MiSeq Reporter (MSR) をはじめよう 癸 生 川 絵 里 (Eri Kibukawa) Bioinformatics Support Scientist 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
Outline MiSeq Reporter (MSR) とは? Web インターフェイス OutputフォルダとFASTQ はじめのトラブルシュート 2
Outline MiSeq Reporter (MSR) とは? Web インターフェイス OutputフォルダとFASTQ はじめのトラブルシュート 3
MiSeq Reporter (MSR)とは? MiSeq のパイプラインで 二 次 解 以 降 を 担 当 するソフトウェアです 画 像 取 得 MiSeq Control Software(MCS) /Real Time Analysis (RTA) 一 次 解 析 画 像 解 析 ベースコール FASTQの 作 成 MiSeq Reporter (MSR) 二 次 解 析 ワークフローに 従 った 各 解 析 レポート 表 示 4
MiSeq Reporter (MSR)とは? MiSeq 上 では RTA が 一 時 解 析 を 終 了 しますと MSRが 自 動 で 後 続 の 解 析 処 理 を 始 めます サンプルシートにより 指 定 された 各 解 析 プロセスを 実 施 します 過 去 の 解 析 結 果 の 閲 覧 や 再 解 析 実 行 もできます 5
MiSeq Reporter (MSR) の 働 き 方 Windowsのサービスとしてバックグラウンドで 動 いているため 起 動 のためのデスクトップアイコンなどは 置 いてありません Webブラウザからアクセスし 操 作 します アドレス 例 http://localhost:8042/ 同 じネットワーク 上 に 接 続 している 複 数 のユーザがWebブラウザ で 同 一 MSRを 閲 覧 / 操 作 できます 6
MiSeq Reporter (MSR) の 動 作 場 所 on-instrument (MiSeq 上 ) デフォルトでインストール/ 設 定 済 み ラン 中 は 自 動 でMSRが 起 動 し 解 析 を 行 います off-instrument ( 別 のPC 上 ) ユーザーが 自 分 のWindowsPCにインストール/ 設 定 MSR スタンドアロンとも 呼 称 されます OSは64-bit Windows(Vista, Windows 7) 弊 社 webサイトmyilluminaよりinstallation Guideをご 参 照 ください 7
MiSeq Reporter 6つの 基 本 ワークフロー リシーケンス アンプリコン 16Sメタゲノム De novo アセンブル Small RNA ライブラリーQC リシーケンス アンプリコン 16S de novo Small RNA ライブラリー QC 8
MiSeq Reporter 6つの 基 本 ワークフロー リシーケンス (Resequencing) リファレンス 配 列 (サンプルシートで 指 定 )に 対 しアライメントし 変 異 解 析 を 行 いレポートします アンプリコン (Amplicon) TSCA (TruSeq Custom Amplicon) 特 定 配 列 領 域 (マニフェストファイルで 指 定 )に 対 しアライメントし 変 異 解 析 を 行 いレポートします ライブラリQC (Library QC) クオリティーコントロール(QC)のため にライブラリの 簡 易 アライメントし サンプル 毎 の 指 標 サマリを 表 示 します Small RNA mirna, RNA, ゲノム 配 列 等 に アライメントし 結 果 やカウントを 表 示 します 解 析 はSRに 対 してのみ 行 いレポートします De Novoアセンブリ リードから 小 さいサイズのゲノム (<10 Mb) のアセンブルを 行 い コンティグを 作 成 することができます 16S メタゲノミクス 微 生 物 群 集 の 分 類 学 的 多 様 性 の 特 徴 付 け を 行 う 際 に 広 く 使 われている 16S rrnaを 用 いた 分 類 を 行 いレポート します 9
MiSeq Reporter 6つの 基 本 ワークフロー ドキュメント; MiSeq Reporter Quick Reference Guide もご 参 照 下 さい ワークフローにつきましては 日 本 語 版 のtechnoteなども 弊 社 ホームページより ダウンロード 頂 けますので ぜひご 利 用 下 さい http://www.illuminakk.co.jp/systems/miseq/applications.ilmn リシーケンス アンプリコン 16S de novo Small RNA ライブラリー QC 10
