PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1

PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 説 明 書

PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 は PrimerArray ( 製 品 コード PH001 ~ PH010 PN001 ~ PN010) で 得 られたデータを 解 析 するためのツールで コントロールサンプルと 1 種 類 の 未 知 サンプル 間 の 比 較 が 可 能 です リアルタイム PCR 装 置 付 属 のソフトウェアで 算 出 された Ct 値 を 用 いてΔΔCt 法 による 相 対 定 量 解 析 を 行 い 結 果 をグラフで 表 示 します * PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 は Microsoft Office Excel で 作 成 されたマクロを 含 むファ イルです このファイルは 以 下 のバージョンのオペレーションシステム(OS)および Microsoft Office Excel で 正 常 に 動 作 することを 確 認 しています Windows XP operating system Microsoft Office Excel 2003 Microsoft Office Excel 2007 * 本 解 析 ツールは タカラバイオウェブサイトからダウンロードしてご 利 用 ください http://www.takara-bio.co.jp/primerarray_tool/ I.Ct 値 の 算 出 と 出 力 リアルタイム PCR 装 置 付 属 のソフトウェアで 解 析 パラメーターを 設 定 し Ct 値 を 算 出 し ます ( 操 作 方 法 の 詳 細 は 各 リアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアの 取 扱 説 明 書 をご 参 照 ください ) (1) 解 析 パラメーターの 設 定 ほとんどのリアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアでは 解 析 パラメーターが 自 動 で 設 定 されますが まず その 設 定 が 正 しいことを 確 認 し 適 切 でない 場 合 にはマニュ アルで 設 定 し 直 してください ベースライン 領 域 増 幅 曲 線 が 立 ち 上 る 手 前 のフラットな 範 囲 をベースライン 領 域 として 設 定 しま す ベースライン 領 域 が 狭 すぎる 場 合 十 分 なベースライン 補 正 がなされませ ん 逆 に ベースライン 領 域 が 広 すぎると 右 下 がりの 増 幅 曲 線 になるなど 正 しく 補 正 されないことがあります 正 しくベースラインが 設 定 された 例 ベースライン 領 域 が 広 すぎる 例 Threshold( 閾 値 ) PCR の 指 数 関 数 的 増 幅 域 に 設 定 します 増 幅 曲 線 の 縦 軸 を 対 数 (Log scale)で 表 示 した 際 に 増 幅 曲 線 が 直 線 になる 範 囲 が 指 数 関 数 的 増 幅 域 に 相 当 します 正 しく Threshold( 閾 値 )が 設 定 された 例 2

(2)Ct 値 の 算 出 Ct 値 はリアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアにより 自 動 的 に 算 出 されます (3)データの 出 力 Ct 値 を Microsoft Office Excel または CSV などの 形 式 で 出 力 します( 出 力 形 式 は リアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアによって 異 なります) リアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアによっては サンプル 情 報 が 設 定 されてい ないウェルや 解 析 から 除 外 (Omit)したウェルのデータ 行 は 出 力 されないこと があります そのような 状 態 では PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 へのデー タ 入 力 の 際 に 誤 りが 生 じやすくなりますので 全 ウェルのデータが 表 示 される 状 態 で 出 力 を 行 ってください 3

II. 相 対 定 量 解 析 PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 を 用 いてΔΔCt 法 による 相 対 定 量 解 析 を 行 います (1)PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 の 起 動 PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 のファイル(PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1.xls)を 開 きます (2)Plate の 選 択 実 験 に 用 いた PrimerArray の 種 類 を 選 択 し Plate Select ボタンをクリックします (3)Control Sample データの 入 力 Plate Select ボタンをクリックすると Control Sample のデータを 入 力 するシート (ControlSampleData)に 変 わります exp1(c 列 ) exp2(d 列 ) exp3(e 列 ) の 順 に Ct 値 を 入 力 します(リアルタイム PCR 解 析 ソフトウェアから 出 力 した Ct 値 をコピー&ペーストすると 簡 単 に 入 力 できます) 反 復 実 験 の 結 果 は 最 大 10 個 まで 入 力 することができます 4

