遺伝子検査の基礎知識

リアルタイム PCR(SYBR Green I 法 ) 実 験 ガイド この 文 書 では SYBR Green I 法 によるリアルタイム PCR について 蛍 光 検 出 の 原 理 や 実 験 操 作 の 流 れなどを 解 説 します 実 際 の 実 験 操 作 の 詳 細 については 各 製 品 の 取 扱 説 明 書 をご 参 照 ください - 目 次 - 1 蛍 光 検 出 の 原 理 2 実 験 に 必 要 なもの 3 実 験 操 作 法 4 結 果 の 解 析

1 蛍 光 検 出 の 原 理 SYBR Green I による 蛍 光 検 出 の 原 理 SYBR Green I は DNA に 結 合 するインターカレーターの 一 種 で PCR によって 合 成 された 二 本 鎖 DNA に 結 合 し 励 起 光 の 照 射 により 蛍 光 を 発 します この 蛍 光 強 度 を 測 定 することにより PCR 増 幅 産 物 の 生 成 量 をモニターできます さらに 後 述 の 融 解 曲 線 分 析 を 行 うことで 適 切 な 増 幅 産 物 が 得 られたかどうかを 確 認 できます 融 解 曲 線 分 析 による PCR 増 幅 産 物 の 確 認 融 解 曲 線 分 析 では PCR 反 応 後 反 応 液 の 温 度 を 60 から 95 まで 徐 々に 上 昇 させ 蛍 光 値 をモニタリングします PCR 産 物 が 二 本 鎖 を 形 成 している 状 態 では 強 い 蛍 光 が 検 出 さ れますが ある 一 定 の 温 度 (Tm 値 )に 達 すると 一 本 鎖 に 解 離 し 蛍 光 値 が 急 激 に 低 下 します Tm 値 は PCR 産 物 の 長 さや GC 含 量 により 異 なるので 目 的 の 増 幅 産 物 と Primer dimer のような 短 い 増 幅 産 物 を 区 別 することができます Raw data 1 st Derivative Primer dimer Raw data が 蛍 光 値 をモニタリングした 元 データで 1 st Derivative は 元 データを 一 次 微 分 してプラスマイナスを 反 転 させたグラフです このピーク 位 置 を Tm 値 として 算 出 します

2 実 験 に 必 要 なもの 一 般 的 な 実 験 器 具 類 マイクロピペット(20, 200, 1000μl)およびチップ(フィルター 付 き) 1.5 ml チューブおよびチューブラック 攪 拌 機 (Vortex) 小 型 遠 心 機 (1.5 ml チューブ 用 8 連 0.2 ml チューブ 用 )など * 詳 細 は 別 冊 の 遺 伝 子 検 査 の 準 備 と 注 意 事 項 をご 参 照 ください リアルタイム PCR 装 置 Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズは 日 本 語 仕 様 の 食 品 環 境 検 査 用 ソフト ウェアを 標 準 搭 載 しており 遺 伝 子 検 査 にお 勧 めの 機 種 です 器 具 名 称 1 Thermal Cycler Dice Real Time System Lite ( 製 品 コードTP700) 用 途 など 48ウェル 対 応 のコンパクト タイプです 2 Thermal Cycler Dice Real Time System II ( 製 品 コードTP900) 96ウェルタイプのスタンダ ードタイプです 3 Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC ( 製 品 コードTP970) 96ウェルタイプのスタンダ ードタイプです リアルタイム PCR 専 用 消 耗 品 Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズでは 専 用 の 反 応 チューブおよび 反 応 プレートをご 用 意 しております 下 記 以 外 のチューブやプレートを 使 用 すると 正 常 な PCR 反 応 が 行 われない 他 装 置 故 障 の 原 因 となりますので ご 注 意 ください その 他 反 応 液 のマスターミックス 調 製 や 鋳 型 の 希 釈 に 使 用 するチューブ 類 は 通 常 の PCR/RT-PCR 実 験 と 同 様 のものをご 利 用 いただけます

Thermal Cycler Dice Real Time System III with PC( 製 品 コード TP970) 向 け 独 立 型 フラットキャップ 付 き 8 連 反 応 チューブ 0.1 ml 8-strip tube, individual Flat Caps( 製 品 コード NJ902) コンタミネーション 防 止 のためには 独 立 型 フラットキャップ 付 き 8 連 チューブをお 勧 めします チューブおよびキャップがそれぞれ 連 結 した 8 連 反 応 チューブ 0.1 ml 8-strip tube & cap Set( 製 品 コード NJ903) 96 穴 反 応 用 プレート & 密 着 シール 0.1 ml 96 well plate for Real Time( 製 品 コード NJ900) Sealing Film for Real Time ( 製 品 コード NJ500) Plate Sealing Pads*( 製 品 コード 9090) * 96 ウェルプレートに シールをしっかりと 貼 り 付 けるために 使 用 する 専 用 パッド リアルタイム PCR 試 薬 SYBR Green I 法 による 微 生 物 遺 伝 子 検 査 には QuickPrimer (Real Time)シリーズをお 使 い 頂 けます 以 下 のようにプライマーと 試 薬 を 組 み 合 わせて 使 用 します なお 反 応 確 認 用 の 陽 性 コントロールも 別 売 りしています リアルタイム PCR 用 プライマー QuickPrimer (Real Time)シリーズ( 製 品 コード MR101 等 ) リアルタイム PCR 用 試 薬 SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)( 製 品 コード RR420A/B)

