックス規格における分析法 サンプリングプラン 10

11 Codex 規格 ( 食品の安全に関する基準 ) の例 -1 CAC/GL Annex Ⅱ Microbiological Criteria for Listeria of monocytogenes in Ready-to-Eat Food 微生物 n c m Class Plan Listeria monocytogenes cfu/g 2 n: 1 ロットからランダムに取り出される検体の個数 m: 基準値 c: ロットを合格と判定するのに許される不良検体の個数 : サンプリングプランを表す Class 2: n m c の組み合わせで決まるサンプリングプラン 11

12 Codex 規格 ( 食品の安全に関する基準 ) の例 -2 CAC/RCP Annex Ⅰ Microbiological Criteria for Powdered Infant Formula, Formula for Special Medical Purposes and Human Milk Fortifiers 病原微生物 n c m M Class Plan Enterobacter sakazakii (Cronobacter species) /10 g N/A 2 Salmonella /25 g N/A 2 衛生指標菌 ( 工程の衛生管理 ) n c m M Class Plan Mesophilic Aerobic Bacteria / g 5000/g 3 Enterobacteriaceae /10 g N/A 2 12

13 Codex 規格 ( 食品の安全に関する基準 ) の例 -2 CAC/RCP Annex Ⅰ 衛生指標菌 ( 工程の衛生管理 ) n c m M Class Plan Mesophilic Aerobic Bacteria / g 5000/g 3 Enterobacteriaceae /10 g N/A 2 n: 1 ロットからランダムに取り出される検体の個数 m: 基準値 c: ロットを合格と判定するのに許される不良検体の個数 M: 許容できない基準 Class 3:n m c M で定義されるサンプリングプラン 1. 許容できない品質 :1 検体でも M を超えた場合 2. 優良な品質 : 全ての検体が m を超えない場合 3. 辛うじて許容できるレベル :m を超えるが M は超えない検体数が c 以下 13

14 Codex 規格 ( 食品の安全に関する基準 ) の例 -1 CAC/GL Annex Ⅱ Microbiological Criteria for Listeria of monocytogenes in Ready-to-Eat Food 微生物 n c m Class Plan Listeria monocytogenes cfu/g 2 試験法 : ISO ISO により同等であると確認された方法 This criterion is based on the use of the ISO method. Other methods that provide equivalent sensitivity, reproducibility, and reliability can be employed if they have been appropriately validated (e.g., based on ISO 16140). 14

15 Codex 規格 ( 食品の安全に関する基準 ) の例 -2 CAC/RCP Annex Ⅰ Microbiological Criteria for Powdered Infant Formula, Formula for Special Medical Purposes and Human Milk Fortifiers 微生物 n c m Class Plan Enterobacter sakazakii (Cronobacter species) /10 g 2 Salmonella /25 g 2 試験法 :E.sakazakii ISO/TS 22964:2006 サルモネラ ISO 6579 同等であることの妥当性が確認された試験法 The methods to be employed for E. sakazakii(cronobacter species) and Salmonella should be the most recent editions of ISO/TS 22964:2006 and ISO 6579, respectively, or other validated methods that provide equivalent sensitivity, reproducibility, reliability, etc. 15

16 ISO : 2003 とは? Microbiology of food and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods 食品及び飼料の微生物学 - 代替法の妥当性確認に関するプロトコール ISO に基づいて妥当性確認された方法は 公定法として規制に用いることができる 国際的に容認される 16

17 妥当性確認とは? ISO/IEC 方法の妥当性確認 妥当性確認とは, 意図する特定の用途に対して個々の要求事項が満たされていることを調査によって確認し, 客観的な証拠を用意することである 試験方法が試験の目的に適っているか実証データに基づき確認し 評価すること Fit for purpose 17

18 ISO に基づく妥当性確認の方法 能力のある試験所が行う 参照法と代替法の比較 それぞれの試験法について複数の試験所での試験所間比較 ( 共同実験 ) 個々の試験所が所内で行う妥当性確認を目的としていない 18

19 わが国の微生物基準及び試験法の課題 国際的な食品の微生物学的基準がある場合 国際規格を採用する 試験方法は ISO 法 国際規格を基にした国内規格の策定の原則に基づく 採用せず 独自の試験法を策定する 同等の感度 再現性 信頼性などの妥当性確認が必要 規格の透明性の確保 科学的根拠 リスク評価 19

20 わが国の微生物基準及び試験法の課題 ISO 法に準拠するか 同等であることが国際的に認められる試験法の整備が急務 食品からの微生物標準試験法検討委員会の設立 規格作成の透明性の確保 科学的根拠 リスク評価 20

