ケミルミのコツ2015-6cc.indd

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1 電 気 泳 動 ~ 発 光 検 出 まで なるほど! のコツ(knacks & Tips) 情 報 が 満 載! ATTO Technical Manual 化 学 発 光 (ケミルミ) 検 出 のコツ ウエスタンブロッティング 編 ATTO Corporation Tokyo Motoasakusa Taito-ku Tokyo TEL FAX URL Osaka Higashitenma Kita-ku Osaka-city TEL FAX

2 目 次 はじめに 3 1. 電 気 泳 動 4~7 2.ウエスタンブロッティング 8~11 3.ブロッキング 12~13 4. 抗 原 抗 体 反 応 14~15 5. 発 光 基 質 添 加 と 発 光 検 出 16~17 6. 発 光 パターンの 撮 影 18~19 7.トラブルシューティング 20~21 ウエスタンブロッティングのコツ 22~24 Knacks & Tips for Western Blotting この 資 料 の 読 み 方 2

3 はじめに 本 資 料 は タンパク 質 をウエスタンブロッティング 法 によって 検 出 定 量 するための 基 本 的 な 実 験 方 法 の 手 順 を 左 ページに 記 し 関 連 の 特 記 事 項 注 意 事 項 などの 実 験 上 のポイント を 右 ページに 記 しています 左 右 の ページを 参 照 しながならお 読 みください なお ここでは 一 般 的 な 試 薬 のほかに アトー 製 試 薬 キットや 電 気 泳 動 装 置 などを 使 用 し 泳 動 ~ 抗 体 反 応 ~ 検 出 などの 実 験 方 法 における 細 かい 注 意 点 などをまとめています 検 出 にはケミルミネッセンス 撮 影 装 置 AE-9300 型 Ez-Capture MG を 例 にご 紹 介 しています これらの 実 験 方 法 は X 線 フィルムでの 検 出 他 社 ケミルミ 撮 影 装 置 にも 応 用 できますのでご 参 考 になれば 幸 いです ウエスタンブロッティング 法 は タンパク 質 抽 出 試 料 を 電 気 泳 動 によって 分 離 したのち PVDFメンブレ ン 上 にトランスファー( 転 写 )し 抗 体 を 用 いて 目 的 のタンパク 質 を 特 異 的 に 検 出 する 方 法 です 目 的 タンパク 質 に 特 異 的 な1 次 抗 体 を 反 応 させ 続 いてHRPなどの 酵 素 標 識 した2 次 抗 体 を 反 応 させた 後 酵 素 発 色 または 酵 素 反 応 による 発 光 でバンドを 検 出 します ウエスタンブロッティング 法 は 特 に 発 光 検 出 と 組 み 合 わせた 場 合 目 的 のバンドを 高 感 度 に 検 出 できます ウエスタンブロッティング 法 は 電 気 泳 動 転 写 ブロッキング 抗 原 抗 体 反 応 発 光 検 出 などの 全 ての 実 験 ステップが 成 功 して 初 めて 良 い 結 果 が 得 られます しかし さまざまなトラブルが 原 因 で 綺 麗 なデータが 得 ら れず 悩 んでいる 方 も 多 いと 思 います 多 くの 場 合 以 下 のようなケースが 見 られます バンドの 検 出 状 態 目 的 のバンドが 薄 く 確 認 ができない バックグラウンドが 高 い ムラなどにより 目 的 バンドの 確 認 ができない バンドやパターン 全 体 が 歪 んでしまう バンドの 中 心 が 白 抜 け( 黒 抜 け)する 汚 れのようなものが 検 出 される 発 光 パターンの 取 り 込 み 方 法 の 問 題 X 線 フィルムは 適 正 な 露 光 具 合 の 調 整 が 難 しい X 線 フィルムはデータの 読 み 取 りや 解 析 が 難 しい その 他 ポリクローナル 抗 体 を 使 用 しているので バンドの 分 子 量 を 推 定 したい バンドの 濃 淡 の 定 量 がうまくできない 上 記 のような 問 題 点 を 克 服 するには 細 かいテクニックや 工 夫 が 必 要 です 本 書 で 紹 介 する 今 までと 違 う 実 験 検 出 方 法 を 行 うことで 解 決 できる 場 合 もあります アトー 株 式 会 社 製 品 情 報 グループ 実 験 手 順 ポイント 3

4 1. 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) SDS-PAGE 1 試 料 (サンプル)の 調 製 細 胞 や 組 織 からタンパク 質 を 抽 出 し 精 製 します 電 気 泳 動 用 試 料 は 脱 塩 をしっかりしておきます 溶 解 しなかった 固 形 成 分 や 脂 質 は 遠 心 して 取 り 除 きます お 勧 め:WSE-7420 EzRIPA Lysis Kit 動 物 細 胞 用 全 タンパク 質 抽 出 試 薬 \9,000/kit 2ゲル バッファーの 調 製 SDS-PAGE 用 泳 動 バッファーの 調 製 必 要 な 試 薬 を 量 り 蒸 留 水 で 溶 解 します 試 薬 の 種 類 組 成 保 存 SDS-PAGE 用 泳 動 バッファー (Laemmliバッファー) 25mM トリス 192mM グリシン 0.1%(w/v) SDS AE-1410 EzRun(\6,800/10L 分 粉 末 ) 電 気 泳 動 ゲルの 作 製 ゲル 作 製 に 先 立 ち 下 表 ゲル 作 製 用 保 存 液 A~Dを 調 製 します 保 存 液 A~Cは4 で 約 1 ヶ 月 保 存 可 能 です 混 合 表 を 参 考 にしてビーカーなどに 保 存 液 を 分 注 し 希 望 の 濃 度 のゲル 溶 液 を 作 製 します 組 上 げたプレート(AE-6401など)に 分 離 ゲル 溶 液 注 入 固 化 濃 縮 ゲ ル 溶 液 注 入 固 化 の 順 にゲルを 作 製 します 作 製 したゲルは 冷 蔵 で2,3 日 保 存 できますが なるべく 早 く 使 用 してください 室 温 室 温 ゲル 作 製 用 保 存 液 組 成 表 種 類 組 成 保 存 ゲル 作 製 保 存 溶 液 A 29.2%(w/v)アクリルアミド アクリルアミド 溶 液 0.8%(w/v)ビスアクリルアミド 冷 蔵 ゲル 作 製 保 存 溶 液 B 分 離 ゲル 用 バッファー 1.5M トリス 塩 酸 (ph8.8) 0.4%(w/v)SDS 冷 蔵 ゲル 作 製 保 存 溶 液 C 濃 縮 ゲル 用 バッファー 0.5M トリス 塩 酸 (ph6.8) 0.4%(w/v)SDS 冷 蔵 ゲル 作 製 保 存 溶 液 D 10%ペルオキソ 二 硫 酸 アンモニウム 要 時 調 製 アトーミニスラブゲル(8.5 9cm 1mm 厚 )2 枚 用 試 薬 混 合 表 分 離 ゲル 濃 縮 ゲル T%ゲル 濃 度 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 20% 4.5% A (ml) B (ml) C (ml) D (ml) TEMED(mL) 蒸 留 水 (ml) 合 計 (ml) 分 離 ゲル コウム 濃 縮 ゲル スペーサー シール ガスケット プレート スマイリングの 防 止 のために スマイリングは プレートとスペーサーの 間 に 薄 いゲルの 膜 ができてしまうと 電 気 が 横 方 向 にリークし 末 広 がりのパ ターンになる 原 因 になります クリップでスペーサー 部 分 を しっかり 押 さえてください 気 泡 抜 きのため スペーサーの 下 両 端 にゲルができます 泳 動 先 端 がここに 到 達 すると 電 気 は 扇 状 に 広 がって 流 れるた め 下 端 がスマイリングします BPB( 泳 動 用 色 素 )がゲル 先 端 の 少 し 上 まで 来 たら 泳 動 を 止 めてください 注 意!!プレートとスペーサーの 間 に 薄 いゲルの 膜 ができると 泳 動 パター ンが 末 広 がりになります クリップ でしっかり 抑 えましょう 注 意!! 泳 動 時 間 が 長 いと 先 端 が ゲルの 端 から 扇 状 に 広 がります 4

5 1. 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) 1サンプル 調 製 タンパク 質 の 分 解 不 純 物 の 混 在 などに 注 意 タンパク 質 の 分 解 や 糖 鎖 の 分 解 はバンドの 分 離 パターンに 影 響 し バンドの 計 測 が 困 難 となります サンプルの 抽 出 方 法 保 存 方 法 な どによりタンパク 質 の 分 解 変 性 が 起 こることがある 為 これらを 最 小 限 に 留 める 事 を 考 慮 した 実 験 方 法 をご 検 討 ください 抽 出 サ ンプルの 脱 塩 や 精 製 が 不 十 分 な 場 合 もパターンが 乱 れる 原 因 となります 遠 心 ろ 過 などによる 不 純 物 の 除 去 などもご 検 討 ください タンパク 質 抽 出 にはアトータンパク 質 抽 出 キットのご 使 用 をお 勧 めします 詳 細 はお 問 い 合 わせください タンパク 質 抽 出 試 薬 コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 WSE-7420 EzRIPA Lysis kit( 全 タンパク 質 抽 出 キット 動 物 細 胞 用 ) 9, サンプル 用 WSE-7430 EzSubcell Extract(オルガネラ 分 画 キット 動 物 細 胞 用 ) \38,000 50サンプル 用 WSE-7440 EzSubcell Fraction(オルガネラ 抽 出 キット 動 物 細 胞 用 ) \38,000 50サンプル 用 2ゲル バッファーの 調 製 ゲル 濃 度 の 最 適 化 古 い 試 薬 は 使 わないように 注 意 目 的 タンパク 質 のバンドがシャープであるほど 検 出 後 の 解 析 がしやすくなります 適 正 なゲル 濃 度 を 決 めるため 予 備 実 験 をする ことをお 勧 めします 古 くなったゲル 調 製 用 保 存 用 液 やバッファーを 使 用 するとパターンが 乱 れる 場 合 があります ゲルやバッファーなどは 市 販 の 製 品 (アトー 社 製 プレキャストゲル 電 気 泳 動 用 試 薬 )の 使 用 をお 勧 めします 電 気 泳 動 用 試 薬 コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 AE-1410 EzRun(SDS-PAGE 用 電 気 泳 動 バッファー) 4,800 10L 用 / 粉 末 AE-1412 EzRun C+( 高 分 離 SDS-PAGE 用 電 気 泳 動 バッファー) \12, mL 用 10 袋 AE-1415 EzRun T( 低 分 子 量 SDS-PAGE 用 電 気 泳 動 バッファー) \9,800 50サンプル 用 AE-1430 EzApply(SDS-PAEG 用 サンプル 処 理 溶 液 キット) \6,800 5mL 5 回 分 プレキャストゲルの 分 画 分 子 量 範 囲 ゲル 濃 度 ミニスラブ 14 検 体 ミニスラブ 18 検 体 コンパクトスラブ 12 検 体 分 画 分 子 量 範 囲 7.5% E-T7.5L E-R7.5L C7.5L 35~400kDa 10% E-T10L E-R10L C10L 25~300kDa 12.5% E-T12.5L E-R12.5L C12.5L 10~250kDa 15% E-T15L E-R15L C15L 5~200kDa 5-20% E-T520L E-R520L C520L 5~400kDa 10-20% E-T1020L E-R1020L - 5~300kDa 15% 低 分 子 E-T15S E-R15S C15S 1~100kDa ミニスラブ 用 電 気 泳 動 装 置 :AE-6530 AE-6500 WSE-1100など( 詳 細 はお 問 い 合 わせください) コンパクトスラブ 用 電 気 泳 動 装 置 :AE-7350 WSE-1020など( 詳 細 はお 問 い 合 わせください) 注 意 点 お 勧 めの 手 法 プレキャストゲル(ミニゲル 用 ) コードNo. 製 品 名 ゲル 濃 度 検 体 数 価 格 容 量 E-T7.5L 7.5% 14 検 体 13, 枚 E-T10L 10% 14 検 体 13, 枚 E-T12.5L 12.5% 14 検 体 13, 枚 E-T15L 15% 14 検 体 13, 枚 E-T520L 5-20% 14 検 体 13, 枚 E-T1020L 10-20% 14 検 体 13, 枚 E-T15S 15% 14 検 体 18, 枚 定 分 子 量 用 e-pagel(ae-1415をご 使 用 ください) プレキャストゲル(ミニゲル 用 ) コードNo. 製 品 名 ゲル 濃 度 検 体 数 価 格 容 量 E-R7.5L 7.5% 18 検 体 13, 枚 E-R10L 10% 18 検 体 13, 枚 E-R12.5L 12.5% 18 検 体 13, 枚 E-R15L 15% 18 検 体 13, 枚 E-R520L 5-20% 18 検 体 13, 枚 E-R1020L 10-20% 18 検 体 13, 枚 E-R15S 15% 18 検 体 18, 枚 定 分 子 量 用 e-pagel(ae-1415をご 使 用 ください) プレキャストゲル(コンパクトゲル 用 ) コードNo. 製 品 名 ゲル 濃 度 検 体 数 価 格 容 量 C7.5L 7.5% 12 検 体 17, 枚 C10L 10% 12 検 体 17, 枚 C12.5L 12.5% 12 検 体 17, 枚 C15L 15% 12 検 体 17, 枚 C520L 5-20% 12 検 体 19, 枚 C15S 15% 12 検 体 19, 枚 定 分 子 量 用 c-pagel(ae-1415をご 使 用 ください) ゲルの 仕 様 仕 様 ミニスラブ 14 検 体 ミニスラブ 18 検 体 コンパクト 12 検 体 プレートサイズ mm mm 76 70mm ゲルサイズ 90 83mm 90 83mm 60 60mm ゲル 厚 み 1mm 1mm 0.75mm サンプル 数 14 検 体 18 検 体 12 検 体 アプライ 量 24μL 15μL 8μL ウエル 幅 4.2mm 2.9mm 2.9mm 5

