光学顕微鏡法によるアスベスト分析の現状と課題

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つづるだいほうじ
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1 光学顕微鏡法によるアスベスト分析の現状と課題元兵庫県健康環境科学研究センター小坂浩

2 ( 大気環境中アスベスト濃度測定における ) PCM 法の精度向上のために検討すべき事項除去工事現場測定の場合は処理される素材を事前に把握する電子顕微鏡の活用 (PCM 法とのデータの比較 ) 偏光顕微鏡の活用定期的なクロスチェックによる機関内機関間の精度管理新しい分析者のトレーニングプログラムの確立

3 TEM 電子顕微鏡による計数ルール ISO 13794( 間接法 ) ISO 10312( 直接法 ) すべてのアスベスト繊維長さ :>5μm PCM 等価アスベスト繊維 ( 径は 0.2μm<d<3μm) NIOSH 7402 NIOSH7400(PCM) と同じルール ( 長さ :> 5μm AR:>3:1) で径は >0.25μm(NIOSH7400 では径の上限はない ) SEM ISO PCM 等価アスベスト繊維 ( 長さ :> 5μm AR:>3:1 径 : 0.2μm<d<3μm)

4 クロスチェックについて目的或いは効果 1 分析機関内 ( 分析者複数の場合 ) 2 分析機関間 3 国際的の3つの精度管理これまでのクロスチェックの問題点繊維濃度の真値がわからない全体の平均値或いは中央値を基準に評価していた同じスライドを使っても視野を再現出来なかった視野の違いによるデータのばらつきアスベスト標準試料によるスライドの作製( 実大気のサンプルではなく妨害繊維がない )

5 繊維密度が PCM 計数値に及ぼす影響フィルター上の繊維密度が計数値に及ぼす影響を検証熟練分析者に様々な密度のサンプルを計数させたところ 1) 高密度サンプル (>2000 本 /mm 2 ) では過小評価 ( 多数の繊維の妨害による ) 2) 低密度サンプル (<100 本 /mm 2 ) では過大評価 ( 背景の模様を繊維と誤判定して ) 作業環境サンプリングでは繊維密度が 100~1000 本 /mm 2 になるように採気量を調節することを提案 100 本 /mm 2 とは ; グレイティクルの 300μm の円内に繊維が 7 本存在する状態 Cherrie, et al; Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 47, pp , 1986

6 透明化処理による繊維の移動の検証 (1) 粉じん面を下向きにして透明化した場合 ( アモサイト ) SEM 像 1500( 透明化前 ) 位相差像 400( 透明化後 ) 透明化前後で繊維の位置に変化がないことがわかる

7 透明化処理による繊維の移動の検証 (2) 粉じん面を下向きにして透明化した場合 ( アモサイト ) SEM 像 500( 透明化前 ) 位相差像 400( 透明化後 ) 粉じん面を下向きにした透明化では繊維は移動しなかったが粉じん面を上向きにして透明化した場合繊維が元の位置から移動することが確認された

8 SEM と PCM との計数値比較の一例 ( 単位 : 本 /L) SEM >0.5μm >0.1μm PCM 解体現場クリソタイル解体現場アモサイト解体現場クロシドライト標準クリソタイル標準アモサイト標準クロシドライト上記の 6 種類のサンプルのフィルターをそれぞれ SEM 用 PCM 用に分けて計数した SEM と PCM で同一の場所を計数したデータではない

9 分散染色法の原理粒子は浸液に浸されていて粒子と浸液の屈折率が右図の関係にある場合を例にとって説明するマッチングポイント(n 1 =n 2 ) より短波長側ではn 2 >n 1 長波長側ではn 1 >n 2 だから波長に応じて下図のような屈折が起こる浸液 (n 2 ) 屈折率浸液の屈折率 (n 2 ) 屈折率のマッチングポイント粒子の屈折率 (n 1 ) 粒子 (n 1 ) 白色光入射光と物質の面が直角になる場所では光は直進し分散は生じないこの例では緑の光は対物レンズのマスクで遮られ観察者には赤と青の光が届くが加法混色により粒子の色はマゼンダを呈する粒子の色合いはマッチングポイントの波長に依存する ( 光の 3 原色について例を示した加法混色の図を参照 ) 青 545nm( 緑 ) 屈折率の波長依存性赤波長 n 1 n 2 の差が大きいことと可視光線の波長域内にマッチングポイントがあることがきれいな発色を得るための必要条件