21 食品からの微生物標準試験法検討委員会 21

22 食品からの微生物標準試験法検討委員会 細菌標準試験法策定にあたっての議論のポイント 1. 最も基準となる標準的な細菌試験方法は 培養法である 2. 試験法作成に当たっては原案作成段階から公開とし その妥当性を多くの専門家や技術者に意見を求める 3. 試験法ができあがる段階で その実行性について複数の試験室で評価を受ける 4. よりよい試験法として 必要であれば 常に見直しを行い 2~3 の手順に従い修正が加えられる 5. 国際的に認められている試験法との互換性や 同等性を尊重する 6. その他 基本的に ISO 法を導入する 22

23 期待される効果 食品の細菌試験法が その作成段階から公開されることにより より多くの人から意見を求めることができ より良い試験法策定が期待できる 最終試験法は 多くの試験室の評価を受け 実行性が担保された方法となる プロトコールに従って試験を行えば 適切な精度での細菌試験が期待されると共に 試験技術の精度に関する評価を行うことが可能である 規格化された 標準法 は 他の試験法の尺度として使えるようになり 今後開発される食品のリスクマネージメントに適した迅速法や簡便法などの評価を 標準法を尺度として行うことができる 標準法と同等以上の精度や感度であると確認された迅速法は それに準ずる方法と考えることができ それぞれの目的に適した試験法が広く利用できる道を開くことになる より簡便でコストの安い優れた迅速試験法を開発するメリットが見えることにより さらに優れた食品からの微生物試験法の開発を活性化する 23

24 作成方針 ステージ 1( 原案 ) 作業部会の立ち上げ 作業部会が文献調査 情報収集により 原案のたたき台 作成 ステージ 2( 作業部会案 ) 作業部会が実験データに基づき 作業部会案 を作成 インターネット上で公開 ステージ 3( コラボ実施案 ) 親委員会で検討し コラボスタディー実施案をまとめる インターネット上で公開し コラボスタディー参加者募集 最終ステージ ( 標準法 ) コラボスタディー結果とパブコメ結果から実行性を評価 NIHSJ( 標準試験 ) 法として公開 24

25 微生物標準試験法検討委員会の仕組み 微生物標準試験法検討委員会 衛生指標菌作業部会 バリデーション作業部会 作業部会 ( 検討試験法 ) リステリア試験法 作業部会 ( 検討試験法 ) カンピロバクター試験法 作業部会 ( 検討試験法 ) 試験法 25

26 衛生指標菌作業部会 ISO 規格の仮訳 ColiformsMPN: ISO 4831 Coliforms 集落計数 : ISO 4832 腸内細菌科 (Enterobacteriaceae)MPN: ISO 腸内細菌科 (Enterobacteriaceae) 集落計数 : ISO 推定 E.coli. MPN: ISO

27 衛生指標菌試験法の ISO 法導入における検討課題 和訳作業 対訳版? JIS 化? NIHSJ( ) 従来法との定義の違い ( 混乱が予想される ) ISO 法では 微生物試験に関する一般要求事項 :ISO 7218 試料の調製 :ISO 6887 培地の調製 :ISO/TS 等の規格が試験方法とは別に規定されている 技術的事項 使用培地の入手について 培養温度 37 現行の公定法では 35 日本固有 / 多く消費されている食材のマトリックス 夾雑菌の影響 27

28 バリデーション作業部会の検討事項 ISO 法の導入 導入時検証 日本固有の食材への適用 サルモネラ試験法の共同実験を実施 ISO 6579 と NIHSJ-01( 国立衛研法 ) との比較試験 代替試験法 ( 迅速 簡便試験法 ) 導入時の検証法 ISO どのように適用するか? 第三者認証を受けた試験法 として HP に公開 食品の微生物試験結果の質の保証 試験室が実施する試験法導入時の検証 食材 ( マトリックス ) 夾雑菌の影響評価 内部精度管理のガイドライン 28

29 定評のある第三者認証機関 ( 妥当性確認実施機関 ) AOAC International Official Methods Program OMA プログラム ISO 16140との調和 AFNOR ( フランス規格協会 ) NordVal ( デンマーク フィンランド アイスランド ノルウェー スェーデン北欧 5カ国政府間組織 ) MicroVal (EU 認証機関 ; オランダ ) 29