6 1.SDS-PAGE 実 験 手 順 1. 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) SDS-PAGE 3 電 気 泳 動 用 試 料 調 製 と 泳 動 準 備 SDS 処 理 液 と 試 料 溶 液 を 混 合 してサンプル 溶 液 を 調 製 します SDS 処 理 液 は 出 来 るだけ 新 しいものを 使 用 してください 100 1~5 分 間 煮 沸 して 泳 動 用 サンプルとします 種 類 組 成 0.5Mトリス 塩 酸 (ph6.8) 1%SDS 20%グリセリン SDS 処 理 液 1% 2-メルカプトエタノール(BPB 色 素 添 加 ) AE-1430 EzApply(SDS 処 理 液 高 分 離 タイプ) WSE-2610 MyMini Block 小 型 ブロックインキュベータ ホルダーにゲルプレートをセットします 泳 動 槽 に 泳 動 バッファーを 注 ぎ ホルダーを 泳 動 槽 にセットします 上 部 槽 に 泳 動 バッファーを 注 ぎます ( 写 真 はAE-6530 ラピダス ミニスラブ 電 気 泳 動 槽 ) 気 泡 やごみ 上 部 槽 は 下 部 槽 を 傾 けて 入 れると ゲルの 下 部 に 気 泡 が 入 りにくくなります ウエルの 気 泡 はピペット 等 で 洗 浄 するように 取 り 除 きます 4サンプル 溶 液 の 注 入 サンプル 溶 液 は ウェルにゆっくり 注 入 します サンプル 容 量 は 均 一 にします (ウェル 毎 の 電 流 量 を 揃 えるため) 5 電 気 泳 動 SDS-PAGE 泳 動 槽 のリード 線 付 き 蓋 を 装 着 し リード 線 を 電 源 装 置 に 接 続 します 使 用 する 泳 動 槽 に 適 した 泳 動 条 件 ( 時 間 / 電 流 / 電 圧 )を 設 定 し 電 気 泳 動 を 開 始 します ( 通 常 ゲル1 枚 /20-30mA 定 電 流 スタート 時 の 電 圧 は80-120V 程 度 :AE-6530 型 の 場 合 ) 電 気 泳 動 を 開 始 後 ブロッティング ブロッキング 抗 体 反 応 などの 準 備 を 行 います ブロッティングなどの 準 備 はpage 8 以 降 を 参 照 ください は 泳 動 中 のBPBの 位 置 左 から 開 始 直 後 約 20 分 後 終 了 直 前 6 電 気 泳 動 終 了 ウエスタンブロッティングへ 60~90 分 後 BPB( 泳 動 用 色 素 )がゲル 下 端 近 くに 来 たら 電 気 泳 動 終 了 します ただちにブロッティング 操 作 2へ 進 みます(page 8) 6

7 1.SDS-PAGEのポイント 1. 電 気 泳 動 (SDS-PAGE) 3 電 気 泳 動 用 サンプルの 調 製 と 泳 動 準 備 SDS 処 理 液 によって 検 出 されるバンドのシャープさが 変 わります 一 般 的 なSDS 処 理 液 は タンパク 質 の 還 元 剤 として 2-メルカプトエタノール を 使 用 します タンパク 質 のS-S 結 合 が 多 かった り タンパク 質 濃 度 が 高 い 場 合 還 元 が 不 十 分 でバンドが 太 くなったり スメアになったりします AE-1430 EzApplyでSDS 処 理 を 行 うと バンドがシャープになります 合 わせてAE-1412 EzRun C+を 使 うと 更 にシャープなバンドが 得 られます 電 気 泳 動 用 試 薬 コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 AE-1430 EzApply(SDS-PAEG 用 サンプル 処 理 溶 液 キット) \6,800 5mL 5 回 分 AE-1412 EzRun C+( 高 分 離 SDS-PAGE 用 電 気 泳 動 バッファー) \12, mL 用 10 袋 AE-1450 EzStandard PrestainBlue( 有 色 分 子 量 マーカー)114~17.4kDa \14, μL WSE-7020 EzProtein Ladder( 有 色 分 子 量 マーカー)245~5kDa 13 本 \20, μL 2 本 膜 上 の 有 色 分 子 量 マーカーは アトー 社 製 ケミルミ 撮 影 装 置 で 検 出 した 場 合 発 光 パターンと 重 ね 合 わせが 可 能 です 有 色 マーカーや タグ 付 きマーカーは プレキャストゲルで 使 用 すると 泳 動 パターンが 乱 れることがあります 分 子 量 マーカーを 一 緒 に 光 らせる 場 合 は ビオチン 標 識 分 子 量 マーカーなどを 使 用 します( 下 表 参 照 /2013 年 1 月 現 在 ) 販 売 元 名 称 ロシュアプライド サイエンス ウエスタンブロッティン グ 分 子 量 マーカーセット 4サンプル 溶 液 の 注 入 GEヘルスケア ジャパン ECL DualVue Western Blotting Markers サーモフィッシャー サイエンティフィック SuperSignal Molecular Weight Protein Ladder バイオラッド ラボラトリーズ プレシジョン Plus プロ テイン WesternC ス タンダード 梱 包 50 回 分 25 回 分 50 回 分 50 回 分 400μL 分 子 量 (kda) 10/20/30/45/75/100 15/25/35/50/75/100/ /30/40/50/60/80/ 100/150 10/15/20/25/37/50/ 75/100/150/250 ナカライテスク タンパク 質 マーカー(ビ オチン 標 識 ) 6.5/14.4/21.5/30/45/ 66.2/116.25/200 標 識 HAタグ S-タグ IgG 結 合 サイト Strepタグ ビオチン 2 次 抗 体 anti-ha-pod S-Protein-HRP anti-igg-hrp StrepTactin-HRP ビオチン 化 HRP 上 表 中 の 試 薬 についての 詳 細 は 販 売 元 メーカーへお 問 い 合 わせください 注 入 の 仕 方 でパターンが 乱 れたり バンドの 濃 さが 変 わります サンプル 注 入 の 仕 方 によって バンドパターンが 乱 れることがあります 勢 い 良 く 注 入 したり 容 量 が 多 いとバンドの 両 端 が 膨 らんだパターン(ひょうたん 型 )になることがあります サンプルウェルの 壁 が 曲 がっているとバンドパターンが 乱 れる 場 合 があります 注 入 するサンプル 容 量 を 同 じにします サンプルがないレーンにはLoading bufferを 注 入 します サンプル 容 量 を 同 じにすると レーンごとの 電 流 量 のばらつきが 小 さくなりパターンの 歪 みを 防 ぎます 検 出 時 のバンドの 濃 さは サンプル 溶 液 の 濃 度 が 同 じ 場 合 で 比 較 すると 濃 縮 率 (サンプルウエル 中 の 試 料 溶 液 の 深 さと 泳 動 分 離 したときのバンドの 厚 みの 比 )が 大 きいほど 高 くなります( 下 図 参 照 ) 注 意 点 お 勧 めの 手 法 ウェル 幅 5mm 3mm 1.5mm ウェル 幅 5mm アプライ 量 が 同 じ 場 合 ウェル 幅 が 狭 いほうがバンドが 濃 く 検 出 されます (TOTALタンパク 量 は 同 じです) 3mm 1.5mm サンプル 溶 液 の 深 さが 同 じ 場 合 ウェル 幅 が 違 っても バンドの 濃 さは 同 じくらいになります (TOTALタンパク 量 は 異 なります ) 5 電 気 泳 動 SDS-PAGE いつも 同 じ 条 件 での 電 気 泳 動 を 心 がけましょう 分 離 パターンは 泳 動 時 の 電 流 電 圧 温 度 などによって 変 化 します 泳 動 用 バッファーやゲルの 作 製 ロットが 異 なると 微 妙 に 変 化 することがあります 各 サンプルに 適 正 な 泳 動 条 件 は ゲルの 濃 度 も 含 めてそれぞれの 実 験 系 で 異 なるので 予 備 実 験 で 確 立 することが 重 要 です 大 電 流 高 電 圧 長 時 間 泳 動 などによるバッファーの 加 熱 電 気 分 解 などが 原 因 で 泳 動 パターンが 乱 れることがあります アトーAE-6510 型 レゾルマックス2 連 ミニスラブ 電 気 泳 動 槽 を 使 うと 恒 温 電 気 泳 動 が 可 能 です 試 料 溶 液 中 に 含 まれる 目 的 タンパク 質 の 量 が 少 ない 場 合 サンプル 添 加 量 が 同 じならば 1ウエル 幅 (レーン 幅 )を 細 くする 2ゆっくり 泳 動 する(ミニゲルは20mA/ 枚 ) 等 の 方 法 で バンドを 濃 くシャープに 改 善 できます(タンパク 質 の 密 度 が 向 上 単 位 体 積 あたりのタンパク 量 が 増 加 ) スラブゲル ミニスラブ ミニスラブ コンパクトスラブと 泳 動 槽 を 変 え ゲルサイズを 小 さくしても 同 様 の 効 果 があります 6 電 気 泳 動 終 了 ウエスタンブロッティングへ ウエスタンブロッティング 操 作 2へ ゲルを 転 写 バッファーに 浸 す (page 8) 7