位相差顕微鏡の場合対物レンズの前焦点面にセットされたリング状のコンデンサ絞りを通った入射光 ( 直進光 ) は絞りの像 ( リング状

10 加法混色 ( 光の 3 原色での例分散染色法ではカットされる波長が連続スペクトルの一部なので混色はもっと複雑になる ) 分散染色法ではマッチングポイントの波長の光は直進する位相差顕微鏡の場合対物レンズの前焦点面にセットされたリング状のコンデンサ絞りを通った入射光 ( 直進光 ) は絞りの像 ( リング状 ) を後ろ焦点面に結像するその結像位置にマスクを重ね合わせると直進光は遮られる ( この方式をセントラルストップと呼ぶ ) 遮られる光の波長 (= マッチングポイントの波長 ) によって粒子の色は上図のように変化する

11 分散染色法は大気サンプルに応用出来るか? サンプル作製法 (1) 吸引ビン中でクリソタイルを発じんさせフィルターに捕集フィルターをスライド上で透明化後低温灰化 (2) アスベストを水分散させフィルターにろ過フィルターをスライド上で透明化後低温灰化 (3) アスベストを水分散させ懸濁液を一滴スライド上に滴下して乾燥させる

12 空気分散クリソタイル位相差像 400 低温灰化後浸液なしで観察左の視野の分散染色像位相差像中央のクリソタイルが発色しない ( 矢印の粒子はそれぞれ位相差像の矢印の粒子に対応 )

13 水分散クリソタイル ( ろ過後低温灰化 ) 位相差像 100 低温灰化後浸液なしで観察高密度のクリソタイル左右の繊維が黒く見えるのは光が透過していないため左の視野の分散染色像 x100 位相差像で黒く見える左右の太い繊維が発色高密度の細い繊維は発色しない

14 水分散アモサイト ( スライド上で乾燥 ) 位相差像 100 左の視野の分散染色像 x100 位相差像中の繊維のうちの数本だけが発色

15 クリソタイル SEM 像 ( 試料を 80 傾斜 ) クリソタイルを分散させた懸濁液をカバーグラス上で乾燥細い繊維は下地に密着しているが太い繊維は例えば矢印の部分のように下地から浮き上がっていることがわかる

16 SEM 像と位相差像との対比 SEM 像を撮影後フィルターを透明化し PCM で SEM 像の繊維を探す 100μm SEM 像位相差像 X100 分散染色用浸液を滴下する前の観察

17 分散染色像全体 ( 細い繊維は発色しない )

18 分散染色像前図の内の拡大位相差像 X400 分散染色像位相差像中の細い繊維は発色しない

19 SEM 像と位相差像との対比 ( アモサイトその 1) 50μm SEM 像位相差像 X400 分散染色用浸液を滴下前の観察

20 分散染色像 ( アモサイトその 1) 分散染色用浸液の屈折率 :1.69 位相差像 400 分散染色像アナライザ抜き位相差像の一部の繊維しか発色しない色合いは繊維中の光の振動方向 (2 方向 ) 別の分散色が加法混色によって混合した色になっている

21 分散染色像 ( アモサイトその 1) ( アナライザ使用色合いの変化は繊維が複屈折性を持つことを示す ) n n アナライザを矢印の方向に合わせたアモサイトの屈折率は n >n で黄色の発色はマッチングポイントが青の波長域であることを示すアナライザを矢印の方向に合わせた繊維と浸液との屈折率のマッチングポイントが長波長側になり赤や緑の光がカットされるので青が勝る色合いになる