陽 性 コントロール DNA QuickPrimer (Real Time)シリーズ 用 Positive Control DNA( 製 品 コード MR401 等 ) 3 実 験 操 作 法 (1) サンプルの 調 製 (エリア 2 で 実 施 ) 検 体 の 種 類 や 実 験 目 的 に 適 した 方 法 でサンプルの 調 製 を 行 います 簡 易 的 な 抽 出 を 行 う 方 法 としては 熱 抽 出 法 やアルカリ 熱 抽 出 法 があります 高 純 度 な DNA が 必 要 な 場 合 は DNA 精 製 キットを 使 用 して 調 製 します * DNA 調 製 法 に 関 しては 別 冊 の DNA/RNA 調 製 法 実 験 ガイド をご 参 照 ください * 実 験 エリアに 関 しては 別 冊 の 遺 伝 子 検 査 の 準 備 と 注 意 事 項 をご 参 照 ください (2) リアルタイム PCR 用 装 置 のセッティング(エリア 2 で 実 施 ) * Thermal Cycler Dice Real Time シリーズを 使 用 する 場 合 は 別 冊 の Thermal Cycler Dice Real Time Quick Manual をご 参 照 ください (3) 反 応 液 の 調 製 (エリア 1 3 で 実 施 ) * 操 作 方 法 の 詳 細 は 各 製 品 の 取 扱 説 明 書 をご 参 照 ください 1 反 応 液 の 調 製 (エリア 1 で 実 施 ) サンプル 以 外 の 試 薬 のマスターミックスを 氷 上 で 調 製 し リアルタイム PCR 専 用 チュ ーブに 分 注 し キャップを 軽 く 閉 めます 12 反 応 分 のマスターミックス 調 製 例 試 薬 1 反 応 当 り 12 反 応 分 2 SYBR Premix Ex Taq 12.5μl 150μl 5 Primer mix 5μl 60μl dh2o 2.5μl 30μl 2 陰 性 コントロールの 添 加 (エリア 1 で 実 施 ) 陰 性 コントロールのチューブに dh2o を 5μl 添 加 し チューブのキャップをしっかり 閉 めます 3 サンプルおよび 陽 性 コントロールの 添 加 (エリア 3 で 実 施 ) エリア 3 に 移 動 し (1)で 調 製 したサンプルおよび 陽 性 コントロールを 各 5μl 添 加 し チューブのキャップをしっかり 閉 めます

リアルタイム PCR 反 応 液 は コンタミネーション 防 止 のため クリーンベンチ 内 で 調 製 し ます 試 薬 は 酵 素 の 失 活 を 避 けるため アイスボックス 内 で 氷 上 で 取 り 扱 ってください (4) リアルタイム PCR の 開 始 (エリア 2 で 実 施 ) リアルタイム PCR 反 応 液 が 入 ったチューブを 軽 くスピンダウンし リアルタイム PCR 装 置 にセットし 反 応 を 開 始 します 4 結 果 の 解 析 増 幅 曲 線 と Ct 値 PCR 増 幅 の 有 無 は 増 幅 曲 線 で 確 認 します コントロール 反 応 の 結 果 が 適 切 であることを 確 認 した 上 で 測 定 対 象 サンプルの 増 幅 の 有 無 を 判 定 します 増 幅 が 認 められない 場 合 には 陰 性 と 判 定 されます ただし PCR 阻 害 物 質 による 偽 陰 性 の 可 能 性 がありますので 注 意 してください 増 幅 が 認 められた 場 合 は 次 の 融 解 曲 線 の 結 果 と 合 わせて 判 定 を 行 います 増 幅 曲 線 が 閾 値 に 達 した 時 のサイクル 数 を Ct 値 と 呼 び Ct 値 は 初 期 鋳 型 量 の 目 安 となり ます Ct 値 が 小 さい 場 合 は 鋳 型 量 が 多 く Ct 値 が 大 きい 場 合 は 鋳 型 量 が 少 なかったと 推 測 されます 融 解 曲 線 と Tm 値 PCR 増 幅 産 物 の 特 異 性 は 融 解 曲 線 で 確 認 します 陽 性 コントロールの Tm 値 と 測 定 対 象 サンプルの Tm 値 が 一 致 していれば 目 的 の PCR 産 物 が 得 られていると 推 測 され 陽 性 と 判 定 されます Tm 値 が 異 なる 場 合 は 非 特 異 的 増 幅 と 推 測 され 陰 性 と 判 定 されます

( 解 析 例 ) コントロール 反 応 の 例 陽 性 コントロールは 増 幅 し 陰 性 コントロールは 増 幅 しないのが 正 しい 結 果 です SYBR Green I 検 出 の 場 合 反 応 系 によっては 陰 性 コントロールでわずかに 増 幅 が 認 められるこ とがありますが 陽 性 コントロールと 同 じ Tm 値 の 産 物 でなければ 非 特 異 的 増 幅 産 物 と 推 測 され 問 題 ありません 陽 性 コントロール 陰 性 コントロール

陰 性 判 定 の 例 増 幅 曲 線 で 増 幅 が 認 められても 融 解 曲 線 の Tm 値 が 陽 性 コントロールと 一 致 しない 場 合 は 陰 性 と 判 定 されます このような 結 果 になる 原 因 としては プライマー 由 来 の 非 特 異 的 増 幅 が 生 じたこと 等 が 考 えられます 陽 性 判 定 の 例 増 幅 曲 線 で 増 幅 が 認 められ 融 解 曲 線 の Tm 値 が 陽 性 コントロールと 一 致 した 場 合 は 陽 性 と 判 定 されます