リアルタイムPCR 再 入 門 概 要 リアルタイムPCR 原 理 蛍 光 検 出 ケミストリー 遺 伝 子 発 現 リアルタイムPCR 実 験 フロー PCR 時 間 を 短 縮 できるプロトコール 紹 介

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1 リアルタイムPCR 再 入 門 日 本 バイオ ラッドラボラトリーズ 株 式 会 社 ライフサイエンス 事 業 本 部 Z A

2 リアルタイムPCR 再 入 門 概 要 リアルタイムPCR 原 理 蛍 光 検 出 ケミストリー 遺 伝 子 発 現 リアルタイムPCR 実 験 フロー PCR 時 間 を 短 縮 できるプロトコール 紹 介

3 PCRでの 定 量 性 の 限 界 PCRでは 理 論 上 2 倍 づつ 増 幅 さまざまな 要 因 によりPCR 後 半 では 理 論 通 りには 増 幅 が 行 われない PCR 後 電 気 泳 動 での 定 量 性 には 限 界 がある

4 リアルタイムPCR PCRの の 原 理 リアルタイムPCRでは ある 一 定 の 増 幅 DNA 量 (Threshold) まで 達 した 時 点 のサイクルの 差 を 求 め る 達 したサイクルが 早 けれ ば それだけ 初 期 鋳 型 量 が 多 い

5 蛍 光 増 幅 曲 線 蛍 光 増 幅 曲 線 グラフ 例 (10 8,10 6,10 4,10 2 コピー IL-1β) Threshold Cycle =

6 検 量 線 Threshold Cycle 初 期 鋳 型 量 検 量 線

7 蛍 光 検 出 ケミストリー SYBR Green I 蛍 光 プローブ 安 価 かつ 簡 便 特 異 的 な 検 出 マルチプレックス 可 能 デメリット 非 特 異 的 な 産 物 も 検 出 デメリット 蛍 光 プローブが 高 価 蛍 光 プローブ 設 計 が 必 要

8 SYBR Gre Denature Annealing Extension

9 蛍 光 プローブ/TaqMa Denature Annealing Extension

10 蛍 光 プローブ/Molecular Annealing Extension

11 遺 伝 子 発 現 解 析 における リアルタイムPCR 実 験 フロー プライマー/ プローブ 設 計 発 現 解 析 サンプル 調 製 プロトコール 条 件 検 討

12 Primer3 プライマー/プローブ プローブ 設 計 プライマー/ プローブ 設 計 プライマー/プローブ 設 計 サイト RTPrimerDB 発 現 解 析 qpcr プライマー/プローブデータ ベースサイト サンプル 調 製 Beacon 設 計 ソフトウェア Designer プロトコール 条 件 検 討

13 サンプル 調 製 プライマー/ プローブ 設 計 迅 速 なRNA 精 製 純 度 の 確 認 A260/A280= 発 現 解 析 サンプル 調 製 RNA 非 分 解 の 確 認 18S/28S rrna チェック プロトコール 条 件 検 討

14 プロトコール 条 件 検 討 プライマー/ プローブ 設 計 まずプライマーでの 増 幅 の 確 認 温 度 グラジェント 機 能 と 融 解 曲 線 の 組 み 合 わせ 発 現 解 析 サンプル 調 製 プロトコール 条 件 検 討

15 温 度 グラジェント 機 能 最 適 なアニーリング 温 度 の 検 討 が 可 能

16 融 解 曲 線 機 能 SYBR Green では 副 産 物 の I有 無 を 確 認 プライマーダイマー 発 生 例

17 検 量 線 による 増 幅 効 率 希 釈 系 列 から 検 量 線 を 作 成 し 相 関 係 数 ( 直 線 性 )と 増 幅 効 率 を 確 認 PCR 増 幅 効 率 = [10 (-1/slope) ] - 1

18 発 現 解 析 プライマー/ プローブ 設 計 発 現 解 析 定 量 方 法 - 検 量 線 法 - 比 較 Ct 法 発 現 解 析 いずれもハウスキーピング 遺 伝 子 をリファレンスとして 目 的 の 遺 伝 子 の 発 現 量 比 を 求 める サンプル 調 製 プロトコール 条 件 検 討

19 遺 伝 子 発 現 定 量 方 法 検 量 線 法 増 幅 効 率 が100% でなくても 定 量 可 能 比 較 Ct 法 検 量 線 を 毎 回 設 定 しなくも 定 量 可 能 デメリット 毎 回 検 量 線 を 設 定 する 必 要 あり デメリット 増 幅 効 率 が100% 近 くでな ければならない