30 微生物試験の目的 試験法に求められるニーズ 試験実施者 食中毒原因微生物の特定 定性能選択性 特異性 高度な知識を有する専門家 食品の安全性確認 ( リスク評価 ) 規格基準への適否の判断 迅速バラツキが小さい 適切な教育 訓練を受けた試験員 30

31 食品の微生物試験の目的 サーベイランス 問題の程度を調査迅速性 モニタリング 傾向を監視 ( 繰り返し ) バラツキが少ない 合否の判断 規格 基準に合致しているか精確さ 迅速高精度な試験法 ISO に基づく妥当性確認 公定法 ( 規格基準に定める方法 ) 標準法及び / 又は同等 (ISO 16140での妥当性確認 ) の方法 31

32 食品の輸出入に係る試験所の要件 CODEX CAC/GL27(1997) Guidelines for the Assessment of the Competence of Testing Laboratories Involved in the Import and the Export of Food ISO/IEC に適合している 適切な技能試験に参加している 妥当性確認された方法を用いる 内部品質管理を実施している 32

33 ISO/IEC : 2005 (JIS Q : 2005) 試験所及び校正機関の能力に関する一般要求事項 General requirements for the competence of testing and calibration laboratories 33

34 ISO/IEC 17025(JIS Q 17025) 序文 この規格は 試験所及び校正機関がマネジメントシステムを運営し 技術的に適格であり かつ 技術的に妥当な結果を出す能力があることを実証しようと望む場合 それらの試験所及び校正機関が満たさなければならないすべての要求事項を含んでいる 34

35 ISO/IEC 17025(JIS Q 17025) 序文 箇条 4: 健全なマネジメントに関する要求事項を規定 健全なマネジメント? Sound Management 35

36 ISO/IEC 17025(JIS Q 17025) 序文 箇条 5: 試験所 校正機関が請け負う試験 校 正の種類に応じた技術能力に関する要求事 項を規定 Fit for Purpose 36

37 試験所の能力とは 健全なマネジメントシステムを運営し 組織 マネジメントシステム 文書管理 依頼 見積仕様書及び契約の内容の確認 試験の下請負契約 サービス及び供給品の購買 顧客へのサービス 苦情 不適合の試験業務の管理 改善 是正処置 予防処置 記録の管理 内部監査 マネジメントレビュー 37

38 試験所の能力とは 技術的に適格であり 技術的に妥当な結果を出す能力を有している 要員 ( 教育 訓練 ) 施設及び環境条件 試験の方法及び方法の妥当確認 設備 ( 保守 点検 ) 測定のトレーサビリティ サンプリング 試験品目の取扱い 試験結果の品質の保証 結果の報告 38

39 試験所の能力 マネジメントシステムを構築 運営している 技術的に適格である 技術的に妥当な結果を出すことができる 実証できますか? 39

40 ISO/IEC 試験の方法及び方法の妥当性確認 方法の選定 試験所は 規格に規定された方法を試験に導入する前に 自身がその方法を適切に実施できることを確認する これが重要!! 検証 ( Verification ) 40

41 適切な手順を用いるとは? 適切な試験方法を用いる = 適切な手順? 自分たちの試験室で同じ性能が得られることを確認する 記録する 確認結果に基づき 具体的な手順書を作成する 教育 訓練する 41

42 自分たちの試験室で同じ性能が得られることを確認する 検証 Verification 得られた結果の評価を含めて 記録として管理する 42

43 確認結果に基づき 具体的な手順書を作成する 標準作業書 SOP 器具 試薬 培地 装置等の仕様 使用方法 管理の手順も含める 43

44 試験員の教育 訓練 力量の確認資格 権限付与 教育 訓練及び技量に関する目標に基づく教育 訓練プログラム 44

45 試験対象の微生物が検出できていますか? 使用培地 培地の選択性 培地の性能 ( ロット間差 保管中の変質 ) 菌の損傷の程度も影響 温度 時間の影響? インキュベータの性能 試験員の手順 手技は適切か? 技能試験への参加 認証標準物質を用いた検証 内部質管理の実施 45

46 測定のトレーサビリティ トレーサビリティとは 不確かさがすべて表記された 切れ目のない比較の連鎖を通じて 通常は国家標準又は国際標準である決められた標準に関連づけられ得る測定結果又は標準の値の性質 (VIM2 6.10) VIM 3:International Vocabulary of Metrology 2007 年に ISO/IEC GUIDE 99 として発行された 46

