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1 ブタ 体 外 受 精 卵 生 産 用 培 養 基 本 キット 使 用 説 明 書 製 品 番 号 IFP100PEP-BK 株 式 会 社 機 能 性 ペプチド 研 究 所

2 <キット 内 容 > 1) ブタ 卵 子 胚 回 収 液 :POE-CM(IFP1040P), 100 ml 3 本 2) ブタ 卵 子 成 熟 用 基 本 培 地 :POM(IFP1010P), 25 ml 2 本 3) ブタ 媒 精 液 :PFM(IFP1020P), 100 ml 1 本 4) ブタ 培 養 胚 発 生 用 培 地 :PZM-5(IFP0410P), 25 ml 1 本 5) dbcamp 濃 縮 液 (100 倍 液 ):dbcamp-100 (IFP1060P), 0.3 ml 1 本 6) リプロプレート(IFP 9670), 10 枚 3 パック <その 他 必 要 器 材 > 1) PBS(-)または 滅 菌 生 理 食 塩 水 (0.9%) 2) ウマ 絨 毛 性 性 腺 刺 激 ホルモン(eCG): エール 薬 品 ピーメックス(1,000 IU) 3) ヒト 絨 毛 性 性 腺 刺 激 ホルモン(hCG): エール 薬 品 プベローゲン(5,000 IU) 4) 流 動 パラフィン: メルク(107162) 5) パーコール: GE ヘルスケア バイオサイエンス( ) 6) 媒 精 用 精 液 希 釈 液 (5 倍 液 ):SEM-5 (IFP1050P; 機 能 性 ペプチド 研 ) 7) 培 養 ディッシュ 35 mm 培 養 ディッシュ: greiner bio-one(627160) ペトリディッシュ: FALCON(1112) 8) 遠 心 管 (15 ml, 50 ml) 9) ディスポーザブルシリンジ(10 ml) 10) 注 射 針 (18G) 11) ピペット 12) ガラスキャピラリーピペット 13) 吸 引 チューブ 14) ストローカッター 15) トーマ 血 球 計 算 盤 16) 実 体 顕 微 鏡 17) マルチガスインキュベーター 18) クリーンベンチ 19) 遠 心 機 20) 恒 温 槽 21) マイクロウォームプレート 22) ボルテックスミキサー 23) その 他 1

3 < 試 薬 の 調 製 法 > 性 腺 刺 激 ホルモンストック 液 (ecg, hcg 各 1,000 IU/ml)の 調 製 (100 ) 1) 2,000 IU/ml ecg ecg(1,000 IU/ 管 )を 1 管 あたり 0.5 ml の POM 培 地 で 溶 解 する 2) 2,000 IU/ml hcg hcg(5,000 IU/ 管 )を 1 管 あたり 2.5 ml の POM 培 地 で 溶 解 する 3) ecg, hcg( 各 1,000 IU/ml) 2,000 IU/ml ecg と 2,000 IU/ml hcg を 等 量 混 合 し 70 μl ずつ 分 注 して -30 で 保 存 する 媒 精 用 精 液 希 釈 液 (5 倍 液 ): SEM-5 * 組 成 SEM-5 Glucose g/l Na-citrate 2H 2 O g/l Citric acid H 2 O g/l NaHCO g/l EDTA 2Na 2H 2 O g/l Tris (TRIZMA BASE) g/l Gentamicin 0.05 g/l 0.22 μm フィルターで 濾 過 滅 菌 後 分 注 して -30 で 保 存 する * 当 社 の 別 売 製 品 (IFP1050P)は 滅 菌 済 みですので すぐご 利 用 になれます 等 張 パーコール 液 組 成 80%パーコール 液 50%パーコール 液 パーコール 1.6 ml 1 ml ミリ Q 水 ml SEM ml 0.4 ml 要 時 調 製 2

4 < 培 地 の 調 製 > ブタ 卵 子 成 熟 用 基 本 培 地 (POM)の 調 製 1 st POM 培 地 : POM+1 mm dbcamp+10 IU/ml ecg+10 IU/ml hcg 1 st POM 培 地 ( 要 時 調 製 ) 1) POM 培 地 4.95 ml に dbcamp 濃 縮 液 (100 倍 液 )50 μl を 添 加 して 1 mm dbcamp 溶 液 を 調 製 する( 全 量 5 ml) 2) 1)で 調 製 した 1 mm dbcamp 溶 液 から 50 μl を 除 去 する( 全 量 4.95 ml) 3) 2)で 調 製 した 1 mm dbcamp 溶 液 4.95 ml に 性 腺 刺 激 ホルモンストック 液 50 μl を 添 加 する(1 st POM 培 地 ) 1 卵 子 洗 浄 用 : 1 st POM(200 μl)+ミネラルオイル( 約 100 μl) 2 成 熟 培 養 用 : 1 st POM(150 μl)+ミネラルオイル( 約 150 μl) 2 nd POM 培 地 : POM 培 地 ( 基 本 培 地 ) 3 卵 子 洗 浄 用 : POM(200 μl)+ミネラルオイル( 約 100 μl) 4 成 熟 培 養 用 : POM(150 μl)+ミネラルオイル( 約 150 μl) ブタ 媒 精 液 (PFM)の 調 製 5 卵 子 洗 浄 用 : PFM(200 μl)+ミネラルオイル( 約 100 μl) 6 媒 精 用 : PFM(50 μl)+ミネラルオイル( 約 200 μl) ブタ 培 養 胚 発 生 用 培 地 (PZM-5)の 調 製 7 胚 洗 浄 用 : PZM-5(200 μl)+ミネラルオイル( 約 100 μl) 8 胚 発 生 培 養 用 : PZM-5(50 μl)+ミネラルオイル( 約 200 μl) 必 要 数 のドロップをリプロプレートに 作 成 し あらかじめインキュベーター 内 (39,5% CO 2, 5% O 2, 90% N 2 )で 気 相 平 衡 しておく 3

