ブラキポディウム Bd21 形 質 転 換 の 手 順 Bd21 種 子 を 濾 紙 上 に 播 種 *1 4 dark 4 日 ~1 週 間 *1 <ブラキポディウムの 育 成 > 参 照 h Light で 育 成 3~4 日 間 実 生 を 土 壌 ポットに 植 え 替 え 22

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1 ここに 公 開 する ブラキポディウム Bd21 形 質 転 換 の 方 法 は 理 化 学 研 究 所 バイオマス 研 究 基 盤 チームの 舞 岡 ブランチ( 横 浜 市 立 大 学 木 原 生 物 学 研 究 所 内 )で 実 施 している 方 法 です なお プロトコールを 作 成 するにあたり Sílvia C Alves, Barbara Worland, Vera Thole, John W Snape, Michael W Bevan and Philippe Vain (2009) A protocol for Agrobacterium-mediated transformation of Brachypodium distachyon community standard line Bd21 Nature Protocols 4: (doi: /nprot ) および 植 物 細 胞 分 子 生 物 学 会 30 周 年 記 念 植 物 バイオテクノロジー プロトコル 集 ブラキポディウム Brachypodium distachyon ( 理 化 学 研 究 所 植 物 科 学 研 究 センター 松 井 グループ) を 参 考 とさせて 頂 きました

2 ブラキポディウム Bd21 形 質 転 換 の 手 順 Bd21 種 子 を 濾 紙 上 に 播 種 *1 4 dark 4 日 ~1 週 間 *1 <ブラキポディウムの 育 成 > 参 照 h Light で 育 成 3~4 日 間 実 生 を 土 壌 ポットに 植 え 替 え h Light で 育 成 7 週 間 *2 未 熟 胚 を 取 り 出 し BDD プレートに 移 植 25 dark 3 週 間 新 しい BDD プレートに 移 植 25 dark 2 週 間 新 しい BDD プレートに 移 植 25 dark 1 週 間 *3 Agrobacterium 感 染 25 dark 2 日 間 *4 BDSE プレートに 移 植 25 dark 3 週 間 *4 新 しい BDSE プレートに 移 植 25 dark 3 週 間 BDR26 プレートに 移 植 h Light 2 週 間 *2 < 胚 カルスの 作 製 > 参 照 約 20 個 /プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 移 植 後 shoot が 伸 びてきたら なるべく 早 く 切 り 取 る クリーム 色 で 形 のしっかりしたカルスを 移 植 する 約 20 カルス/プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 大 きめのカルスは 4-6 つに 割 る 70 カルス/プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 得 られたカルスの 数 はカウントしておく *3 <Agrobacterium の 感 染 > 参 照 *4 <カルスの 薬 剤 選 抜 と 再 分 化 の 誘 導 > 参 照 カルスを 細 かく 割 る 約 50 カルス/プレートで 移 植 し パラフィルムを 巻 く Hyg 耐 性 の 無 い 組 織 は 出 来 るだけ 取 り 除 く 同 一 カルス 由 来 のものは 同 じ 区 画 に 置 く 約 30 カルス/プレートで 移 植 し パラフィルムを 巻 く 20 カルス/プレートで 移 植 し パラフィルムを 巻 く Hyg 耐 性 の 無 い 組 織 は 出 来 るだけ 取 り 除 く 同 一 カルス 由 来 のものは 同 じ 区 画 に 置 く 約 20 カルス/プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 再 分 化 個 体 を 1/2MS 培 地 に 移 植 h Light 3 週 間 土 壌 ポットに 植 え 替 え h Light で 育 成 同 一 カルス 由 来 の 再 分 化 個 体 (2-3 個 まで)は 同 じ 区 画 に 置 く 約 12 区 画 /プレートで 移 植 する シュートが 得 られないカルスはもう1 回 新 しい BDR26 プレートに 移 す 同 一 カルス 由 来 の 個 体 は 最 も 根 の 張 りが 良 い 個 体 を 選 ぶ 2

3 培 地 の 組 成 BDD プレート Murashige & Skoog medium, including vitamins 4.41 g 30 g 20 mg/ml 2,4-D 125 ul 5 mg/ml CuSO ul ( final 0.6 ug/ml ) Gellan Gum 1N KOH で ph 5.8 に 調 整 BDA 液 体 培 地 Polypepton 5 g Yeast extract 2.5 g NaCl 5. L-Glutamic acid 2.3 KH 2 PO g MgSO 4 7H 2 O 0. 5N NaOH で ph 7.2 に 調 整 室 温 保 存 アグロバクテリウム 培 養 時 に 抗 生 物 質 とアセトシリンゴン 溶 液 (final 30 ug/ml)を 添 加 アグロ 感 染 液 200 ml Murashige & Skoog medium,basal Salt Mixture 0.86 g mannitol Murashige & Skoog medium は vitamin が 入 っていないものを 使 用 1N KOH で ph 5.5 に 調 整 3