47 ISO/IEC 測定のトレーサビリティ 試験 SI 単位へのトレーサビリティが不可能な場合及び / 又は当てはまらない場合には 例えば 認証標準物質 合意された方法及び / 又は合意標準へのトレーサビリティが要求される (SI 単位によって行うことが出来ない校正の場合 ) - 物質の信頼できる物理的又は化学的特性を与えるために能力がある供給者から供給された認証標準物質の使用 - 明確に記述され すべての関係者によって合意されている規定された方法及び / 又は合意標準の使用 可能な場合 適切な試験所間比較プログラムへの参加が要求される 47

48 測定のトレーサビリティ体系図 国際 / 国家標準 ILAC/APLAC MRA メンバにより認定された機関 公定法国際規格 国家規格 標準物質生産者 妥当性確認 参照標準 実用標準 標準菌株 (ATCC ) 保存用菌株 標準物質標準品 検証 標準作業手順書 (SOP) 菌試験法 測 定 試験結果 48

49 ISO/IEC 測定の不確かさの推定 試験所は 測定の不確かさを推定する手順を持ち 適用すること ある場合には 試験方法の性質から厳密で計量学的及び統計学的に有効な測定の不確かさの計算ができないことがある このような場合には 試験所は少なくとも不確かさのすべての要因の特定を試み 合理的な推定を行い 報告の形態が不確かさについて誤った印象を与えないことを確実にすること 合理的な推定は 方法の実施 (Performance) に関する知識及び測定の範囲 (Scope) に基づくものであること 例えば 以前の経験又は妥当性確認のデータを活用したものであること 49

50 微生物試験の不確かさの要因 サンプリング 試料採取 前培養 希釈 / 分取 分離培養 培養 判定 MPN 値の決定 コロニーカウント 定性 MPN 法定量 50

51 微生物試験の問題点 ( 難しさ ) 試験品中の ( 付着している ) 微生物の分布が不均一 対象となる微生物が少量 対象となる微生物の損傷の程度が一定でない 試験品の保管 試料調製中 試験操作中の対象微生物の増殖 / 減衰 試料量を増やす? どの程度? コストとリスク 統計的考えが必要 51

52 測定の不確かさの推定 積み上げ方式 (Bottom up) A タイプ : 測定のくり返しによる標準偏差 B タイプ : 仕様書 校正証明書 文献等のデータの確率分布を想定し その除数で割って得た標準偏差 Top down 方式 Bottom up と Top down の組み合わせ 52

53 ISO/TS Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations 再現性の標準偏差の利用の順位 1. 室内再現精度 ( 内部品質管理データ ) 2. 試験法の妥当性確認のための共同実験の再現精度 ( 室間精度 ) 3. 技能試験の標準偏差 53

54 ISO/TS 19036:2006 測定値の不確かさの主な要因 出典 :ISO/TS 19036:

55 ISO/TS 19036:2006 室内再現性を求めるためのプロトコール 出典 :ISO/TS 19036:

56 測定値の不確かさの推定例 出典 :ISO/TS 19036:

57 微生物試験結果の不確かさ 統計処理は log 10 に変換して行う 不確かさの表記例 5.0 log ± 0.3 log 5.0 log [4.7, 5.3] 10 5 cfu/g [5 10 4, ] 10 5 cfu/g [ %, %] 57

58 95% 信頼レベルで統計的に算出 MPN 値 LOD50 POD 最確数 (MPN : Most Probable Number) により菌数を算定 (3 本 5 本法 ) 検出レベル LOD50(95% 信頼のレベルでの50% 検出率 ) PODモデル POD (Probability of Detection) 定性試験の評価指標としてAOACが提唱 58

59 delines.aspx 59

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65 Version 09/11/2002 Limit of Detection Program for Qualitative Microbiology Methods < > PURPOSE This programmed non-parametric statistical procedure (Spearman-Karber 50% Endpoint) will calculate the microbial analyte concentration (and confidence limits) in a given food matrix that corresponds to a 50 % probability of a positive result with the test method used. The microbe may be spiked or incurred. REQUIREMENTS 1. A minimum of three different concentrations is needed but more are preferable even at the expense of the degree of replication. 2. At least one spiking level should give a partially positive response otherwise no confidence limits can be calculated. 3. One of the concentration (spiking) levels should give a 100% response. 4. One of the concentration levels should give a 0% response (= negative control). 5. Three, and preferably at least 5 or 6, replicates per concentration (spiking) level are needed. (the confidence level window narrows with increased replication) 6. A constant analytical portion size. 7. Equal spacing of log spiking (concentration) levels and equal numbers of replicates per spike level are preferable but not obligatory. 65

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