22 SEM 像と位相差像との対比 ( アモサイトその 2) 50μm SEM 像位相差像 X400 分散染色用浸液滴下前の観察

23 分散染色像 ( アモサイトその 2) 位相差像 400 分散染色像アナライザ使用位相差像で確認出来る繊維の一部しか発色しない

24 アスベスト繊維が発色しない理由スライドガラスと繊維の密着状態が影響すると考えられる観察結果との整合性 : バルクサンプルは発色する繊維は浸液に浸された状態密着したクリソタイルは発色しない非常に太い繊維は一部または全部がガラス面から浮いており発色する針状のアモサイトは密着しない繊維があり一部の繊維は発色する

25 PCM: その限界と適用範囲限界 : 分解能形態観察のみ利点 : 簡便迅速 (on-site 分析も可 ) 低価格リスク評価の基礎データ PCM の適用範囲 : 繊維径の分布が極端に細いものに偏っていなければ飛散監視等に使えるのではないか?

26 漏えいクロシドライトの繊維サイズ計測した繊維数 :281 本径が >1μm の繊維数 :20 本 (7%) L 5μm 5<L 10μm 10<L 20μm L>20μm アスペクト比 3 3< 5 5< 6 6< 7 7< 8 8< 9 9< 10 10< 20 20< 繊維長 :μm < 10 10< 15 15< 20 20< 25 25< 30 30< 35 35< 40 40< 45 45< 50 50< 55 55< 60 60< 本数本数 ( 5μm:12%) 3 本数 2 1 径が 1μm 超の繊維の長さ別分布 0 5< 10 10< 20 20< 30 30< 40 40< 50 50< 繊維長 :μm

27 観察対象物質によって使い分けが必要な対物レンズ対象物質と媒質との位相差の程度に応じて位相差顕微鏡のレンズは使い分けられる位相板で直接光の吸収率を上げるとコントラストは強くなるが背景は暗くなり物体の縁の光のにじみ ( ハロー ) も強くなるコントラストの強さは DM(medium)>DL(low)>DLL(low low) の順我が国ではアスベスト分析には DLL または DL レンズが使われている

28 PCM 対物レンズの違いによるコントラストの差クリソタイル DLL レンズ DM レンズ

29 アスベスト繊維の計数ルール繊維の定義の由来英国のアスベスト企業が設立した Asbestosis Research Council が作業環境測定データの統一のために幾何学的定義を定める (1958) アスペクト比 >3:1 に科学的根拠はない幾何学的定義の適用範囲作業環境測定に適用する合理的根拠はあるアスベストの存在が不明な条件下での適用はどうか? 一般環境解体工事現場室内環境産廃処理施設周辺溶融処理後の無害化確認 etc

30 アスベストと非アスベストの分別計数 WHO の気中濃度測定法 (1997) PLM 電顕を使った分別計数を認める ( 計数は熟練分析者が行なうことという但し書き付き ) 英国の MDHS 87 PCM による繊維数計数と PLM 蛍光顕微鏡電顕を使ったアスベスト繊維の分別の組み合わせ米国 ASTM の Discriminatory Counting PCM と TEM による段階的分析法

31 アスベストとへき開粒子トレモライトの 3 種の形態柱状 (prismatic) 針状 (acicular) アスベスト (asbestiform)

32 アモサイトの断面 (SEM 像 ) 単繊維 (fibril) が at random な向きで束 (bundle) になっているこの構造がへき開粒子との光学的特性の違いを生じさせる

33 アスベストとへき開粒子の分別に有効な偏光顕微鏡アスベストは直消光アスベスト - トレモライトの消光角

34 へき開トレモライト ( 単結晶 ) 偏光顕微鏡像 X400

35 偏光顕微鏡による多色性 (Pleocroism) の観察クロシドライトとアモサイトの判別が可能クロシドライト対角位を右上がりから左上がりに変えると繊維の色合いが黄 dark blue になるアモサイトどちらの対角位 ( 矢印 ) になっても繊維の色合いは黄色で変わらない

36 海外での光学顕微鏡法の精度管理英国 :PCM 法アスベスト分別計数法含有率分析について認証機関が実施米国 :PCM 法含有率分析についてAIHA 及び NISTが実施ニューヨーク州は含有率分析について独自に実施フランスベルギースペインでも精度管理を実施