5 <ブタ 胚 の 体 外 生 産 法 > 1. 卵 子 の 採 取 と 成 熟 培 養 法 1) 屠 場 で 採 取 したブタ 卵 巣 を 室 温 ( 約 25 )の PBS(-)または 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 数 回 洗 浄 し 直 径 3~6 mm の 卵 胞 から 卵 子 を 吸 引 採 取 する 2) 吸 引 した 卵 子 を 含 む 卵 胞 液 は 遠 心 管 中 に 集 めて 20 分 間 静 置 する 3) 上 清 を 取 り 除 き 室 温 に 戻 した POE-CM 培 地 で 沈 査 を 希 釈 してペトリディッシュに 分 注 し 実 体 顕 微 鏡 下 で 卵 丘 細 胞 が 2~3 層 以 上 付 着 した 卵 子 を 回 収 選 抜 する( 写 真 1) 4) 選 抜 した 卵 子 は リプロプレートに 調 製 しておいた 1 st POM 培 地 (1)で 2 回 洗 浄 し 培 養 用 の 1 st POM 培 地 (2)に 1 ドロップあたり 15~20 個 ずつ 入 れて 20~22 時 間 成 熟 培 養 する 5) 成 熟 培 養 開 始 20~22 時 間 後 リプロプレートに 調 製 しておいた 2 nd POM 培 地 (3)で 卵 子 を 3 回 洗 浄 し 成 熟 培 養 用 2 nd POM 培 地 のドロップ(4)に 移 してさらに 22~24 時 間 成 熟 培 養 する 写 真 1: 回 収 直 後 の 卵 丘 卵 子 複 合 体 2. 精 子 の 処 理 と 体 外 受 精 法 1) PFM 培 地 ( 約 20 ml) 80%および 50% 等 張 パーコール 液 を 38 の 恒 温 槽 で 保 温 する 2) 凍 結 精 液 *1 のストローを 38 の 温 水 で 融 解 し 50%パーコール 液 中 に 懸 濁 する 3) 懸 濁 した 精 液 は 80%パーコール 液 の 上 に 静 かに 重 層 し 遠 心 機 で 700 g 20 分 間 遠 心 する(35 または 室 温 でも 可 ) 4) 下 部 の 精 子 を 残 して 上 清 をアスピレーターで 除 去 した 後 約 7 ml の PFM 培 地 を 加 えて 軽 く 転 倒 混 和 し 遠 心 機 で 500 g 5 分 間 遠 心 する 5) 4)を 繰 り 返 す 6) 上 清 を 除 去 し 約 0.5~1 ml の PFM 培 地 を 加 えて 懸 濁 後 血 球 計 算 盤 等 で 精 子 数 を 計 測 する 7) 精 子 濃 度 が 2~ /ml *2 になるように PFM 培 地 で 希 釈 する 4

6 8) リプロプレートに 調 製 し 気 相 平 衡 しておいた PFM 培 地 のドロップ(6)に 濃 度 調 整 し た 精 子 懸 濁 液 を 50 μl ずつ 加 える( 最 終 精 子 濃 度 1~ /ml *2 ) 9) 体 外 成 熟 後 の 卵 子 は リプロプレートに 調 製 しておいた PFM 培 地 (5)で 2 回 洗 浄 後 *2 精 子 を 含 むドロップに 15~20 個 ずつ 導 入 し 10~20 時 間 媒 精 する *1 液 状 精 液 を 使 用 する 場 合 の 精 子 の 調 整 法 については 弊 社 までお 問 い 合 わせく ださい *2 精 子 によって 受 精 に 至 適 な 精 子 濃 度 および 媒 精 時 間 は 異 なります 予 備 試 験 を 行 い 適 切 な 条 件 を 確 認 してください 3. 胚 の 体 外 発 生 培 養 法 1) 媒 精 後 の 胚 は 38 に 保 温 した POE-CM 培 地 で 1 回 洗 浄 した 後 POE-CM 培 地 (1 ml) の 入 った 15 ml 遠 心 管 に 移 し ボルテックスミキサーで 4 分 間 撹 拌 混 合 することにより 卵 丘 細 胞 を 除 去 する 2) 遠 心 管 から 裸 化 胚 ( 写 真 2)を 回 収 する 卵 丘 細 胞 が 強 固 に 付 着 している 胚 や 細 胞 質 が 変 性 した 胚 は 取 り 除 く 3) 選 抜 した 胚 は POE-CM 培 地 で 2 回 洗 浄 後 リプロプレートに 調 製 しておいた PZM-5 培 地 (7)で 2 回 洗 浄 する 4) リプロプレートに 調 製 しておいた PZM-5 培 地 のドロップ(8)に 胚 を 20~30 個 ずつ 入 れ て 培 養 すると 媒 精 後 5~6 日 で 胚 盤 胞 へ 発 育 する( 写 真 3) 写 真 2: 裸 化 後 の 胚 写 真 3: 胚 盤 胞 5