8 2.ウエスタンブロッティング(Western Blotting) Western Blotting 1ウエスタンブロッティングの 準 備 ブロッティング 試 薬 の 調 製 セミドライブロッティング 溶 液 を3 種 類 を 調 製 します ph 調 整 は 必 要 はありません メタノール 濃 度 はセミドライブロッティングに 合 わせて5%です (タンク 式 では20% 程 度 ) ミニゲル2 枚 をブロッティングするのにA~C 溶 液 をそれぞれ100mL 調 製 します 種 類 組 成 保 存 3 液 タイプ A:300mMトリス 5%メタノール B:25mMトリス 5%メタノール C:25mMトリス 40mM6-アミノカプロン 酸 5%メタノール 室 温 3 液 タイプ( 市 販 ) AE-1460 EzBlot ( 使 用 前 に 終 濃 度 5%メタノールを 添 加 ) 20 回 分 室 温 高 速 転 写 ( 市 販 ) AE-1465 EzFastBlot ( 使 用 前 に 蒸 留 水 で10 倍 希 釈 ) 室 温 ブロッティングメンブレンとろ 紙 の 準 備 試 薬 を 秤 り 蒸 留 水 に 溶 解 しメタノールを5%(v/v)にな るように 加 えます (A,B,C 溶 液 ) メンブレンとろ 紙 はゲルと 同 じ 大 きさのもの (ゲルサイズ±5mm 以 下 ) を 用 意 します ゲル1 枚 当 たり PVDF 膜 1 枚 ろ 紙 ( 厚 み0.9mm) 6 枚 ( 標 準 ) 注 :アトーのスラブ/ミニスラブ/コンパクトPAGEには ゲルと 同 じサイズのメンブレン ろ 紙 が 用 意 されていま す 製 品 情 報 は 右 ページを 参 照 ください メンブレンの 湿 潤 化 メンブレン(PVDF 膜 )は100%メタノールに 浸 漬 後 ブロッティングB 液 (3 液 タイプ)または EzFastBlotに 浸 し 振 とうしながら15 分 以 上 インキュベーションし 馴 染 ませます PVDF 膜 を 端 からゆっくり100%メタノールに 浸 す 湿 潤 すればよいので 時 間 は 数 秒 でかまいません ブロッティングB 液 (3 液 系 )または EzFastBlotに 浸 し 15 分 以 上 振 とう して 馴 染 ませます ろ 紙 の 湿 潤 化 3 液 系 の 場 合 A:2 枚 B:1 枚 C:3 枚 を 転 写 バッファーに 浸 します EzFastBlotを 使 用 する 場 合 は 全 てのろ 紙 を 浸 します 2 電 気 泳 動 終 了 ゲルの 取 り 出 し 泳 動 終 了 したゲルをプレートから 外 し B 溶 液 を 入 れたバットに 浸 漬 します 転 写 バッファーを 吸 ってゲルの 大 きさが 変 わる 事 があるため 15 分 未 満 にしてください EzFastBlotを 使 用 する 場 合 はバッファーに 漬 けずに 積 層 作 業 に 進 みます 8

9 2.ウエスタンブロッティング(Western Blotting) セミドライブロッティング 法 タンパク 質 のブロッティング 方 法 にはセミドライ 式 とタンク(ウエ ット) 式 の2 種 類 があります 現 在 よく 用 いられているセミドライ ブロッティング 法 は 発 熱 量 が 少 ない ブロッティング 時 間 が 短 い バッファー 量 が 少 ないという 特 徴 があります 高 分 子 量 のブ ロッティングが 苦 手 という 弱 点 がありましたが アトーAE-1460 EzBlot(3 液 系 )やAE-1465 EzFastBlotなどの 専 用 バッファーの 登 場 により250kDaくらいまでの 転 写 が 可 能 になっています しかし 塩 基 性 タンパク 質 や250kDaを 超 えるタンパク 質 の 転 写 に はタンク(ウエット) 式 が 用 いられています それぞれに 特 徴 が あるため サンプルの 性 質 やサイズによってブロッティング 方 法 を 選 択 ください セミドライ 式 発 熱 量 : 少 ない 時 間 : 短 い バッファー 量 : 少 ない 低 ~250kDaタンパク 質 1ウエスタンブロッティングの 準 備 ウエスタンブロット 用 メンブレン ウエスタンブロット 用 メンブレンにはニトロセルロース 製 PVDF 製 のものがあります タンク(ウエット) 式 発 熱 量 : 多 い 時 間 : 長 い バッファー 量 : 多 い 高 分 子 塩 基 性 タンパク 質 セミドライブロッティング 用 試 薬 コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 AE-1460 EzBlot(A:475mL/B475mL 2 本 /C:475mL/ディスポトレイ40 枚 ) \12,000 ミニゲル 20 回 分 AE-1465 EzFastBlot(10 倍 濃 縮 液 :500mL) \9,000 ミニゲル 50 回 分 AE-1460は 使 用 前 にA B Cに25mLずつメタノールを 加 え 終 濃 度 5%として 使 用 します AE-1465はメタノールを 使 用 しません 高 速 ブロッティングに 対 応 します PVDFメンブレンはタンパク 質 の 吸 着 能 が 高 く 高 感 度 検 出 に 向 いています 適 正 なブロッキング 抗 体 反 応 を 行 えば 高 感 度 発 光 基 質 を 使 用 してもバックグラウンドを 低 く 抑 えることが 可 能 です アトー クリアブロット P+ 膜 は 材 質 に 低 バックグラウンドPVDFを 使 用 し ゲルサイズにカットされています セミドライブロッティング 用 メンブレン コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 WSE-4050 クリアブロット P+ 膜 cm \16, 枚 WSE-4051 クリアブロット P+ 膜 cm \16, 枚 WSE-4052 クリアブロット P+ 膜 13 14cm \18, 枚 WSE-4053 クリアブロット P+ 膜 26cm 3m \58,000 1ロール ウエスタンブロット 用 ろ 紙 ウエスタンブロット 用 ろ 紙 はバッファーを 保 持 するため 厚 みがあるものが 適 しています アトーアブソーベントペーパー(ブロッティング 用 ろ 紙 )は 厚 み0.9mmでしっかりバッファーを 保 持 します セミドライブロッティング 用 メンブレン コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 CB-06Aアブソーベントペーパー(ブロッティング 用 ろ 紙 ) cm \18, 枚 CB-09Aアブソーベントペーパー(ブロッティング 用 ろ 紙 ) cm \19, 枚 CB-13Aアブソーベントペーパー(ブロッティング 用 ろ 紙 ) 13 14cm \15, 枚 CB-20Aアブソーベントペーパー(ブロッティング 用 ろ 紙 ) 20 20cm \11, 枚 注 意 点 お 勧 めの 手 法 2.ウエスタンブロッティングにおける 注 意 点 メンブレンとろ 紙 のサイズ メンブレンとろ 紙 は ゲルサイズと 同 じ 大 きさのものを 使 用 します サイズが 異 なるとバンドが 流 れてしまうことがあります アトーのブロッティング 用 メンブレンとろ 紙 は アトー 製 ゲルと 同 じ サイズのものが 販 売 されています メンブレン ろ 紙 のサイズは ゲルサイズ±5mm 以 内 になるようご 用 意 ください サイズピッタリ 大 きいサイズ ろ 紙 がゲルよりも 大 きいと 端 のレーンが 外 に 流 れて しまうことがあります 2 電 気 泳 動 終 了 ゲルの 取 り 出 し 吸 水 してゲルが 膨 らみサイズが 変 わるため ゲルをバッファーに 漬 けておく 時 間 は 短 くします EzFastBlotを 使 用 する 場 合 はゲルはバッファーに 漬 けず 積 層 前 にバッファーをくぐらせる 程 度 にします 9

10 2.ウエスタンブロッティング(Western Blotting) Western Blotting 3ろ 紙 メンブレン ゲルの 積 層 ブロッティング 装 置 の 陽 極 (+) 板 の 上 に 試 薬 の 種 類 により(3 液 系 /1 液 系 )それぞれ 転 写 バ ッファーをしみこませたろ 紙 と 湿 潤 したメンブレン ゲルを 重 ねていきます ろ 紙 は1 枚 ずつ 十 分 バッファーで 湿 らせたものを 気 泡 が 入 らないよう 重 ねます メンブレンを 置 いたら 転 写 バッファーを 少 し 垂 らし その 上 にゲルを 置 きます 気 泡 が 入 りにくくなり 一 瞬 ゲルが 浮 いているので 位 置 の 微 調 整 が 可 能 です 全 て 重 ねたら グローブをはめた 手 で 全 体 を 押 しつぶすように 均 等 に 抑 えます バッファーが 浸 み 出 しますが 気 泡 が 抜 け 全 体 の 密 着 度 が 上 がります 2 枚 以 上 のゲルを 同 時 にブロッティングするには 厚 みをそろえ 並 べてセットします 電 極 板 からはみ 出 すようなら 余 分 な 部 分 をあらかじめ 切 り 取 ります 通 電 条 件 : 標 準 的 には ゲルの 面 積 1cm 2 あたり2mAで30 分 通 電 します 10 10cmのゲルなら =200mA 定 電 流 設 定 の 場 合 電 流 は 一 定 ですが 電 圧 は 時 間 とともに 変 動 します EzBlotやEzFastBlotを 使 ってセミドライブロッティングをする 場 合 は 下 表 を 参 照 ください 3 液 系 /EzBlot EzFastBlot( 標 準 ) EzFastBlot( 高 速 ) 電 流 ( 単 位 面 積 ) 8.5 9cmゲル1 枚 の 設 定 値 C 溶 液 ろ 紙 3 枚 B 溶 液 ゲル 膜 ろ 紙 A 溶 液 ろ 紙 2 枚 3 液 系 (EzBlot)の 積 層 方 法 EzFastBlotの 積 層 方 法 4ブロッティング 転 写 開 始 2mA/cm 2 c.c 153mA c.c 2mA/cm 2 c.c 153mA c.c EzFastBlot ゲル 膜 ろ 紙 6mA/cm 2 c.c 459mA c.c 転 写 時 間 ( 標 準 ) 30 分 30 分 10 分 電 圧 ( 変 動 します) 15~30V 10~20V 20~50V ブロッティングは 電 圧 が 低 く 電 流 が 高 い 条 件 なので ブロッティングに 対 応 した 電 源 装 置 をご 使 用 ください ブロッティング 装 置 によって マニュアルに 定 電 圧 で 使 用 するよう 記 載 されたものもありま す 定 電 圧 設 定 でもブロッティング 可 能 です 5ブロッティング 終 了 メンブレン 取 り 出 し ブロッティングが 終 了 したら メンブレンを 取 りだし タッパーなどでTBS-TまたはPBS-Tで 浸 透 しながら3~5 分 洗 浄 します ブロッキングへ 一 時 的 に 実 験 を 中 断 する 場 合 は メンブレンをラップなどで 包 み 冷 蔵 庫 で 保 存 します 一 晩 程 度 は 保 存 が 可 能 です 一 日 以 上 保 存 したい 場 合 は 風 乾 してメンブレンを 乾 燥 させます 乾 燥 後 ラップなどで 包 み 冷 蔵 庫 で 保 存 します 保 存 した 場 合 サンプルによってはブロッティング 後 すぐに 検 出 した 場 合 よりシグナルが 弱 くなることがあります 10

