日本標準商品分類番号カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制す

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れんかなつ
5 years ago
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日本標準商品分類番号 872491 カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制することが示されたが血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はないそこで今回

を添加しその培地にカリジノゲナーゼをそれぞれ 0.01 0.1 1.0 および 10μg/mL となるよう添加した培養 11 日目に解析ソフト ( 血管新生キット定量ソフトウェア Ver.

4 9 2 n m ) を測定することにより定量した 3) 細胞遊走試験 (in vitro) 1well あたり4 10 4 cell の HUVEC または HRMEC を12 穴マイクロプレートに播種した細胞の一部をはがし取り VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加し 24 時間後にその領域に移動してきた細胞数の測定を行った 4) 細胞増殖および細胞遊走シグナルについての

1 日本標準商品分類番号カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた最近では糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより血管透過性を抑制することが示されたが血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はないそこで今回網膜血管新生に対するカリジノゲナーゼの役割を同定するため in vitro 及び in vivo モデルを用いて抗血管新生作用を検討した < 試験方法 > 1) 管腔形成試験 (in vitro) ヒト臍帯静脈内皮細胞 ( 以下 HUVEC) と皮膚線維芽細胞の共培養系モデル ( 血管新生キットクラボウ ) を用いたあらかじめ培地中に血管新生促進物質である VEGF165 10ng/mL を添加しその培地にカリジノゲナーゼをそれぞれおよび 10μg/mL となるよう添加した培養 11 日目に解析ソフト ( 血管新生キット定量ソフトウェア Ver.2 クラボウ ) を用いて新生血管の管腔面積総延長分岐点数および枝数を測定した 2) 細胞増殖試験 (in vitro) 1well あたり cell の HUVEC またはヒト網膜毛細血管内皮細胞 ( 以下 HRMEC) を96 穴マイクロプレートに播種した VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加後 CCK-8 を用いた WST assayを行い吸光度 ( n m ) を測定することにより定量した 3) 細胞遊走試験 (in vitro) 1well あたり cell の HUVEC または HRMEC を12 穴マイクロプレートに播種した細胞の一部をはがし取り VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加し 24 時間後にその領域に移動してきた細胞数の測定を行った 4) 細胞増殖および細胞遊走シグナルについての western blot 解析 (in vitro) HUVEC 細胞 / ウェルの密度で 12 ウェルプレートへ播種しサブコンフルエンスの状態になるまで培養を行った VEGF165 およびカリジノゲナーゼを添加し VEGF2 型受容体 ( 以下 VEGFR2) は添加 2 分後 ERK1/2 および p38 は添加 5 分後にそれぞれ VEGF165 誘発リン酸化抑制作用について western blot 解析を行ったさらに検出試薬を用いてバンドを発色させその輝度を測定することにより定量化した 5)VEGF165 切断試験 (in vitro) Cell-free の状態で培地中に VEGF165 およびカリジノゲナーゼを混合して 6 時間反応させ western blot によりバンドを検出した 6) マウス未熟児網膜症モデル ( 以下 OIR モデル ) に対する作用 (in vivo) 本モデルは C57BL/6 マウスを生後 7~12 日目まで 75% 高酸素条件下で飼育しその後 13 ~17 日目まで通常大気条件下で飼育することにより網膜中に異常血管を誘発させる本試験では生後 13 ~17 日目までの 5 日間カリジノゲナーゼを皮下投与した 7) ヒト硝子体液中カリジノゲナーゼ VEGF 濃度 (in vitro) 硝子体手術を施行した増殖糖尿病網膜症 (PDR) 黄斑円孔(MH) 黄斑上膜 (E R M) 患者の硝子体液中カリジノゲナーゼ濃度及び VEGF 濃度を測定するとともにカリジノゲナーゼによる硝子体液中 VEGF165 の切断作用を検討した

2 VEGF165 の血管新生作用と VEGF165 の切断作用 VEG 血管内皮 VEGFR1 リン酸化 p38 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01 :p<0.05 (student t-test) p38 リン酸化細胞遊走細胞遊走抑制作用 (HRMEC) 血管新血管新生抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01(student t-test) **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 )

3 カリジノゲナーゼの抑制作用 F165 VEGF165 の切断部位の検討細胞 VEGFR2 リン酸化生 PKC ERK1/2 血管新生抑制作用 (HUVEC) リン酸化細胞増殖 ##:p<0.01(student t-test)**:p<0.01 *:p<0.05(dunnett の多重比較 ) VEGFR2 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 ) 生食を 1 とした相対比 ERK1/2 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01 :p<0.05 (student t-test) 細胞増殖抑制作用 (HRMEC) ##:p<0.01(student t-test) *:p<0.05(dunnett の多重比較 )

OIR モデルマウスに対する作用 OIR モデルマウスにカリジノゲナーゼを皮下投与したところ異常血管である Node 数及び Node

付近に切断された VEGF164 の断片が確認された生食カリジノゲナーゼ **:p<0.01 *:p<0.