7 <ブタ 体 外 生 産 胚 の 作 製 工 程 > 卵 子 回 収 (POE-CM) 体 外 培 養 はすべて 39, 5% CO 2, 5% O 2, 90% N 2 気 相 下 で 行 う 卵 子 成 熟 培 地 (1 st POM:1, 2) の 準 備 卵 子 洗 浄 (1 st POM:1) 成 熟 培 養 (1 st POM:2) 20~22 時 間 卵 子 成 熟 培 地 (2 nd POM:3, 4) の 準 備 卵 子 洗 浄 (2 nd POM:3) 成 熟 培 養 (2 nd POM:4) 22~24 時 間 体 外 受 精 培 地 (PFM:5, 6) の 準 備 卵 子 洗 浄 (PFM:5) 媒 精 (PFM:6) 精 子 洗 浄 調 整 (PFM) 胚 の 裸 化 操 作 (POE-CM) 10~20 時 間 体 外 胚 発 生 培 地 (PZM-5:7, 8) の 準 備 胚 の 洗 浄 (PZM-5:7) 発 生 培 養 (PZM-5:8) 胚 盤 胞 形 成 5~6 日 間 6

8 < 培 地 使 用 上 の 注 意 > 1. 培 地 はブタ 卵 子 又 は 胚 の 体 外 培 養 専 用 です 他 の 動 物 では 試 験 を 行 っておりません 2. ヒト 体 外 受 精 には 絶 対 に 使 用 しないでください 3. 注 射 薬 又 は 診 断 薬 ではありません 4. 凍 結 厳 禁 4 保 存 5. 有 効 期 間 は 製 造 後 4 ヶ 月 間 使 用 期 限 厳 守 6. 万 一 製 造 過 程 での 不 備 がありました 場 合 には 代 替 品 とお 取 替 え 致 します それ 以 外 の 責 はご 容 赦 お 願 い 致 します 7. 本 品 の 使 用 により 必 ずしも 一 定 以 上 の 胚 発 生 率 を 保 障 するものではありません < 参 考 文 献 > 1. 曽 根 勝, 知 久 幹 夫, 吉 田 光 敏, 番 場 公 雄, 小 笠 晃. 各 種 希 釈 保 存 液 を 用 いた 豚 液 状 精 液 の 長 期 保 存 試 験. 日 豚 会 誌 1992; 29: Mito T, Yoshioka K, Nagano M, Suzuki C, Yamashita S, Hoshi H. Transforming growth factor-α in a defined medium during in vitro maturation of porcine oocytes improves their developmental competence and intracellular ultrastructure. Theriogenology 2009; 72: Suzuki C, Yoshioka K. Effects of amino acid supplements and replacement of polyvinyl alcohol with bovine serum albumin in porcine zygote medium. Reprod Fertil Dev 2006; 18: Suzuki C, Yoshioka K, Sakatani M, Takahashi M. Glutamine and hypotaurine improves intracellular oxidative status and in vitro development of porcine preimplantation embryos. Zygote 2007; 15: Yoshioka K, Suzuki C, Tanaka A, Anas IMK, Iwamura S. Birth of piglets derived from porcine zygotes cultured in a chemically defined medium. Biol Reprod 2002; 60: Yoshioka K, Suzuki C, Itoh S, Kikuchi K, Iwamura S, Rodriguez-Martinez H. Production of piglets derived from in vitro-produced blastocysts fertilized and cultured in chemically defined media: effects of theophylline, adenosine, and cysteine during in vitro fertilization. Biol Reprod 2003; 69: Yoshioka K, Suzuki C, Onishi A. Defined system for in vitro production of porcine embryos using a single basic medium. J Reprod Dev 2008; 54:

9 製 品 ならびに 培 養 操 作 等 に 関 する 問 い 合 わせは 電 話 FAX で 下 記 宛 にお 願 い 致 します ( 株 ) 機 能 性 ペプチド 研 究 所 山 形 県 東 根 市 神 町 西 4 丁 目 5-1 TEL: FAX: [email protected] 8