11 2.ウエスタンブロッティング(Western Blotting) 3ろ 紙 メンブレン ゲルの 積 層 ろ 紙 メンブレンの 準 備 積 層 前 の 湿 潤 作 業 を 十 分 行 います メンブレンが 転 写 バッファーに 十 分 に 馴 染 むよう15 分 以 上 振 とうします ろ 紙 およびメンブレンはゲルサイズ±5mmの 大 きさのものを 使 用 します セミドライ 式 ブロッティングでは ブロッティング 溶 液 のメタノール 濃 度 を5% 程 度 にします メタノール 濃 度 を 高 くすると ゲルが 脱 水 されて 縮 み 特 に 高 分 子 側 の 転 写 効 率 が 悪 くなります 低 分 子 量 のタンパク 質 を 転 写 する 場 合 は5~10%にメタノール 濃 度 を 上 げると 裏 抜 けを 低 減 できます なるべく 小 さいゲルを 使 用 します 転 写 面 積 が 小 さいほうが 均 一 に 転 写 されムラになりくくなります 積 層 時 に 気 泡 が 入 らないよう ろ 紙 やメンブレン ゲルは 端 を 合 わせてから 弓 なりに 反 らせながら 重 ねます 積 層 後 メンブレンとゲルの 密 着 度 を 上 げます ろ 紙 メンブレン ゲルを 積 層 し 終 わったら グローブを 着 用 した 手 のひらで 全 体 を 押 しつぶすように 圧 着 します 中 心 外 側 の 順 番 に 圧 をかけます 気 泡 が 抜 け 密 着 度 が 上 がり 転 写 効 率 が 向 上 します 手 で 圧 をかける 代 わりに 専 用 のブロッティング 用 ローラー(No /\3,000)を 使 用 しても 同 様 の 効 果 があります 4ブロッティング 転 写 開 始 お 勧 めのセミドライブロッティング 装 置 アトーホライズブロットシリーズは 陽 極 : 白 金 チタン 製 / 陰 極 :ステンレス 製 で 電 極 板 をバネ 圧 でろ 紙 を 圧 着 します アトーパワードブロットOneは 電 源 搭 載 型 のブロッティング 装 置 です 仕 様 WSE-4115 パワードブロットAce WSE-4020 ホライズブロット2M-R WSE-4040 ホライズブロット4M-R 電 極 サイズ 98 95mm mm mm 電 極 間 距 離 3~10mm(バネで 押 圧 ) 3~15mm(バネで 押 圧 ) 3~15mm(バネで 押 圧 ) 電 源 搭 載 別 売 別 売 製 品 姿 専 用 のブロッティング 用 ローラー(No /\3,000) を 使 用 して 均 一 に 圧 をかけながら 気 泡 を 抜 きます 押 さえる 位 置 は5 箇 所 が 基 本 です 番 号 順 に 手 のひらで 押 してください ピペットでころころする 方 法 は 均 一 に 力 を 入 れることが 難 しく 厚 みにムラができるた め お 勧 めできません しっかりゲルとメンブレンを 圧 着 することで 転 写 ム ラや 気 泡 を 防 ぐことができます 注 意 点 お 勧 めの 手 法 2.ウエスタンブロッティングにおける 注 意 点 WSE-4020/4040に 使 用 できる 電 源 についてはアトー 株 式 会 社 までお 問 い 合 わせください 5ブロッティング 終 了 メンブレン 取 り 出 し ブロッティングに 続 いてブロッキングへ 進 む 場 合 はメンブレンを 乾 燥 させないでください 一 晩 程 度 の 保 存 の 場 合 はラップで 包 み 乾 燥 させないようTBSなどで 湿 らせて 冷 蔵 庫 で 保 存 します 1 日 以 上 保 存 する 場 合 は 洗 浄 後 乾 燥 させ ラップなどで 包 み 冷 蔵 庫 で 保 存 します ブロッキングを 始 めるときは 100%メタノ ールで 湿 潤 したのち TBS-TまたはPBS-Tに 浸 して15 分 以 上 振 とうして 馴 染 ませます 保 存 期 間 が 長 くなると 検 出 感 度 が 低 下 します サンプルによっては 乾 燥 保 存 で 抗 原 性 が 低 下 する 場 合 があります 11

12 3.ブロッキング(Blocking) Blocking 1ブロッキング 準 備 試 薬 調 製 TBS-Tの 調 製 TBS-Tは 全 ての 反 応 溶 液 の 基 礎 になります 組 成 phを 正 確 に 調 製 することが 重 要 で す TBS-Tは 室 温 で 保 存 できますが なるべく 新 しいものを 使 用 してください ブロッキング 溶 液 の 調 製 スキムミルク0.3gを100mLのTBS-Tで 完 全 に 溶 解 します 電 子 レンジや 湯 せんで 暖 めると 完 全 に 溶 解 できます スキムミルクは 通 常 3~5%の 濃 度 で 記 載 されていますが タンパク 質 量 の 少 ないサンプルではブロッキングタンパク 質 が 多 い 場 合 に 検 出 できなくなることがあり ます( 右 ページオーバーブロッキング 参 照 ) オーバーブロックがなく 交 叉 の 無 い AE-1475 EzBlock Chemi なら 蒸 留 水 で 希 釈 するだ けで 簡 単 に 調 製 できます 試 薬 組 成 保 存 TBS-T ブロッキング 試 薬 25mMトリス 塩 酸 ph M NaCl 0.1%(v/v)Tween-20 AE-1480 EzWash(10 倍 濃 縮 TBS) 蒸 留 水 で10 倍 希 釈 し Tween-20を 加 え0.1%とします 0.3%スキムミルク/TBS-T TBS-T100mLあたり0.3gのスキムミルクを 加 え 溶 解 します 電 子 レンジを 使 用 するか 湯 せんで 完 全 に 溶 解 します 製 精 度 の 高 いスキムミルクの 場 合 は0.1% 程 度 まで 濃 度 を 下 げられます AE-1475 EzBlock Chemi(5 倍 濃 縮 ) EzBlock Chemiを 蒸 留 水 で5 倍 希 釈 しブロッキング 溶 液 とします 室 温 室 温 室 温 室 温 2メンブレンの 洗 浄 TBS-Tを 入 れたバットにメンブレンを 浸 し 2 分 間 洗 浄 します シェーカーの 振 とう 方 式 について :シーソー 式 水 平 式 : 回 転 式 抗 原 抗 体 反 応 に 用 いるシェーカーは シーソー 式 水 平 式 をお 勧 めします これらのシェーカーでは 膜 全 体 が 同 じよ うに 液 交 換 されるためムラができにくくなります しかし 回 転 式 はトレイ 中 央 部 分 の 液 交 換 が 不 十 分 になり 膜 の 中 央 部 分 のバックグラウンドが 高 くなる 原 因 となります 写 真 : シーソーシェーカーatto 抗 原 抗 体 反 応 にはシーソー 式 のシェ ーカーがお 勧 めです 3ブロッキング 洗 浄 用 TBS-Tとブロッキング 溶 液 (0.3%スキムミルク or EzBlock Chemi)を 交 換 します 室 温 にて60 分 間 ゆっくり 振 とうしながら ブロッキング します (オーバーナイトでブロッキングを 行 う 場 合 は4 で 行 います ) 4ブロッキング 終 了 抗 原 抗 体 反 応 へ ブロッキングが 終 了 したら 1 次 抗 体 反 応 へ 進 みます( 次 ページ) ブロッキング 後 のメンブレンは4 で 保 存 可 能 です 保 存 時 間 が 長 くなると 検 出 感 度 が 低 下 します 目 的 タンパク 質 の 量 が 少 ないと 考 えられる 場 合 は 間 をおかず すぐに 検 出 することをお 勧 めします 12

13 3.ブロッキング(Blocking) ブロッキングの 必 要 性 ウエスタンブロッティングにおけるブロッキングの 役 割 は メンブレン 上 のバンド 以 外 の バックグラウンドに 抗 体 が 付 着 しないよう 使 用 する 抗 体 と 反 応 しないタンパク 質 で 膜 のバ ックグラウンドを 埋 め 尽 くすことです ブロッキングが 不 十 分 だと 発 光 検 出 時 にバックグ ラウンドが 高 くなったり 目 的 タンパク 質 の 検 出 感 度 が 悪 くなったりします ブロッキングに 用 いるタンパク 質 使 用 する 抗 体 (1 次 2 次 ともに)と 結 合 しないタンパク 質 を 選 択 します 一 般 的 にはスキムミルク( 脂 質 を 取 り 除 いた 乳 性 タン パク 質 ) カゼイン BSA ゼラチンなどが 用 いられます アトーでは 交 叉 のほとんどない 非 タンパク 質 系 ブロック 剤 を 使 用 した EzBlock Chemi をお 勧 めしています 他 にBSAタイプ とカゼインタイプがあります いずれもバックグラウンドを 抑 え オーバーブロックしにくい 組 成 になっています コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 AE-1475 EzBlock Chemi (5 倍 濃 縮 非 タンパク 質 系 ) \9, mL AE-1476 EzBlock BSA (5 倍 濃 縮 BSA) \9, mL AE-1477 EzBlock CAS (5 倍 濃 縮 カゼイン) \9, mL 検 出 感 度 に 影 響 する オーバーブロッキング を 防 止 する バックグラウンドは 低 いが 濃 度 の 低 いバンドが 検 出 されない 場 合 ブロッキング 溶 液 が 原 因 と 考 えられます 原 因 :スキムミルク3~5%を 使 用 したため ブロッキングタンパク 質 で 目 的 バンドがオーバーブロックされてしまう 対 策 1:ブロッキング 溶 液 のスキムミルクの 濃 度 を0.3%にしてオーバーブロックを 防 ぎます 対 策 2:ブロッキング 溶 液 をATTO EzBlock Chemiに 変 更 してオーバーブロックを 防 ぎます スキムミルクの 濃 度 を 下 げる 場 合 TBS-TのTween-20 濃 度 を0.1%にします ( 一 般 的 には0.05%が 多 い) Tween-20の 濃 度 を0.1%とすることで 洗 浄 効 果 が 上 がり ブロッキング 効 率 も 向 上 します 低 バックグラウンドメンブレンの 使 用 をお 勧 めします page 9で 紹 介 しました クリアブロット P+ 膜 をご 利 用 ください 低 バック 高 感 度 が 特 長 です オーバーブロックのイメージ 図 注 意 点 お 勧 めの 手 法 通 常 のブロッキング 状 態 緑 のサンプル 以 外 のバックグラウンドをブロ ッキングタンパク 質 が 埋 め 尽 くします 目 的 のタンパク 質 を 検 出 できます オーバーブロッキング 状 態 低 濃 度 の 場 合 サンプルまでもブロッキング タンパク 質 が 覆 い 尽 くしています 抗 体 が 結 合 せず 目 的 のタンパク 質 を 検 出 できません 発 色 法 EzWestBlue(TMB)などから 発 光 検 出 へ 移 行 する 場 合 発 光 基 質 の 選 択 と 注 意 点 発 色 法 による 検 出 に 比 べて 発 光 検 出 は 感 度 が 向 上 します 同 時 にバックグラウンドも 上 昇 するため 注 意 が 必 要 です 対 策 1:ATTO EzWest Lumi など 発 光 が 強 すぎない 基 質 を 使 用 する バックグラウンド 上 昇 を 防 ぎます 対 策 2:2 次 抗 体 の 濃 度 を 下 げます 例 発 色 で5,000 倍 希 釈 発 光 で50,000 倍 希 釈 とするなど ブロッキングの 条 件 ブロッキングは 通 常 室 温 で1 時 間 振 とうしながら 行 います 振 とうは 大 きい 振 り 幅 の 水 平 式 か ゆっくりとしたシーソー 式 が 適 しています 回 転 式 では 中 心 部 と 周 辺 部 でブロッキングや 抗 体 反 応 のムラの 原 因 となることがあります 高 感 度 検 出 ほど 問 題 になります コードNo. 製 品 名 価 格 振 とう 台 サイズ WSC-2400 シーソーシェーカーatto \98, mm WSC-2400 用 上 段 振 とう 台 \18, mm 13