20 検 量 線 を 用 いた 定 量 試 料 A 試 料 B 目 的 の 遺 伝 子 の 初 期 鋳 型 量 10 pg 60 pg ハウスキーピング 遺 伝 子 の 初 期 鋳 型 量 10pg 15pg 試 料 Aに 対 して 試 料 Bでは 遺 伝 子 発 現 量 比 が4 倍 ハウスキーピング 遺 伝 子 でノー マライズしたターゲット 遺 伝 子 の 相 対 量 10/ 10= 1 60/ 15= 4

21 検 量 線 法 でのプレートセット プレートセットアップ SYBR 例 Green 検 出 系 スタンダード コピー 4 段 階 希 釈 系 列 HKプライマーセット スタンダード コピー 4 段 階 希 釈 系 列 TGプライマーセット 試 料 A HK プライマーセット 試 料 A TG プライマーセット 試 料 B HK プライマーセット 試 料 B TG プライマーセット ブランクHKプライマーセット ブランクTGプライマーセット HKプライマーセット=ハウスキーピング 遺 伝 子 に 対 するプライマーセット TGプライマーセット= 目 的 遺 伝 子 に 対 するプライマーセット

22 比 較 Ct 法 /ΔΔCt 法 実 例 DCt samplea DCt sampleb = Ct TG_sampleA = Ct TG_sampleB -Ct HK_sampleA -Ct HK_sampleB = = 12 = = 3 D(DCt) DCt = sampleb -DCt samplea = = 発 現 量 比 = -D(DCt) 2 = -(-9) 2= 512 試 料 Aに 対 して 試 料 Bは512 倍 の 発 現 量 比

23 ΔΔCt 法 でのプレートセット プレートセットアップ SYBR 例 Green 検 出 系 試 料 A HK プライマーセット 試 料 A TG プライマーセット 試 料 B HK プライマーセット 試 料 B TG プライマーセット ブランクHKプライマーセット ブランクTGプライマーセット HKプライマーセット=ハウスキーピング 遺 伝 子 に 対 するプライマーセット TGプライマーセット= 目 的 遺 伝 子 に 対 するプライマーセット

24 比 較 Ct 法 のノーマライゼーション DDCt 100% の 増 幅 効 率 が 前 提 1つのリファレンス 遺 伝 子 のみ 設 定 可 Pfaffl 改 法 増 幅 効 率 を 考 慮 した 算 出 法 1つのリファレンス 遺 伝 子 のみ 設 定 可 Vandesompele 改 法 増 幅 効 率 を 考 慮 した 算 出 法 複 数 のリファレンス 遺 伝 子 の 設 定 可 Simple Complex

25 DDCt 法 DCt = Ct Ct controlgoi_control REF_control DCt sample = Ct GOI_sample C t REF_sample D(DCt) DCt = sample -DCt control 発 現 量 比 = -D(DCt) 2 コントロール 試 料 =control 対 象 試 料 =sample 目 的 の 遺 伝 子 (Gene of Interest)=GOI リファレンス 遺 伝 子 Reference ( Gene)=REF

26 Pfaffl 改 法 発 現 量 比 = (Ct GOI (control) - Ct GOI (sample) ) E GOI (Ct REF (control) - Ct REF (sample) ) E REF E = 1 + (h/100) h : 増 幅 効 率 (%) もし100%なら E=2となり ΔΔCt 法 と 同 じ 結 果 になる A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Michael W. Pfaffl. Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 9 e45 コントロール 試 料 =control 対 象 試 料 =sample 目 的 の 遺 伝 子 (Gene of Interest)=GOI リファレンス 遺 伝 子 Reference ( Gene)=REF

27 Vandesomp 法 対 象 試 料 の 相 対 量 リファレンス 遺 伝 子 の 相 対 量 の 相 乗 平 均 = (Ct E GOI(control) -Ct GOI(sample) ) (GOI) (Rel Quant Ref1 * Rel Quant Ref2 *... * Rel Quant Ref n) 1/n Accurate normalization of real-time quantitative RT- PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Vandesompele, J.Katleen De Preter, Filip Pattyn, Bruce Poppe, Nadine Van Roy, Anne De Paepe and Frank Speleman. Genome Biology 2002, 3:research コントロール 試 料 =control 対 象 試 料 =sample 目 的 の 遺 伝 子 (Gene of Interest)=GOI リファレンス 遺 伝 子 Reference ( Gene)=REF

