日本標準商品分類番号 872491 カリジノゲナーゼの血管新生抑制作用 カリジノゲナーゼは強力な血管拡張物質であるキニンを遊離することにより 高血圧や末梢循環障害の治療に広く用いられてきた 最近では 糖尿病モデルラットにおいて増加する眼内液中 VEGF 濃度を低下させることにより 血管透過性を抑制することが示されたが 血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を評価した報告はない そこで今回 網膜血管新生に対するカリジノゲナーゼの役割を同定するため in vitro 及び in vivo モデルを用いて抗血管新生作用を検討した < 試験方法 > 1) 管腔形成試験 (in vitro) ヒト臍帯静脈内皮細胞 ( 以下 HUVEC) と皮膚線維芽細胞の共培養系モデル ( 血管新生キット クラボウ ) を用いた あらかじめ培地中に血管新生促進物質である VEGF165 10ng/mL を添加し その培地にカリジノゲナーゼをそれぞれ 0.01 0.1 1.0 および 10μg/mL となるよう添加した 培養 11 日目に 解析ソフト ( 血管新生キット定量ソフトウェア Ver.2 クラボウ ) を用いて 新生血管の管腔面積 総延長 分岐点数および枝数を測定した 2) 細胞増殖試験 (in vitro) 1well あたり 2 10 3 cell の HUVEC またはヒト網膜毛細血管内皮細胞 ( 以下 HRMEC) を96 穴マイクロプレートに播種した VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加後 CCK-8 を用いた WST assayを行い 吸光度 ( 4 9 2 n m ) を測定することにより定量した 3) 細胞遊走試験 (in vitro) 1well あたり4 10 4 cell の HUVEC または HRMEC を12 穴マイクロプレートに播種した 細胞の一部をはがし取り VEGF165 および各濃度のカリジノゲナーゼを添加し 24 時間後にその領域に移動してきた細胞数の測定を行った 4) 細胞増殖および細胞遊走シグナルについての western blot 解析 (in vitro) HUVEC 1 10 5 細胞 / ウェルの密度で 12 ウェルプレートへ播種し サブコンフルエンスの状態になるまで培養を行った VEGF165 およびカリジノゲナーゼを添加し VEGF2 型受容体 ( 以下 VEGFR2) は添加 2 分後 ERK1/2 および p38 は添加 5 分後にそれぞれ VEGF165 誘発リン酸化抑制作用について western blot 解析を行った さらに 検出試薬を用いてバンドを発色させ その輝度を測定することにより定量化した 5)VEGF165 切断試験 (in vitro) Cell-free の状態で 培地中に VEGF165 およびカリジノゲナーゼを混合して 6 時間反応させ western blot によりバンドを検出した 6) マウス未熟児網膜症モデル ( 以下 OIR モデル ) に対する作用 (in vivo) 本モデルは C57BL/6 マウスを生後 7~12 日目まで 75% 高酸素条件下で飼育し その後 13 ~17 日目まで通常大気条件下で飼育することにより網膜中に異常血管を誘発させる 本試験では 生後 13 ~17 日目までの 5 日間 カリジノゲナーゼを皮下投与した 7) ヒト硝子体液中カリジノゲナーゼ VEGF 濃度 (in vitro) 硝子体手術を施行した増殖糖尿病網膜症 (PDR) 黄斑円孔(MH) 黄斑上膜 (E R M) 患者の硝子体液中カリジノゲナーゼ濃度及び VEGF 濃度を測定するとともに カリジノゲナーゼによる硝子体液中 VEGF165 の切断作用を検討した
VEGF165 の血管新生作用と VEGF165 の切断作用 VEG 血管内皮 VEGFR1 リン酸化 p38 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01 :p<0.05 (student t-test) p38 リン酸化 細胞遊走 細胞遊走抑制作用 (HRMEC) 血管新 血管新生抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01(student t-test) **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 )
カリジノゲナーゼの抑制作用 F165 VEGF165 の切断部位の検討 細胞 VEGFR2 リン酸化 生 PKC ERK1/2 血管新生抑制作用 (HUVEC) リン酸化 細胞増殖 ##:p<0.01(student t-test)**:p<0.01 *:p<0.05(dunnett の多重比較 ) VEGFR2 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 ) 生食を 1 とした相対比 ERK1/2 のリン酸化抑制作用 (HUVEC) ##:p<0.01 :p<0.05 (student t-test) 細胞増殖抑制作用 (HRMEC) ##:p<0.01(student t-test) *:p<0.05(dunnett の多重比較 )
OIR モデルマウスに対する作用 OIR モデルマウスにカリジノゲナーゼを皮下投与したところ 異常血管である Node 数及び Node 面積を用量依存的に有意に抑制した またカリジノゲナーゼ投与群における網膜及び硝子体液を分析したところ 21kDa 付近における VEGF164 の減少と 16kDa 付近に切断された VEGF164 の断片が確認された 生食 カリジノゲナーゼ **:p<0.01 *:p<0.05 (Dunnett の多重比較 ) ヒト硝子体液カリジノゲナーゼ VEGF 濃度の関係 ヒト硝子体液中のカリジノゲナーゼと VEGF 濃度を測定したところ いずれも黄斑円孔 ( M H ) や黄斑上膜 (ERM) に比べて 増殖糖尿病網膜症 (PDR) では有意に高値を示し 両者には統計学的に有意な相関 (p<0.001) が認められた PDR 患者の硝子体液では カリジノゲナーゼを添加することで 16kDa 付近に切断されたVEGF165の断片が確認された ** ##:p<0.001 (Steel-Dwassの多重比較) p<0.001 (Spearman の順位相関検定 )
生理的血管新生に対する作用 OIR モデルマウスで 生後 8 日目 ( 相対的虚血負荷前 ) の生理的血管新生に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したところ 血管の管腔面積 総延長 分岐点数および枝数には有意な差が認められなかった VEGF121 に対する影響 VEGF121 による血管内皮細胞の増殖 遊走及び VEGFR2 のリン酸化に対するカリジノゲナーゼの影響を検討したとこ ろ いずれの項目に対しても 有意な変化は見られなかった ##:p<0.01(student t-test)n.s.(dunnett の多重比較 ) a: 生後 0 日 ( コントロ - ル ) b: 生後 4 日 ( コントロ - ル ) c: 生後 8 日 ( コントロ - ル ) d: 生後 8 日 ( カリジノゲナ - ゼ ) N.S.(student t-test) N.S.(student t-test) 生食を 1 とした相対比 ##:p<0.01(student t-test) N.S.(Dunnett の多重比較 ) 本文中の図表はすべて中村信介 原英彰他 :ATVB 31:1041-1048 及び SFⅣ SFⅤ,2011
25 25 50 50 2015 2016 年 2 月改訂 CAR-127R 84805 PM0216