14 4. 抗 原 抗 体 反 応 (Antibody) Antibody 1メンブレンの 洗 浄 ブロッキングが 終 了 したら タッパーにメンブレンを 入 れ 続 い てTBS-Tを 加 え 数 分 間 振 とうします 21 次 抗 体 溶 液 の 調 製 チューブを 軽 く 遠 心 し 上 清 から1 次 抗 体 を 分 注 し ブロッキン グ 溶 液 (0.3%スキムミルク/TBS-Tなど)で 希 釈 し 1 次 抗 体 溶 液 とします 希 釈 した1 次 抗 体 溶 液 は 保 存 が 利 きません 31 次 抗 体 反 応 写 真 :ATTO シーソーシェーカー 抗 原 抗 体 反 応 にはシーソー 式 のシェ ーカーがお 勧 めです TBS-Tを 捨 て 1 次 抗 体 溶 液 を 加 えます 室 温 で1 時 間 ゆっくり 振 とうします バックグラウンドのムラを 防 ぐため シーソー 式 または 水 平 式 のシェーカーを 使 用 します 溶 液 量 は 振 とうできるよう やや 多 め( 膜 が 浸 る 程 度 )とします 1 次 抗 体 溶 液 の 容 量 を 増 やすため 多 少 希 釈 率 が 高 くなります 2 次 抗 体 量 や 発 光 基 質 で 検 出 感 度 は 補 えます 使 用 できる 抗 体 量 に 合 わせて バッグに 入 れたり 静 置 したり 方 法 を 選 択 ください 振 とう 方 法 による 溶 液 の 動 きの 違 い メンブレン 溶 液 の 動 き 振 とう 台 シーソー 式 または 水 平 式 では メンブレン 全 体 を 溶 液 が 同 じように 動 きます このためムラを 防 ぐことが 可 能 です 回 転 式 の 場 合 外 側 は 溶 液 が 早 く 動 き 中 心 部 分 は 遅 く 動 きます スピードの 違 いでムラ が 発 生 します 4すすぎ 洗 浄 抗 体 溶 液 を 捨 て TBS-Tでメンブレンをすすぎます 3 回 繰 り 返 します すすぎをすることで 残 った 抗 体 の 濃 度 が 大 幅 に 下 がり 洗 浄 効 果 が 上 がります 新 しくTBS-Tを 加 え 5 分 間 振 とう 洗 浄 します 3 回 繰 り 返 します 52 次 抗 体 溶 液 の 調 製 チューブを 軽 く 遠 心 し 上 清 から2 次 抗 体 を 分 注 し ブロッキング 溶 液 (0.3%スキムミルク/ TBS-Tなど)で 希 釈 し 2 次 抗 体 溶 液 とします 希 釈 した2 次 抗 体 溶 液 は 保 存 が 利 きません 62 次 抗 体 反 応 TBS-Tを 捨 て 2 次 抗 体 溶 液 を 加 えます 室 温 で1 時 間 ゆっくり 振 とうします 溶 液 量 は 振 とうできるよう やや 多 め( 膜 が 浸 る 程 度 )とします 7すすぎ 洗 浄 抗 体 溶 液 を 捨 て TBS-Tでメンブレンをすすぎます 3 回 繰 り 返 します すすぎをすることで 残 った 抗 体 の 濃 度 が 大 幅 に 下 がり 洗 浄 効 果 が 上 がります 新 しくTBS-Tを 加 え 5 分 間 振 とうします 3 回 繰 り 返 します 8 発 光 撮 影 の 準 備 へ 14

15 4. 抗 原 抗 体 反 応 (Antibody) 抗 原 抗 体 反 応 について 1 次 抗 体 ターゲットタンパク 質 を 標 的 とする 抗 体 を 使 って メンブレン 上 のタン パク 質 の 中 から 目 的 とするものを 特 異 的 に 標 識 します 1 次 抗 体 には 大 きく 分 けてポリクローナル 抗 体 とモノクローナル 抗 体 の 2 種 類 があります モノクローナル 抗 体 は 特 異 性 が 高 く 検 出 時 のバンド 数 が 少 なく 容 易 にターゲットを 見 つけられます 抗 体 を 作 る 場 合 のコ ストが 高 くなります ポリクローナル 抗 体 は 検 出 時 のバンドが 多 くな りますが 比 較 的 低 コストで 作 製 できます 検 出 時 は 分 子 量 マーカーを 利 用 して 目 的 タンパク 質 のバンドを 推 定 する 必 要 があります 2 次 抗 体 2 次 抗 体 は 1 次 抗 体 を 標 的 とし HRP(ホースラディッシュペルオキ シダーゼ)やALP(アルカリフォスファダーゼ)などの 酵 素 で 標 識 した ものを 使 用 します 動 物 種 が 同 じなら 色 々な1 次 抗 体 に 対 応 します 使 用 する 濃 度 によって バックグラウンドや 検 出 感 度 に 大 きな 影 響 を 与 えます ウエスタンブロットの 撮 影 と 画 像 合 成 アトーのケミルミ 撮 影 装 置 は プレステインマーカーの 見 えるメンブレンと 発 光 パターンを 撮 影 し 合 成 することが 可 能 です ポリ クローナル 抗 体 を 利 用 する 場 合 など 分 子 量 情 報 が 必 要 な 検 出 では 以 下 のように 撮 影 した 画 像 を 解 析 します 1~7 抗 原 抗 体 反 応 の 注 意 点 検 出 イメージ 発 光 ( 青 色 ) HRP( 酵 素 ) 1 次 抗 体 2 次 抗 体 目 的 タンパク 質 発 光 基 質 + = 写 真 の 説 明 AE-9300H Ez-CaptureMGで 撮 影 し 解 析 ソフトCS Analyzerの 画 像 演 算 機 能 を 使 って 合 成 しまし た マーカーレーンを 使 って 分 子 量 計 測 が 可 能 です 抗 体 溶 液 は 室 温 に 戻 し 軽 く 遠 心 してから 上 清 を 分 注 します メンブレン 上 の 斑 点 状 のゴミを 防 止 できます 1 次 抗 体 溶 液 (1 次 抗 体 :100~1000 倍 希 釈 )はやや 多 めの 液 量 で 反 応 させるとムラが 出 にくくなります 1 次 抗 体 の 希 釈 率 を 上 げると 感 度 が 下 がるため 発 光 基 質 は 高 感 度 タイプ(EzWestLumi plusなど)を 使 用 します 2 次 抗 体 溶 液 (2 次 抗 体 : 数 千 ~ 数 万 倍 希 釈 )は 濃 度 が 低 い 方 がバックグラウンドが 低 くなります 特 に 高 感 度 な 発 光 基 質 (SuperSignal West Femt/イムノスターLD/ECL selectなど)を 使 う 場 合 は 2 次 抗 体 の 希 釈 率 を 数 万 ~ 数 十 万 倍 まで 上 げて 使 用 します 抗 体 濃 度 は 検 出 感 度 とバックグラウンドに 影 響 するため 予 備 実 験 を 行 い 慎 重 に 検 討 します バックグラウンドが 高 い 場 合 は 12 次 抗 体 濃 度 を 低 くする 2 抗 体 反 応 後 のすすぎを 徹 底 することで 改 善 できます TBS-T(PBS-T)に 加 えるTween-20は 0.1% 濃 度 とし 洗 浄 効 果 を 十 分 にします( 一 般 的 には0.05%が 多 い) 抗 体 反 応 後 の すすぎ 3 回 はバックグラウンド 低 減 に 効 果 的 です それから5 分 ~10 分 数 回 の 洗 浄 ステップを 行 います 洗 浄 ステップはなるべく 多 量 のTBS-Tを 使 用 し 強 く 振 とうします 抗 体 濃 度 のコントロールとその 容 量 洗 浄 操 作 を 改 善 することで 低 バックグラウンド 高 シグナルが 得 られます 抗 体 反 応 には 水 平 式 またはシーソー 式 のシェーカーを 使 用 するとムラを 防 止 できます 注 意 点 お 勧 めの 手 法 ケミルミ 検 出 に 見 られる 汚 れ メンブレン 端 のムラ 振 とうスピードの 速 すぎが 原 因 抗 体 溶 液 はゆっくり 全 体 に 浸 透 させる 振 とうスピードもゆっくり 目 にする バックのムラの 原 因 1 次 抗 体 溶 液 が 少 なく 静 置 して 反 応 した 抗 体 反 応 時 の 振 とう 不 足 すすぎをしなかった メンブレン 上 の 斑 点 2 次 抗 体 による 非 特 異 的 スポット 抗 体 溶 液 のチューブを 遠 心 して 防 止 2 次 抗 体 は 分 注 して 保 存 する 高 バックグラウンド 対 策 2 次 抗 体 を 更 に 希 釈 する 2 次 抗 体 溶 液 のボリュームアップ すすぎを3 回 以 上 行 う 15

16 5 発光基質添加と発光検出 Chemiluminescence Detection Chemiluminescence Detection ①発光撮影の準備 ケミルミ撮影装置 Ez-Capture MGなど を起動し 撮影準備をします 発光基質を室温に戻します クリアポケット ラップなどを用意します ②発光基質の調製 発光基質は室温に戻して使用します ATTO EzWestLumi plusは A B 1 1で混合します メンブレンの面積によって使用する試薬量を算出します 基準量 0.05mL/cm2 EzWestLumi plusの場合 8 9cmの膜 mLが使用量です 使用量は発光試薬に付属のマニュアルを参照してください WSE-7120S/L EzWestLumi plus HRP用発光基質で fg中域の検出感 度と広いダイナミックレンジが特長 です ケミルミ撮影装置での検出に 適しています ③メンブレンへ発光基質を添加 ①クリアポケットを開く クリアポケットを破かないように注意します 発光基質に浸す場合はラップやタッパーでもOKです ③転写面を下に メンブレンを発光基 質に浸します ⑥準備完了 撮影へ ②発光基質をクリアポケットに滴下します 池を作るイメージ ④数秒 数分インキュベーション 余分 ⑤新しいクリアポケットにメンブレン な発光基質をろ紙などに吸わせます を挟みます 気泡に注意 クリアポケットについて メンブレンのシーリングには ①透明である ②適度に張りがあり しわが寄らないこと ③安価で入手性が良いこと ④サイズが豊富なこと などの条件が要求されます 文具店などで手 軽に購入できる クリアポケット は全ての 条件を満たし 非常に便利に使用できます 16