28 発 現 解 析 プライマー/ プローブ 設 計 発 現 解 析 の 定 量 方 法 - 検 量 線 法 - 比 較 Ct 法 発 現 解 析 サンプル 調 製 まずは 検 量 線 法 で 実 験 を 行 ってい き 実 験 に 慣 れてきて サンプル 数 が 多 くなってきたら 比 較 Ct 法 を 行 う ことをおすすめします プロトコール 条 件 検 討

29 PCR 時 間 を 短 縮 できる プロトコール 既 存 のサーマルサイクラーやリアルタイム PCRシステムで PCR 時 間 を 大 幅 に 短 縮 す るためのプロトコール( Fast PCR プロトコー ル)が 実 行 可 能 です

30 PCRのプロトコールでは 何 がスピードの 決 め 手 となっているのか? 実 際 のPCR 実 行 時 間 は 以 下 のものに 影 響 されます: ステップおよびサイクル 数 それぞれのステップにおける 時 間 の 長 さ それぞれのステップの 温 度 に 到 達 するまでの 時 間 の 長 さ(ランピング 時 間 )

31 いかにPCR 実 行 時 間 を 短 くするか? PCR 実 行 時 間 を 減 らすには 以 下 のことを 実 施 します: ステップおよびサイクル 数 を 最 小 限 にする それぞれのステップでの 時 間 を 短 くする ステップ 間 の 温 度 差 を 減 らし ランピング 時 間 を 最 小 限 にする 変 性 変 性 伸 長 反 応 アニーリング/ 伸 長 反 応 アニーリング 標 準 的 なPCRプロトコール Fast プロトコール PCR

32 より 速 いPCRい PCRのためには どのようにプロトコールを 改 変 するのか? 250 bp 以 下 のターゲットでのFast プロトコールを PCR 実 行 するための 改 変 方 法 は: T m 値 が64 69 のプライマーを 作 製 (T m 値 はSanta Lucia -neighbor nearest 法 にて 計 算 します) 最 初 のテンプレート 変 性 / 酵 素 活 性 化 ステップを98 30 秒 に 変 更 それぞれのサイクルでの 変 性 ステップを92 1 秒 に 変 更 アニーリングと 伸 長 反 応 ステップを 秒 の1つのステップに 結 合 * 注 : プライマーのTm 値 が 上 記 範 囲 内 にはいらない 場 合 2-3bp 長 くする か あらためて 設 計 する 必 要 があります

33 プロトコール 変 更 例 通 常 のプロトコール 改 変 Fast プロトコール 分 温 度 を 高 く 時 間 を 短 く 秒 秒 温 度 を 低 く 時 間 を 短 く 92 1 秒 35 x 秒 秒 アニーリングと 伸 長 反 応 ステップを 70 の 一 つのステップにし 時 間 を 短 く 秒 x 分 ステップ 削 除 (250 bp 以 下 の 短 い PCR 産 物 では 通 常 最 終 伸 長 反 応 は 必 要 ありません) 終 了 までの 実 時 間 : 1 時 間 28 分 34 分 短 縮 時 間 = 54 分

34 Fast と PCR 標 準 PCRプロトコールの PCR 産 物 泳 動 結 果 ターゲットは 約 bpで T m 値 は63 67 と 違 いがあるもので 検 証 し Fast プ ロトコール(F)と 標 準 プロトコール(S) 両 方 で 実 行 しました icycler サーマルサイクラー を 用 いて itaq DNAポリメラーゼにてPCRを 実 施 し アガロース 電 気 泳 動 による 結 果 を 示 します 標 準 プロトコール: /3 95分 (95 /15 秒 62 /30 秒 72 /30 秒 )x サイクル 72 /10 35 分 Fast プロトコール: /30 98 秒 (92 /1 秒 70 /20 秒 )x サイクル 35

35 リアルタイムPCR PCRでの 正 確 な 定 量 結 果 MiniOpticon リアルタイムPCR 解 析 システム 用 いて リアルタイム PCRの 実 施 結 果 相 関 係 数 =0.995 増 幅 効 率 =99.3% PCR 実 行 時 間 = 33 分 プロトコール: / 98 秒 30 (92 /1 秒 70 /5 秒 plate read) サイクル x 30

36 Fast プロトコールまとめ PCR プロトコールを 改 変 するだけでPCR 実 行 時 間 は 1.5 ~2.0 時 間 から30~40 分 間 に 減 少 させること が 可 能 です 特 殊 な 機 器 を 導 入 しなくても 既 存 のサーマルサ イクラーやリアルタイムPCRシステムでPCR 時 間 を 短 縮 することが 可 能 です より 詳 細 な 情 報 -Fast チュートリアルPDF PCR 版 - は 弊 社 Webサイト -rad.co.j よ りダウンロードが 可 能 です