(4)Test Sample データの 入 力 次 に Test Sample 入 力 用 のシート(TestSampleData)を 選 択 します Control Sample と 同 じ 要 領 で Ct 値 を 入 力 します 入 力 が 完 了 したら set sample data ボタ ンをクリックします データのクリア データ 入 力 をやり 直 す 場 合 には clear ボタンをクリックします すると 入 力 したすべてのデータが 消 去 されます Ct 値 の cutoff 値 の 設 定 Ct 値 の cutoff 値 を 設 定 すると 一 定 以 上 の Ct 値 のデータを 解 析 から 除 外 す ることができます デフォルトでは 35 サイクルに 設 定 されており Ct 値 が 35 以 上 のデータは 解 析 から 除 外 されます cutoff 値 を 変 更 する 場 合 には この Ct cutoff value の 値 を 変 更 します 5

(5)Normalization Factor の 算 出 set sample data ボタンをクリックすると Normalization Factor 算 出 のシート (normalization_factors)に 変 わります 補 正 に 用 いるハウスキーピング 遺 伝 子 (HKG) * 1 をチェックボックスで 選 択 し NF value ボタンをクリックします す ると Normalization Factor が 算 出 され 自 動 的 に 相 対 定 量 解 析 が 行 われます * 1:ハウスキーピング 遺 伝 子 の 選 択 について Normalization Factor は 反 応 に 用 いた 鋳 型 量 を 補 正 するための 係 数 で サンプル 間 で 発 現 量 が 安 定 しているハウスキーピング 遺 伝 子 (HKG)を 指 標 として 算 出 します サンプル 間 で 発 現 量 が 異 なるハウスキーピング 遺 伝 子 を 補 正 に 用 いると 結 果 が 不 正 確 になりますので その 選 択 には 注 意 が 必 要 です 適 切 なハウスキーピング 遺 伝 子 を 選 択 するには 実 験 的 に 確 か めるか * 既 知 の 情 報 ( 生 物 学 的 知 見 文 献 情 報 マイクロアレイの 解 析 結 果 等 )を 利 用 します そのような 情 報 も 得 られない 場 合 には 全 種 類 の ハウスキーピング 遺 伝 子 をリファレンスとして 用 いるか RNA 量 の 補 正 を 行 わずに( 全 種 類 を 非 選 択 とする) 解 析 を 行 います * 参 考 Housekeeping Gene Primer Set( 製 品 コード 3790/3791/3792) 説 明 書 genorm manual http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/genorm_manual.pdf Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A, Speleman F. Genome Biol. 2002 Jun 18;3 (7): RESEARCH0034. Epub 2002 Jun 18. 6

(6) 解 析 結 果 の 確 認 解 析 後 Fold Difference の 3D profile が 表 示 されます その 他 の 結 果 を 見 るには 各 シートを 選 択 します Fold Difference Control Sample を 1 とした 場 合 の Test Sample の 相 対 定 量 値 および 標 準 偏 差 の 一 覧 です Scatter plot 左 の 表 は Control Sample に 対 して 相 対 化 する 前 の 定 量 値 と 標 準 偏 差 の 一 覧 で す その 右 には それらの 値 が Scatter plot で 表 示 されます 7

3D Profile Fold Difference を 棒 グラフで 表 示 します グラフの 上 には Plate と 同 じ 配 置 で Test Sample の Fold Difference および 遺 伝 子 の Symbol の 表 が 表 示 されます 8

KEGG_pathway ボタンをクリックすると まず KEGG パスウェイマップ 上 で の 発 現 変 動 による 色 分 けの 凡 例 が 表 示 されます さらに その 画 面 上 の KEGG pathway のリンクをクリックすると パスウェイマップが 表 示 され 発 現 増 大 または 減 少 した 遺 伝 子 を 確 認 することができます 以 上 で 解 析 は 終 了 です 他 のデータの 解 析 を 行 う 場 合 には TestSampleData のシー トで clear ボタンをクリックしてデータを 消 去 し (2)Plate の 選 択 から 始 めてく ださい 9

III.トラブルシューティング セキュリティの 警 告 が 表 示 される PrimerArray Analysis Tool Ver.2.1 はマクロを 含 んでいるため セキュリティの 警 告 が 表 示 されることがあります その 場 合 には マクロを 有 効 にする 操 作 を 行 っ てください Microsoft Office Excel 2007 の 場 合 (1)セキュリティの 警 告 のオプションをクリックする (2) このコンテンツを 有 効 にする を 選 択 して OK ボタンをクリックする 10

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200910