17 5. 発 光 基 質 添 加 と 発 光 検 出 (Chemiluminescence Detection) 1 発 光 撮 影 の 準 備 化 学 発 光 撮 影 装 置 (アトーEz-Capture MGなど)は 冷 却 CCDカメラを 使 っており 使 用 前 にウォーミングアップが 必 要 です 装 置 によって5~30 分 ウォーミングアップを 行 います 2 発 光 基 質 の 調 製 発 光 基 質 は HRP (ペルオキシダーゼ) 用 と ALP(アルカリフォスファターゼ) 用 の2 種 類 があります 一 般 的 にウエスタンブロット ではHRP 用 がよく 利 用 され サザンブロット ノーザンブロットではALP 用 が 利 用 されます HRP 用 の 発 光 基 質 はGEヘルスケア 社 のECLが 有 名 で 古 くから 使 われています アトー EzWestLumiシリーズ をはじめ 各 社 から 多 くのHRP 用 発 光 基 質 が 発 売 されています コードNo. 製 品 名 価 格 容 量 WSE-7120S EzWestLumi plus(hrp 発 光 基 質 高 感 度 ) \8,800 50mL 2 本 WSE-7120L EzWestLumi plus(hrp 発 光 基 質 高 感 度 ) \28, mL 2 本 WSE-7110 EzWestLumiOne(HRP 用 発 光 基 質 スタンダード) \9, mL 1 本 EzWestLumi plus/lumioneは4 /1 年 間 保 存 可 能 です 超 高 感 度 検 出 が 必 要 な 場 合 のお 勧 め 発 光 基 質 ( 他 社 製 品 ) Thermo Fisher Scientific 社 :PIRCE SuperSignalWest Femto( 検 出 感 度 :fg 低 域 ) 和 光 純 薬 工 業 :イムノスターLD( 検 出 感 度 :fg 低 域 ) 超 高 感 度 発 光 基 質 を 使 用 する 場 合 は 2 次 抗 体 濃 度 を 低 くする 必 要 があります 予 備 実 験 で 至 適 濃 度 を 検 討 ください 発 光 基 質 の 種 類 によって バックグラウンドの 高 さが 異 なります 必 ずしもシグナル 強 度 と 比 例 しないため ブロッキングや2 次 抗 体 の 濃 度 など 至 適 条 件 を 検 討 してください 発 光 基 質 の 種 類 によって ダイナミックレンジ( 濃 度 と 発 光 量 に 比 例 関 係 がある 範 囲 )が 異 なります 発 光 が 弱 い 試 薬 はダイナ ミックレンジが 広 く 高 感 度 になるほどダイナミックレンジが 狭 くなります 3メンブレンへ 発 光 基 質 を 添 加 発 光 基 質 添 加 後 のトラブルシューティング バックグラウンドが 高 くなる ブロッキング 溶 液 抗 体 反 応 溶 液 洗 浄 液 全 てに0.1%Tween-20を 添 加 する メンブレンは 低 バックグラウンド 型 のPVDF 膜 へ 切 り 替 える WSE-4050/1/2/3 クリアブロット P+ 膜 2 次 抗 体 濃 度 を 低 くする 抗 体 反 応 後 すすぎを 行 ってから 洗 浄 操 作 を 行 う 検 出 感 度 が 高 い 発 光 基 質 を 使 っている 場 合 感 度 が 低 いものに 変 えてみる WSE-7110 EzWestLumiOne 注 意 点 お 勧 めの 手 法 ムラになってバックグラウンドが 光 る 2 次 抗 体 濃 度 を 低 くする 2 次 抗 体 をチューブごと 遠 心 してから 上 清 をそっと 分 注 して 使 用 する 抗 体 反 応 後 のすすぎと 洗 浄 を 十 分 行 う 回 転 式 のシェーカーを 使 用 すると 中 心 部 分 のバックが 高 くなります 水 平 式 かシーソー 式 のシェーカーを 使 用 してください 基 質 のかけ 方 でバックグラウンドがムラになる 発 光 基 質 をメンブレンに 直 接 かけると 発 光 ムラになることがあります ラップなどに 基 質 を 溜 めておき 転 写 面 を 下 にしたメ ンブレンを 浸 すとムラを 防 止 できます 気 泡 や 余 分 な 発 光 基 質 の 影 響 基 質 添 加 後 メンブレンをピンセットでつまみ 上 げ 端 から 垂 れる 余 分 な 基 質 をキムタオルなどに 吸 わせます メンブレンのシーリングはクリアポケットを 使 うと 気 泡 が 入 りにくくなります 過 剰 に 発 光 基 質 を 残 してシールすると バックグラウンドが 高 くなることがあります メンブレンをシーリングするもの クリアポケット: 張 りがありしわにならず 気 泡 が 入 りにくく 取 り 扱 いが 楽 低 コスト ハイブリバック: 厚 みがあり 折 癖 がつきやすい ホットシーラーを 使 うとプリーツ 状 のしわが 寄 る 高 コスト ラップ:しわができやすく 気 泡 も 入 りやすい 平 らになりにくくシールに 時 間 がかかる 消 えるバンドの 謎? 発 光 基 質 添 加 後 撮 影 すると 濃 度 の 高 いバンドの 中 心 部 分 の 発 光 が 消 えることがあります 発 光 基 質 を 低 感 度 のものに 変 更 します 中 抜 け 対 策 されたアトー WSE-7120 EzWestLumi plus を 使 用 する ゲルにアプライするサンプル 量 を 減 らします 2 次 抗 体 濃 度 を 低 くします 検 出 すると 濃 度 の 高 いバンドの 中 心 部 分 が 消 えてしまう 17

18 6. 発 光 パターンの 撮 影 (Documentation) Documentation 発 光 撮 影 方 法 発 光 基 質 を 添 加 したメンブレンは 2 次 抗 体 が 結 合 した 部 分 が 光 ります 目 で 確 認 することはで きませんが 以 下 の 方 法 で 発 光 像 を 撮 影 することが 可 能 です 化 学 発 光 (ケミルミネッセンス) 撮 影 装 置 による 撮 影 X 線 フィルムによる 検 出 インスタントフィルムによる 検 出 撮 影 方 法 メリット デメリット 化 学 発 光 撮 影 装 置 X 線 フィルム インスタントフィルム 定 量 性 の 高 いデジタルデータ 自 動 露 光 機 能 実 験 室 で 撮 影 が 可 能 ランニングコストが 低 い 高 感 度 発 光 試 薬 に 対 応 露 光 時 間 は 自 由 分 解 能 が 高 い 露 光 時 間 は 自 由 実 験 室 で 撮 影 可 能 現 像 時 間 は30 秒 化 学 発 光 撮 影 装 置 を 使 った 撮 影 方 法 1 発 光 撮 影 の 準 備 1-1. 装 置 の 起 動 初 期 費 用 ( 装 置 )が 必 要 暗 室 が 必 要 現 像 しないと 見 えない 定 量 性 が 低 い 露 光 時 間 の 調 整 が 難 しい ランニングコストが 高 い 論 文 掲 載 にはスキャンが 必 要 定 量 性 が 低 い 露 光 時 間 の 調 整 が 難 しい ランニングコストが 高 い 論 文 掲 載 にはスキャンが 必 要 電 源 スイッチ LuminoGraph 本 体 右 側 の 電 源 スイッチを - 方 向 へ 押 し 電 源 を 入 れます PC 起 動 に 関 係 なく 本 体 電 源 を 入 れると 自 動 的 に 冷 却 を 開 始 します 使 用 環 境 温 度 は20~30 を 推 奨 します インジケータの 表 示 冷 却 PC 制 御 光 源 庫 内 灯 インジケータ 表 示 の 意 味 冷 却 = 緑 黄 点 滅 : 冷 却 中 緑 点 灯 :-40 赤 点 灯 :0 PC 制 御 = 緑 点 滅 :PCからの 制 御 中 光 源 = 庫 内 にセットしたLED 光 源 の 点 灯 状 態 の 表 示 庫 内 灯 = 庫 内 灯 の 点 灯 状 態 を 示 す 庫 内 灯 は 扉 に 連 動 します 電 源 投 入 後 冷 却 インジケータは 緑 黄 に 点 滅 し 冷 却 温 度 下 降 中 であることを 示 します およそ3~5 分 ほど で-30 まで 温 度 が 下 がります 冷 却 が 完 了 すると 冷 却 インジケータが 緑 の 点 灯 状 態 になります 1-2.ImageSaver6の 起 動 PCデスクトップのショートカットから ImageSaver6 を 起 動 します 機 種 選 択 ウインド ウが 現 れたら LuminoGraphⅠ/Ⅱ を 選 択 します 今 後 このウインドウを 表 示 しない に を 入 れる と 次 回 以 降 機 種 選 択 は 表 示 されません 再 表 示 させ るには ファイル 各 種 設 定 を 選 択 し 機 種 選 択 ダイアログを 起 動 時 に 表 示 に を 入 れます 18

19 6. 発 光 パターンの 撮 影 (Documentation) 1-3.フォーカス 調 製 LuminoGraphは 短 焦 点 レンズのため 撮 影 サイズを 変 更 するに はサンプルとレンズの 距 離 を 変 更 する 必 要 があります 上 の 表 を 参 考 に サンプルサイズ 数 量 に 合 わせて 棚 位 置 を 選 択 しま す 棚 ( 左 側 )には 番 号 が 振 ってあるので レンズの 番 号 を 棚 の 番 号 と 合 わせます サンプルに 厚 みがある 場 合 はPCの 画 面 を 見 ながら 微 調 整 をしま す 1mm 程 度 までのものにフォーカスが 合 うように 調 整 されて います ステージ 位 置 フォーカス 幅 奥 行 4( 最 上 段 ) 4 80mm 60mm mm 75mm mm 90mm mm 100mm 底 位 置 ( 最 下 段 ) B UV 150mm 110mm 2 発 光 撮 影 絞 り F0.95 LuminoGraphⅡで 撮 影 を 行 う 場 合 は 0.95 に 合 わせます フォーカス 絞 り 合 わせ 位 置 棚 位 置 に 合 わせて UV~4 を 選 択 してフォーカスを 合 わせます 装 置 の 使 用 方 法 発 光 撮 影 ( 自 動 露 光 ) 自 動 露 光 モード= AutoExpo は 画 像 飽 和 が 起 こらず もっともコントラストが 高 い 露 光 時 間 を 自 動 で 設 定 して 撮 影 するモードです プレ 撮 影 と 本 撮 影 の 2 回 撮 影 を 行 います 条 件 設 定 ではプレ 撮 影 の 露 光 時 間 を 選 択 します 1 AutoExpo ボタンを 押 す 感 度 は Normal を 選 択 します 2サンプルをセットし 露 光 時 間 を 選 択 (1/30 秒 ~ 5 分 )し Start ボタンを 押 します はじめて 使 用 するときは 10 秒 で 試 してください 10 秒 で 画 像 飽 和 が 起 きるときは 1 秒 に 設 定 し Start ボタンを 押 してください 3プレ 撮 影 が 終 わると 画 像 が 表 示 され 本 撮 影 の 露 光 時 間 を 自 動 設 定 し 続 けて 撮 影 します 詳 しい 撮 影 方 法 は 装 置 に 付 属 のマニュアルを 確 認 ください 見 たいバンドが 感 度 不 足 だった 場 合 は 本 撮 影 よりも 露 光 時 間 を 長 くにすることで 感 度 アップが 可 能 です 自 分 で 露 光 時 間 を 設 定 したい 場 合 は Single モードを 選 択 し 好 きな 露 光 時 間 で 撮 影 可 能 です 19