, 61, pp529-538(2000) Harper 等は多くの分析機関の合意によって各視野の繊維数を決定しその値を

37 Relocatable Slide と合意基準 Pang が視野を正確に再現出来るスライドを開発 Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 61, pp (2000) Harper 等は多くの分析機関の合意によって各視野の繊維数を決定しその値を合意基準とすることを提案 Am.Ind.Hyg.Assoc.J., 64, pp (2003) アモサイトの Relocatable Slide 円の直径は 100μm で顕微鏡下で Walton-Beckett グレイティクルと一致する

38 グレイティクルの比較改良の余地がある我が国のグレイティクル目盛りが計数の邪魔にならないか? 欧米で使われている Walton-Beckett グレイティクル (100μmφ) 我が国で普及しているグレイティクル (100μmφ と 300μmφ を有する )

39 クロスチェック成績評価シートの一例 (Relocatable Slideを使ったNIOSH-AIHAのクロスチェック試験プロジェクトで使われている ) SLIDE NUMBER ANALYST NAME PROFICIENCY EVALUATION OF PCM FIBRE COUNTING Round 1 # OF "VERIFIED" FIBRES = 112 NORMALISED D # OF FIBRES REPORTED (RF) = 105 NORMALISED D # OF DISCREPANCIES = 60 SUM OF NORMALISED D+ + D NORMALISED RF SCORE = **** D I S C R E P A N C I E S ************************************************ VERIFIED REPORTED POSITIVE NEGATIVE TOTAL FIELD GRID # FIELD ID FIBRES FIBRES DISCREPANCIES DISCREPANCIES DISCREPANCIES VF RF RF -VF D+ D- D+ + D- NUMBER #1 1 F #2 1 F #3 1 F #4 1 F #5 1 F #6 1 F #7 1 F #8 1 F #9 1 F #10 1 F SCORE=100 ー [ 100 (# total discrepancies/# verified fibers)] 正解値 ( ) と報告値 ( ) の差はわずか 7 でこの分析者の精度はよさそうだが数え過ぎ (D+) と見落とし ( D- ) の総和でスコアを出すと 50 点以下で計数精度は悪い総繊維数だけの比較では個人の精度を正しく評価出来ない

40 クロスチェック結果の国際比較 (2006 年 ) ( 仮に Score60 点以上を proficient( 熟練者 ) とする ) カナダアモサイトスライド :46 名中 6 名が60 点以下 (13%) クリソタイルスライド :50 名中 12 名が60 点以下 (24%) 日本 ( 約 30 の公的研究機関約 60 名参加 ) アモサイトスライド :58 名中 5 名が60 点以下 (8.6%) クリソタイルスライド :56 名中 38 名が60 点以下 (67.9%) アモサイトに比べるとクリソタイルは日加どちらの国の分析者も成績が悪く計数が難しいことがわかる

41 まとめ 1. 光学顕微鏡法の簡便性迅速性はアスベスト分析に有効である 2.PCM の限界を補う他の手法を組み合わせた重層的分析手法が開発され発展しつつある 3.PLM はへき開粒子や角閃石粒子 ( ホルンブレンド等 ) とアスベストを分別出来る 4. 電顕の活用法 ( 光顕との使い分け光顕の補完等 ) の検討が必要である 5. 光顕法には精度管理システムの確立が必須である ( 系統誤差の最小化 )

●02-1.【資料２】迅速分析方法の位置付けについて

●02-1.【資料２】迅速分析方法の位置付けについて位相差/偏光顕微鏡法による石綿繊維数濃度0 1 10 100 1,000 10,000 資料 2 迅速分析方法の位置付けについて 1. 迅速分析方法の検討の必要性中央環境審議会の中間答申 ( 平成 25 年 2 月 20 日 ) においては解体等工事を行う事業者に対する敷地境界等での大気中アスベスト濃度測定の義務付けが指摘されているが現在の分析法では採取した試料にアスベストが含まれているかどうかの判定に数日を要すること等の技術的課題があることから