4 BDSE プレート Murashige & Skoog medium, including vitamins 4.41 g 30 g 20 mg/ml 2,4-D 125 ul 5 mg/ml CuSO4 120 ul ( final 0.6 ug/ml ) Gellan Gum 50 mg/ml Hygromycin * 800 ul ( final 40 ug/ml ) 250 mg/ml Carbenicillin 1000 ul ( final 250 ug/ml ) * ベクターの 薬 剤 耐 性 によって 異 なる 1N KOH で ph 5.8 に 調 整 BDR26 プレート Murashige & Skoog medium, including vitamins 4.41 g 30 g 2 mg/ml Kinetin 100 ul Gellan Gum 50 mg/ml Hygromycin * 400 ul ( final 20 ug/ml ) 250 mg/ml Carbenicillin 200 ul ( final 50 ug/ml ) * ベクターの 薬 剤 耐 性 によって 異 なる 1N KOH で ph 5.8 に 調 整 1/2MS 培 地 Murashige & Skoog medium, including vitamins g 植 物 培 地 用 Agar 6 g Gellan Gum 250 mg/ml Carbenicillin 200 ul ( final 50 ug/ml ) 1N KOH で ph 5.8 に 調 整 4

5 < 胚 カルスの 作 製 > 必 要 な 物 育 成 7 週 のブラキポディウム(Brachypodium distachyon)bd21 50 ml チューブ 10% 次 亜 塩 素 酸 ナトリウム 1% Tween-20 滅 菌 水 BDD プレート 先 端 部 の 細 いピンセット 注 射 針 白 金 線 ホルダー 方 法 1 育 成 7 週 の 植 物 から 種 子 を 切 り 取 る 外 穎 を 剥 いて 滅 菌 水 9 ml を 加 えた 50 ml チューブに 入 れる 2 ここからの 操 作 はクリーンベンチの 中 で 1のチューブに 10% 次 亜 塩 素 酸 ナトリウムを 1 ml 1% Tween-20 を 200 ul 加 え 手 で 振 って 約 1 分 間 混 ぜる 3 上 清 をピペットで 手 早 く 取 り 除 き 滅 菌 水 を 10 ml ていど 加 え 手 で 振 って 混 ぜる この 操 作 をさらに 2 回 繰 り 返 す 4 実 体 顕 微 鏡 下 で 3の 種 子 から 未 熟 胚 を 取 り 出 す( 先 端 部 の 細 いピンセットや 注 射 針 を 取 り 付 けた 白 金 線 ホルダー 等 を 使 用 すると 良 い) 取 りだした 未 熟 胚 は 平 たい 方 を 上 に 向 けて BDD プレートに 移 植 する 5 未 熟 胚 を 約 20 個 /プレートで BDD プレートに 移 植 し サージカルテープを 巻 く 25 暗 所 で 3 週 間 培 養 する 培 養 中 shoot が 伸 びてきたら なるべく 早 く shoot を 切 り 取 る 6 新 しい BDD プレートに クリーム 色 で 形 のしっかりしたカルスを 移 植 する ( 透 明 で 崩 れやすい 組 織 はできるだけ 取 り 除 く) 約 20 カルス/プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 25 暗 所 で 2 週 間 培 養 する 7 新 しい BDD プレートに クリーム 色 で 形 のしっかりしたカルスを 移 植 する このとき 大 きめの カルスは 4-6 つに 割 る 約 カルス/プレートで 移 植 し サージカルテープを 巻 く 25 暗 所 で 1 週 間 培 養 する 5

6 <Agrobacterium の 感 染 > 必 要 な 物 LB + 抗 生 物 質 プレート 50 ml チューブ BDA 液 体 培 地 抗 生 物 質 ストック 40 mg/ml アセトシリンゴン 溶 液 1.5 ml 滅 菌 済 みチューブ 深 型 丸 シャーレ 滅 菌 済 み 濾 紙 アグロ 感 染 液 継 代 6 週 の 胚 カルスプレート 滅 菌 済 みキムタオル ピンセット 薬 さじ 方 法 [ 感 染 3-4 日 前 ] 1 形 質 転 換 に 用 いるアグロバクテリウム を グリセロールストックから LB + 抗 生 物 質 プレートに ストリークし 28 暗 所 で 2-3 日 間 培 養 する 当 研 究 室 では アグロバクテリウム EHA105 株 を 使 用 している また ベクターは pmdc140 pmdc164 を 用 いた 実 績 がある アグロバクテリウムの 各 株 の 入 手 先 は 下 記 の 文 献 が 参 考 になる Hellens R, Mullineaux P and Klee H (2000) A guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends in Plant Science 5 (10): [ 感 染 前 日 ] 250 ml ファルコンチューブに BDA 液 体 培 地 10 ml + 抗 生 物 質 + 40 mg/ml アセトシリンゴン 溶 液 7.5 ul(final 30 ug/ml)を 加 える 1のプレートからシングルコロニーを 2-3 個 かき 取 り 懸 濁 する 遮 光 して min -1 で 時 間 振 盪 培 養 する 6