20 7.トラブルシューティング 検 出 感 度 に 関 するトラブルシューティング トラブルの 状 態 主 な 原 因 対 処 方 法 関 連 ページ 低 濃 度 バンドの 検 出 感 度 不 足 ブロッキング スキムミルク3~5%を 使 用 している 場 合 オーバ ーブロックにより 抗 体 反 応 を 阻 害 して 検 出 感 度 を 低 下 させることがあります 12~13 スキムミルク 濃 度 を0.3% Tween % ATTO EzBlock Chemiを 使 用 抗 体 濃 度 の 不 足 まず2 次 抗 体 濃 度 を 上 げてみます 変 化 がないよ うなら1 次 抗 体 濃 度 を 上 げます 抗 体 希 釈 液 として 14~15 TOYOBO 社 のCan Get Signalを 使 用 してみます 発 光 基 質 発 光 基 質 の 感 度 が 低 い 場 合 は 高 感 度 タイプに 変 更 します ATTO EzWestLumi plusを 使 用 16~17 高 濃 度 バンド 消 失 発 光 基 質 追 加 した 場 合 の 感 度 不 足 保 存 メンブレンでの 感 度 不 足 発 光 基 質 +サンプ ル 濃 度 HRPの 失 活 抗 体 の 剥 離 HRPの 失 活 高 濃 度 バンドは 結 合 したHRP 量 が 多 く 基 質 消 化 が 早 い 傾 向 にあります サンプル 濃 度 を 低 くする 発 光 基 質 を 低 感 度 タイプに 変 更 します ATTO EzWestLumiを 使 用 一 度 発 光 させたメンブレンは HRPが 徐 々に 失 活 して2 度 目 以 降 の 基 質 添 加 では 感 度 が 低 下 します 追 加 発 光 させる 場 合 は 1 度 目 の 発 光 検 出 後 速 や かにTBS-Tなどでメンブレンを 洗 浄 してから 基 質 を 添 加 します 発 光 基 質 の 種 類 によって 結 果 が 異 な ります ATTO EzWestLumi plusを 使 用 ATTO EzWestLumiを 使 用 抗 体 反 応 後 保 存 していたメンブレンは 抗 体 の 剥 離 やHRPの 失 活 などが 原 因 で 感 度 が 低 下 します 高 感 度 発 光 基 質 を 使 用 して 感 度 不 足 を 補 います ATTO EzWestLumi plusを 使 用 抗 体 反 応 後 はなるべく 早 く 検 出 することをお 勧 めします 16~17 16~17 16~17 発 光 撮 影 に 関 するトラブルシューティング トラブルの 状 態 主 な 原 因 対 処 方 法 関 連 ページ 露 光 時 間 の 適 正 値 が 分 からない 撮 影 方 法 Ez-Capture MGなら AutoExpoモードを 使 用 して 撮 影 します またはSingleモードで30 秒 ~1 分 撮 影 し その 時 の 最 大 輝 度 とカメラの 最 大 感 度 を 比 較 し て 決 定 します 例 :1 分 で15000カウント 最 長 4 分 撮 影 可 能 (Ez-CaptureMGの 場 合 ) 目 的 バンドが 確 認 できることを 判 断 材 料 にします 18~19 バンドの 濃 淡 がうま く 出 ない しわや 気 泡 が 見 える 発 光 が 消 えてしまう 発 光 が 消 えてしまう 撮 影 方 法 メンブレンのシー ル 方 法 メンブレンのシー ル 方 法 発 光 基 質 +サンプ ル 濃 度 シーリング 作 業 の 遅 延 などで 発 光 基 質 添 加 から 時 間 が 経 ちすぎてから 撮 影 すると バンドの 濃 淡 と 発 光 量 の 差 が 小 さくなり 濃 淡 がうまく 出 ない 場 合 が あります 発 光 基 質 添 加 後 すぐに 撮 影 します ラップやハイブリバッグを 使 用 するとしわや 気 泡 が 入 りやすくなります クリアポケットを 使 用 します ラップでメンブレンをシールする 場 合 しわや 気 泡 を 追 い 出 す 作 業 で 時 間 を 費 やし 発 光 反 応 が 進 みす ぎてしまうことがあります クリアポケットを 使 用 します 高 濃 度 バンドは 結 合 したHRP 量 が 多 く 基 質 消 化 が 早 い 傾 向 にあります サンプル 濃 度 を 低 くする 発 光 基 質 を 低 感 度 タイプに 変 更 します ATTO EzWestLumiを 使 用 18~19 16~17 16~17 16~17 20

21 7.トラブルシューティング バックグラウンドに 関 するトラブルシューティング トラブルの 状 態 主 な 原 因 対 処 方 法 関 連 ページ バックグラウンド が 高 い バックグラウンド のムラ 2 次 抗 体 濃 度 と 発 光 基 質 抗 体 洗 浄 ブロッキング 振 とう 方 法 振 とうスピード 抗 体 溶 液 の 容 量 2 次 抗 体 濃 度 が 高 いとバックグラウンドが 高 くなり ます 使 用 している 数 分 の1~1/10に 希 釈 します 発 光 基 質 の 種 類 によって バックグラウンドが 高 く なることがあります ATTO EzWestLumi plusを 使 用 します 抗 体 反 応 後 の すすぎ ステップを 追 加 します 5 ~10 分 数 回 の 洗 浄 に 入 る 前 に 2,3 回 すすぎをし ます 洗 浄 効 果 が 高 くなります ブロッキングが 不 十 分 だと バックグラウンドが 高 くなります ブロッキング 効 果 の 高 いブロッキング 試 薬 を 使 用 します ただし オーバーブロックによ る 感 度 低 下 に 注 意 する 必 要 があります ATTO EzBlock CASを 使 用 します 回 転 式 のシェーカーを 使 用 するとメンブレンの 中 心 部 分 のバックグラウンドが 高 くなります シーソー 式 または 水 平 式 のシェーカーを 使 用 します ATTO シーソーシェーカーを 使 用 します メンブレンの 両 端 にバックグラウンドが 高 い 部 分 が できる 場 合 抗 体 反 応 の 振 とうスピードが 速 すぎる 場 合 があります 膜 全 体 に 抗 体 溶 液 が 行 き 渡 る 程 度 にゆっくり 振 とう 1 次 抗 体 が 貴 重 で 液 量 が 少 ない 場 合 にムラになる 場 合 があります 抗 体 量 は 同 じで 溶 媒 量 を 数 倍 に 増 やし 振 とうできる 程 度 にします 膜 全 体 に 抗 体 溶 液 が 行 き 渡 るようにゆっくり 振 とうします 斑 点 状 のスポット 抗 体 の 劣 化 2 次 抗 体 が 古 くなると 抗 体 同 士 でくっつき IgGと 結 合 せずメンブレン 上 に 残 ることがあります チューブを 軽 く 遠 心 してから 上 清 を 分 注 します 14~17 14~15 12~13 14~15 14~15 14~15 14~15 パターンの 乱 れに 関 するトラブルシューティング トラブルの 状 態 主 な 原 因 対 処 方 法 関 連 ページ 部 分 的 にパターンに ムラがある ブロッティング バンドの 一 部 分 が 欠 けていたりする 場 合 ブロッテ ィングに 原 因 があります 気 泡 が 入 らないようにメンブレンとゲルを 重 ね ます 10~11 ろ 紙 ゲル メンブレンを 重 ねたら 全 体 をつぶす ように 圧 をかけ 気 泡 を 追 い 出 します しわがある シーリング 発 光 基 質 を 添 加 した 後 のシーリングにラップを 使 用 するとしわが 見 える 場 合 があります 16~17 クリアポケットを 使 用 します バンドが 流 れている ブロッティング ゲルとメンブレンの 圧 着 が 不 十 分 で 隙 間 がありパタ ーンが 流 れたように 成 ります ろ 紙 ゲル メンブレンを 重 ねたら 全 体 をつぶす 10~11 ように 圧 をかけ 気 泡 を 追 い 出 します シーリング 発 光 基 質 を 添 加 した 後 のシーリング 時 に 気 泡 を 追 い 出 そうと 強 くしごいてしまうと バンドが 尾 を 引 い たように 流 れる 場 合 があります クリアポケットを 使 用 し 指 でしごいたりせずに シーリングします 16~17 パターン 全 体 が 曲 が っている 電 気 泳 動 ゲルの 出 来 が 悪 い 場 合 サンプルの 脱 塩 不 足 や 不 純 物 が 多 い 場 合 などで 泳 動 パターンが 乱 れることがあ ります 泳 動 バッファーが 適 正 な 組 成 でない 場 合 に も 乱 れることがあります ゲルやバッファーを 作 り 直 します サンプルの 調 整 をやり 直 します 4~7 21

22 ウエスタンブロッティングのコツ Knacks & Tips for Western Blotting 1.はじめに ウエスタンブロッティングは 電 気 泳 動 ブロッティング ブロ ッキング 抗 原 抗 体 反 応 を 経 て 目 的 のタンパク 質 を 特 異 的 に 検 出 し ます この 実 験 にはたくさんのステップがあり ひとつでもうまく いかないと 良 い 結 果 が 得 られない 面 倒 な 実 験 です ウエスタンブロッティングの 実 験 がうまくいくと 目 的 のタン パク 質 のバンドが 検 出 され それ 以 外 のバンドやバックグラウンド のシグナルが 抑 えられます このような 結 果 が 得 られないときは 検 出 までの 多 くの 実 験 ステップのうち どこかがうまくいかなかっ たことが 考 えられます ウエスタンブロッティングのコツ とは 様 々な 失 敗 から 得 た 成 功 の 秘 訣 をまとめたものです 本 資 料 では 特 に ブロッティン グ ブロッキング 抗 原 抗 体 反 応 発 光 検 出 における 実 験 操 作 で ここを 注 意 すれば 成 功 する と 考 えられる 部 分 をクローズアップし てご 紹 介 します 2.トラブルの 原 因 を 推 理 する ウエスタンブロッティングがうまくいかない 場 合 のトラブル シューティングは 原 因 の 追 究 が 必 要 です そのため 失 敗 した 実 験 結 果 を 注 意 深 く 分 析 し 実 験 ステップを 遡 り 何 が 原 因 だった のかを 推 理 します 結 果 からは バンドが 見 えない バンド が 見 えにくい 分 析 できない などと 分 類 して 分 析 すると 原 因 を 推 理 しやすくなります ( 図 1 参 照 ) バンドが 見 えない というのは バックグラウンドが 高 く 膜 全 体 が 発 光 ( 発 色 )してバンドが 確 認 できないことや 検 出 して もバックグラウンドも 含 め 何 も 光 らない( 何 も 見 えない) 様 な 状 態 を 指 します バンドが 見 えにくい というのは 基 本 的 に 目 的 のバンドは 見 えているが バックグラウンドが 不 均 一 に 高 い バンドのシグナ ルが 弱 く 確 認 しにくい 膜 全 体 に 斑 点 状 のスポットが 検 出 されてい る バンド 自 体 に 抜 けや 濃 さのムラがあるなどの 状 態 を 指 します STEP 6 発 光 検 出 EzWestLumiなど STEP 5 抗 体 反 応 1 次 抗 体 酵 素 標 識 2 次 抗 体 STEP 4 ブロッキング スキムミルク BSAなど STEP 3 ブロッティング ゲル メンブレンへタンパク 質 を 移 動 STEP 2 電 気 泳 動 タンパク 質 の 分 離 STEP 1 サンプル 調 製 サンプルの 抽 出 泳 動 サンプル 処 理 図 2 ウエスタンブロッティングのステップ 3.トラブルの 解 決 方 法 3-1 バンドが 見 えない バンドが 見 えない トラブルは 図 3のような 結 果 になることがありま す 膜 全 体 が 発 光 ( 発 色 )してしまうことでバンドが 確 認 できない 状 態 で す 図 3に 示 したように これは 発 光 検 出 抗 体 反 応 ブロッキングのステ ップが 原 因 と 考 えられるトラブルです この 状 態 は 酵 素 標 識 2 次 抗 体 が 膜 全 体 に 付 着 して 全 体 が 光 っているためです これは 抗 体 反 応 後 の 洗 浄 ス テップが 不 十 分 な 場 合 に 発 生 します 洗 浄 ステップ( 例 :10 分 3 回 )の 前 に 洗 浄 バッファー(TBS-TやPBS-T)で2,3 回 すすぎをすると 残 留 抗 体 量 が 減 り 洗 浄 効 果 が 向 上 します さらに 2 次 抗 体 の 希 釈 率 を 上 げる( 濃 度 を 低 くする)ことも 効 果 的 です また ブロッキングが 不 十 分 だと 1 次 抗 体 が 非 特 異 的 に 結 合 するため 結 果 として 膜 全 体 が 光 ってしまいます バックがきれいで 何 もバンドが 検 出 されない 場 合 は 目 的 蛋 白 質 の 量 が 検 出 限 界 よりも 低 い 事 が 考 えられます この 場 合 はサンプル 調 製 ゲル への 添 加 量 などを 再 度 チェックします またこの 他 に 抗 体 の 抗 原 性 が 低 い ( 性 能 が 悪 い) 場 合 やロットの 不 良 などによって 検 出 できない 場 合 がありま す 使 用 する 抗 体 は 予 めドットブロット 等 で 目 的 蛋 白 質 の 検 出 ができるこ とを 確 認 しておきます ブロッティングの 転 写 効 率 が 低 いと 十 分 な 検 出 感 度 が 得 られないため ゲ ル 膜 ろ 紙 の 密 着 度 を 上 げることをお 勧 めします また 転 写 後 のゲルを CBB 染 色 し ゲルにタンパク 質 が 残 っていないことを 確 認 しておきます (バンドがほとんど 無 ければブロッティング 成 功 ) 図 1 原 因 特 定 のための 実 験 結 果 分 析 分 析 できない というのは 前 出 の2 種 類 のほかにバンドの 一 部 が 消 失 していたり ダイナミックレンジが 狭 く 定 量 性 が 低 かっ たり バンドがたくさん 出 てしまうなどの 問 題 があります ウエスタンブロッティングには 大 きく 分 けて6つのステップ があります トラブルの 解 決 にはこのステップのどこで 問 題 が 生 じ ているのかを 探 る 必 要 があります ( 図 2) 図 3 バンドが 見 えない 例 ( 左 )バックが 高 くバンドが 見 えないパターンと 関 連 の 深 いステップ ( 右 )バックを 含 め 何 も 見 えないパターンと 関 連 の 深 いステップ 22