いずれも黄斑円孔 ( M H ) や黄斑上膜 (ERM) に比べて増殖糖尿病網膜症 (PDR) では有意に高値を示し両者には統計学的に有意な相関 (p<0.

4 OIR モデルマウスに対する作用 OIR モデルマウスにカリジノゲナーゼを皮下投与したところ異常血管である Node 数及び Node 面積を用量依存的に有意に抑制したまたカリジノゲナーゼ投与群における網膜及び硝子体液を分析したところ 21kDa 付近における VEGF164 の減少と 16kDa 付近に切断された VEGF164 の断片が確認された生食カリジノゲナーゼ **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 ) ヒト硝子体液カリジノゲナーゼ VEGF 濃度の関係ヒト硝子体液中のカリジノゲナーゼと VEGF 濃度を測定したところいずれも黄斑円孔 ( M H ) や黄斑上膜 (ERM) に比べて増殖糖尿病網膜症 (PDR) では有意に高値を示し両者には統計学的に有意な相関 (p<0.001) が認められた PDR 患者の硝子体液ではカリジノゲナーゼを添加することで 16kDa 付近に切断されたVEGF165の断片が確認された ** ##:p<0.001 (Steel-Dwassの多重比較) p<0.001 (Spearman の順位相関検定 )

生理的血管新生に対する作用 OIR モデルマウスで生後 8 日目 ( 相対的虚血負荷前 ) の生理的血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ

のリン酸化に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところいずれの項目に対しても有意な変化は見られなかった ##:p<0.01(st

)n.s.(dunnett の多重比較 ) a: 生後 0 日 ( コントロ - ル ) b: 生後 4 日 ( コントロ - ル ) c: 生後 8 日 ( コントロ

5 生理的血管新生に対する作用 OIR モデルマウスで生後 8 日目 ( 相対的虚血負荷前 ) の生理的血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ血管の管腔面積総延長分岐点数および枝数には有意な差が認められなかった VEGF121 に対する影響 VEGF121 による血管内皮細胞の増殖遊走及び VEGFR2 のリン酸化に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところいずれの項目に対しても有意な変化は見られなかった ##:p<0.01(student t-test)n.s.(dunnett の多重比較 ) a: 生後 0 日 ( コントロ - ル ) b: 生後 4 日 ( コントロ - ル ) c: 生後 8 日 ( コントロ - ル ) d: 生後 8 日 ( カリジノゲナ - ゼ ) N.S.(student t-test) N.S.(student t-test) 生食を 1 とした相対比 ##:p<0.01(student t-test) N.S.(Dunnett の多重比較 ) 本文中の図表はすべて中村信介原英彰他 :ATVB 31: 及び SFⅣ SFⅤ,2011

6 年 2 月改訂 CAR-127R PM0216

能性を示した < 方法 > M-CSF RANKL VEGF-C Ds-Red それぞれの全長 cdnaをレトロウイルスを用いてHeLa 細胞に遺伝子導入したこれによりM-CSFとDs-Redを発現するHeLa 細胞 (HeLa-M) RANKLと Ds-Redを発現するHeLa 細胞 (HeL

能性を示した < 方法 > M-CSF RANKL VEGF-C Ds-Red それぞれの全長 cdnaをレトロウイルスを用いてHeLa 細胞に遺伝子導入したこれによりM-CSFとDs-Redを発現するHeLa 細胞 (HeLa-M) RANKLと Ds-Redを発現するHeLa 細胞 (HeL 学位論文の内容の要旨論文提出者氏名秦野雄論文審査担当者主査竹田秀副査北川昌伸山口朗論文題目 Tumor associated osteoclast-like giant cells promote tumor growth and lymphangiogenesis by secreting vascular endothelial growth factor-c ( 論文内容の要旨 )