7 [ 感 染 当 日 ] 3 培 養 液 の OD 600 が 1.0~1.2 程 度 になったら 5,000 rpm 室 温 5 min の 遠 心 で 集 菌 する 4 クリーンベンチの 中 で 深 型 丸 シャーレに 滅 菌 濾 紙 1 枚 を 敷 く 滅 菌 済 み 1.5 ml チューブに アグロ 感 染 液 1 ml + 40 mg/ml アセトシリンゴン 溶 液 1 ul を 調 整 し 濾 紙 に 750 ul 加 えて 湿 らせる 5 3の 上 清 を 捨 てる OD 600 = 0.8 になるようアグロ 感 染 液 を 加 え 1/1000 vol. の 40 mg/ml アセトシリンゴン 溶 液 を 添 加 して 懸 濁 する 6 継 代 6 週 の 胚 カルスプレートに 5の 懸 濁 液 を ml 加 えて 時 々 揺 すりながら 5 min 置 く 7 カルスを 滅 菌 キムタオル 上 に 取 り 出 し 余 分 なアグロバクテリウム 懸 濁 液 をなるべく 取 り 除 く 8 4のシャーレにカルスを 薬 さじ ピンセットを 使 って 広 げる シャーレにパラフィルムを 巻 いて 25 暗 所 で 2 日 間 培 養 する 7

8 <カルスの 薬 剤 選 抜 と 再 分 化 の 誘 導 > 必 要 な 物 Agrobacterium 感 染 後 の 2 日 間 共 存 培 養 したカルス ピンセット 薬 さじ BDSE プレート BDR26 プレート 1/2MS 培 地 プロミックス(プロミックス BX マイコライズ) 丸 2.5 号 ポット 底 面 給 水 トレー 透 明 プラスチックカバー プロフェッショナルハイポネックス 方 法 1 Agrobacterium 感 染 後 濾 紙 上 で 2 日 間 共 存 培 養 したカルスを 用 いる クリーンベンチの 中 で カルスを 細 かく 割 り( 薬 さじの 背 を 使 ってポロポロにする) BDSE プレートに 約 50 カルス/プレートで 移 植 する シャーレにパラフィルムを 巻 いて 25 暗 所 で 3 週 間 培 養 する 2 新 しい BDSE プレートに Hyg 耐 性 の 無 い 組 織 を 出 来 るだけ 取 り 除 き 約 30 カルス/プレート で 移 植 する このとき 同 一 カルス 由 来 のものは 同 じ 区 画 に 置 くようにする シャーレにパラフィルムを 巻 いて 25 暗 所 で 3 週 間 培 養 する 3 BDR26 プレートに Hyg 耐 性 の 無 い 組 織 を 出 来 るだけ 取 り 除 き 約 20 カルス/プレートで 移 植 する このとき 同 一 カルス 由 来 のものは 同 じ 区 画 に 置 く サージカルテープを 巻 いて 25 o C 16 h - Light 設 定 のグロースチャンバーに 2 週 間 置 く 8

9 4 シュートが 再 分 化 した 個 体 を 1/2MS 培 地 に 12 区 画 /プレートで 移 植 する このとき 余 分 なカルスは 取 り 除 くようにする 同 一 カルス 由 来 の 個 体 は 2-3 個 体 まで 同 じ 区 画 に 置 き 残 りは 除 去 する 25 o C 16 h - Light 設 定 のグロースチャンバーに 2-3 週 間 置 く *ここでシュートが 得 られないカルスは もう1 回 新 しい BDR26 プレートに 移 植 する 25 o C 16 h - Light 設 定 のグロースチャンバーに 2 週 間 置 き シュートが 得 られた 場 合 は 同 様 に 1/2MS 培 地 に 移 植 する 5 4で 育 成 させた 再 分 化 個 体 を 土 壌 ポットに 植 え 替 える このとき 同 一 カルス 由 来 の 個 体 は 最 も 根 の 張 りが 良 い1 個 体 を 選 ぶ オートクレーブ 済 みプロミックスを 詰 めた 丸 2.5 号 ポットに 1 個 体 ずつ 移 植 する ポットは 底 面 給 水 トレーに 入 れ 上 に 乾 燥 を 防 ぐためのカバーをかける 22 o C 20 h - Light 設 定 の 環 境 下 で 栽 培 を 開 始 する 6 4~7 日 後 にカバーを 外 して そのまま 栽 培 を 継 続 する 2-3 日 おきに 5000 倍 に 希 釈 したプロフェッショナルハイポネックス を 与 える 7 個 々の 植 物 体 からT1 種 子 を 収 穫 する 作 成 者 : 土 屋 有 美 子 恩 田 義 彦 9