23 3-2 バンドが 見 えにくい バンドが 見 えにくい トラブルは 膜 上 の 汚 れが 原 因 となります これは 抗 体 反 応 とブロッティングに 原 因 があります( 図 4 参 照 ) バ ックグラウンドに 縞 模 様 やムラがある 場 合 は 1 次 抗 体 の 液 量 が 少 ないこ とや 振 とうが 十 分 でないことに 起 因 します これを 防 止 するには 使 用 する 抗 体 量 は 同 じで 溶 媒 (ブロッキング 溶 液 )の 量 を 増 やします そして シーソー 式 や 水 平 式 の 振 とう 器 を 使 って 膜 全 体 に 抗 体 溶 液 を 均 一 に 行 き 渡 らせるように 振 とうします 合 わせて 洗 浄 ステップのすすぎ を 加 え よく 行 うことでバックグラウンドが 低 く 抑 えられます 膜 全 体 に 斑 点 状 のスポットが 検 出 される 場 合 は 抗 体 溶 液 の 保 存 中 に 抗 体 同 士 が 凝 集 してしまったものが 膜 に 付 くことが 原 因 です 抗 体 溶 液 のチューブを 軽 く 遠 心 してから 上 清 の 抗 体 溶 液 を 分 注 すること 防 ぐことが 可 能 です バンドが 見 えにくい トラブルでは バックグラウンドが 十 分 低 い にもかかわらず 目 的 のバンドが 見 えない 場 合 があります( 図 7 参 照 ) これは 抗 体 反 応 とブロッキングのステップに 原 因 があると 考 えられま す 特 に スキムミルクの 濃 度 を3~5%にしてブロッキングを 行 うと 濃 度 の 低 いバンドはブロッキング 蛋 白 質 でオーバーコートされてしまい (オーバーブロッキングの 状 態 ) 検 出 感 度 が 低 下 します これを 防 ぐ ためには Tween-20の 濃 度 を0.1%としたTBS-T 使 用 し スキムミルク の 濃 度 を0.3~0.5%とするブロッキング 溶 液 を 使 用 します また 抗 体 反 応 後 のすすぎを 十 分 に 行 うと バックグラウンドが 低 く 抑 えられ 適 正 な 検 出 が 可 能 となります 図 7 オーバーブロッキングによる 感 度 低 下 ブロッキング 剤 の 濃 度 が 高 いと オーバーブロッキングによって 濃 度 の 低 いバン ドが 検 出 されにくくなります 図 4 抗 体 反 応 が 原 因 の 汚 れ ( 左 ) 適 正 な 検 出 例 ( 右 )バックのムラや 斑 点 状 の 汚 れが 付 いた 例 バンドのムラやスポット 状 の 抜 け 流 れた 様 ににじんでいる 場 合 は ブロッティングのステップが 原 因 と 考 えられます ( 図 5 参 照 ) これら は ゲル 膜 ろ 紙 の 密 着 度 が 十 分 ではないときに 起 こります セミド ライブロッティングでは ゲル 膜 ろ 紙 を 重 ねたら グローブをはめ た 手 で 全 体 を 圧 着 して( 図 6 参 照 ) 密 着 度 を 向 上 ることでムラや 抜 けなど を 防 ぐことができます 3-3 分 析 できない 分 析 できない トラブルは 定 量 解 析 を 行 おうとしたときに 確 認 されます 十 分 な 濃 度 があるはずのバンドが 検 出 時 に 消 えてしまう 場 合 や 差 があるはずのバンド 同 士 の 濃 度 差 がほとんど 出 ない 場 合 検 出 されたバンドが 多 すぎて 目 的 のバンドが 特 定 できない 場 合 などが あります 濃 度 の 高 いバンドは 多 くの1 次 抗 体 が 結 合 します そして2 次 抗 体 もたくさん 結 合 するため 部 分 的 に 酵 素 濃 度 が 高 い 状 態 になります そ うすると 発 光 基 質 をかけた 直 後 非 常 に 短 い 時 間 でバンド 周 辺 の 基 質 を 消 化 してしまいます 膜 のシーリングなどに 手 間 取 っていると 図 8の ようにバンドの 一 部 (とくに 中 心 部 )の 発 光 が 消 えてしまうことがあり ます これを 防 ぐには ゲルにアプライするサンプル 量 を 減 らすか 濃 度 を 低 くします その 結 果 として 酵 素 標 の 量 を 減 らすことになり 中 抜 け のトラブルが 解 決 します 図 5 ブロッティングが 原 因 の 汚 れ ゲル 膜 ろ 紙 の 密 着 度 が 十 分 でない 場 合 に 発 生 するパターンの 異 常 例 図 6 ゲル 膜 ろ 紙 の 圧 着 方 法 23 図 8 消 えた 高 い 濃 度 のバンド

24 ウエスタンブロッティングの 検 出 には 発 光 法 (ケミルミネッセン ス 法 )が 良 く 利 用 されます 従 来 は 発 光 基 質 の 感 度 が 低 く X 線 フ ィルムに 露 光 して 検 出 する 方 法 が 一 般 的 でした 今 では 発 光 基 質 の 改 良 が 進 み 桁 違 いに 検 出 感 度 が 上 がったことから 発 光 撮 影 装 置 ( 冷 却 CCDカメラシステム)を 使 って 発 光 パターンを 撮 影 すること ができます しかし いままでに 述 べてきたような 点 に 注 意 してサ ンプルを 作 っても 実 際 に 発 光 量 を 計 測 してみると 思 ったような 結 果 が 得 られない 場 合 があります この 問 題 では 発 光 試 薬 の 特 性 や 撮 影 までの 所 要 時 間 などに 原 因 があります ウエスタンブロッティングでよく 利 用 される 発 光 試 薬 は POD(HRP) 用 のもので ルミノールと 過 酸 化 水 素 とエン ハンサーで 構 成 されています 製 造 メーカーにより 発 光 持 続 時 間 発 光 強 度 などが 異 なり それぞれに 特 徴 があります しかしいずれ も 膜 へ 添 加 後 の 数 分 間 が 最 も 発 光 が 強 く また 濃 度 に 依 存 した 相 対 的 な 発 光 量 が 得 られます この 時 間 帯 の 発 光 を 撮 影 すると 濃 度 と 発 光 量 に 比 例 関 係 のある 直 線 性 の 高 いデータが 得 られます 上 記 のことから 発 光 試 薬 添 加 後 すぐに 撮 影 することをお 勧 めし ます そこで 問 題 となるのは 試 薬 添 加 後 の 膜 のシーリングで これ に 時 間 が 掛 かってしまうと せっかくの 定 量 性 の 良 い 状 態 の 発 光 を 撮 影 できなくなってしまいます 発 光 時 間 の 短 い 発 光 試 薬 では 感 度 自 体 も 下 がってしまいます そこでシーリングにクリアポケット( 図 9)を 使 用 します クリアポケットは 発 光 試 薬 を 添 加 した 膜 を 挟 むだけで 膜 をシーリングすることができ シーリング 時 間 を 短 縮 で きます クリアポケットは 文 房 具 店 で 購 入 できる 写 真 などを 入 れる ポリプロピレン 製 のビニールバッグです ハイブリバッグよりも 安 価 (A6 版 30 枚 :150 円 程 度 )で 張 りがあるため 非 常 に 使 いやす いのが 特 徴 です ポリクローナル 抗 体 を 使 用 すると どうしても 目 的 タンパク 質 以 外 のバ ンドも 検 出 されます 発 光 撮 影 装 置 によっては 有 色 分 子 量 マーカー 像 と 発 光 パターンの 合 成 機 能 があるので これを 利 用 して 分 子 量 を 求 めること も 可 能 です( 図 10) また ビオチン 標 識 分 子 量 マーカーを 用 いると サ ンプルと 同 時 に 発 光 検 出 が 可 能 です 分 子 量 マーカーが 検 出 できればそれ を 基 に 分 子 量 推 定 を 行 い 目 的 蛋 白 質 のバンドを 特 定 すればよいのです 目 的 蛋 白 質 のバンド 近 傍 にほかのバンドが 多 い 場 合 は 電 気 泳 動 条 件 の 変 更 で 分 離 を 良 くして 対 応 します 検 出 されるバンド 数 を 少 なくするには 特 異 性 の 高 いモノクローナル 抗 体 に 変 更 します 検 出 されるバンド 数 が 減 り 定 量 解 析 なども 容 易 になりま す 解 析 が 容 易 なパターンが 得 られると 再 現 性 も 高 くなり データの 信 頼 性 が 向 上 します 図 10 有 色 マーカー 像 と 発 光 パターンの 合 成 画 像 アトーEz-Capture MGで 撮 影 し CS Analzyer3で 合 成 しました 4.まとめ 以 上 のようにウエスタンブロッティングにおけるいろいろなトラブルシ ューティングをご 紹 介 してきましたが それでもすべてが 上 手 くいくわけで はないと 思 います アトー 株 式 会 社 ではいろいろなトラブルについてサポー トできるよう 資 料 を 作 成 配 布 しています これらの 情 報 が 多 くの 研 究 者 の かかえる 実 験 に 関 するトラブルシューティングの 一 助 になれば 幸 いです 発 光 検 出 のコツ for Western Blotting アトー 株 式 会 社 のラボに 眠 る 様 々な コツ を 集 めた 資 料 集 です 図 9 クリアポケットに 膜 をシーリング ポリプロピレン 製 のクリアポケットはA6サイズで30 枚 150 円 程 度 と 安 価 作 製 :アトー 株 式 会 社 製 品 情 報 グループ 24