MSR 全 ワークフロー 共 通 のポイント リシーケンス アンプリコン 16S de novo Small RNA ライブラリー QC サンプルシート( 設 定 指 示 ファイル) 作 成 が 必 要 です サンプルシートの 内 容 に 基 づきデマルチプレックスが 行 われます サンプルシートに 記 載 されているワークフローが 実 施 されます 解 析 結 果 ファイルは 基 本 的 に 以 下 のフォルダ 配 下 に 生 成 されま す D: Illumina MiSeqAnalysis ランフォルダ 名 Data Intensities BaseCalls 11
サンプルシート (SampleSheet.csv) ランと 解 析 の 設 定 を 行 う 要 のファイル CSV 形 式 (カンマ 区 切 り)ファイル ワークフローにより サンプルシート に 記 載 する 内 容 が 異 ります Illumina Experiment Manager (IEM) を 用 いて 作 成 します * サンプルシートはCSV 形 式 のテキストですので 一 般 的 なテキストエディタや 表 計 算 ソフト 等 でも 作 成 できますが 記 述 ルールに 起 因 するエラーのお 問 合 わせが 頻 出 しておりますため 必 ずIEMを 使 用 して 作 成 されることをお 勧 めいたします * 次 回 のテクニカルセミナーでIEMのご 説 明 を 予 定 しております 12
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MiSeq Reporter Web インターフェイス Webブラウザを 起 動 し アドレスを 入 力 http://localhost:8042 (MSRとWebブラウザを 同 じ 機 器 で 使 用 時 ) http://ipアドレス:8042 (MSRとWebブラウザを 別 々の 機 器 で 使 用 時 ) 例 ; http://192.168.10.16:8042 14
MSR トップ 画 面 メインウインドウ 左 ペインで 選 択 したランのステータス とメトリクスが 表 示 されるエリア MSRの 現 在 の 解 析 稼 働 状 態 MSRの 終 了 ステータス 過 去 のラン 15
MSR 操 作 ボタン ステータスとログ 印 刷 リポジトリの 変 更 リキュー(MSR 再 実 行 ) ヘルプページ 16
Resequencing/Ampliconワークフロー SUMMARYタブ 17
ヘルプページ http://www.illumina.com/help/miseq_reporter/ 18
Resequencing/Ampliconワークフロー SAMPLE タブ 表 示 事 項 カバレッジとエラー Q score SNP/indel + アノテーション サンプル/ 変 異 テーブル 19
Resquencing/Ampliconワークフロー SAMPLE タブ Viewの 操 作 viewのスコープ ズームin/out 20
General データのエクスポート テーブル 情 報 のエクスポート (csv 形 式 ) 印 刷 ボタン 21
De Novo アセンブリ ワークフロー CONTIGSタブ ドットプロット メトリクス *Dot plot は サンプルシートでリファレンス 配 列 を 指 定 した 場 合 にのみ 表 示 されます *De Novoアセンブリワークフローではリファレンスゲノムは 必 須 ではありません 22
Small RNAワークフロー SUMMARY タブ アライン 結 果 の 内 訳 mirnaトップ10 サンプルテーブル 23
General Run Status タブ ランの 解 析 について Status の 情 報 が 得 られる 24
General Run Sample Sheet タブ ランの 解 析 について Status; Sample Sheet などの 情 報 が 得 られる 25
General Run Logs タブ ランの 解 析 について Status; Sample Sheet; Logs などの 情 報 が 得 られる 26
General Run Errors タブ ランの 解 析 について Status; Sample Sheet; Logs ; Errorsなどの 情 報 が 得 られる 27
MSR 再 実 行 (リキュー) MSRでランデータのプロセスを 再 実 行 したい 場 合 にリキューボタンを 押 します サンプルシートで 与 えるパラメータを 変 更 して 再 実 行 させることが 可 能 です 28
MSR リポジトリの 変 更 MiSeq 上 では 通 常 はこのボタンからパスを 変 更 する 必 要 はありません リポジトリとは 解 析 / 表 示 したいランフォルダのある 場 所 (パス)です ( 通 常 はMiSeqAnalysisフォルダ) 29
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MSRの 結 果 ファイル D: Illumina MiSeqAnalysis 当 該 ランフォルダ 名 Data Intensities BaseCalls * MSR v1.3 アライメント 以 降 の 結 果 は AlignmentNディレクトリの 中 に 生 成 されます 既 存 のAlignmentNディレクトリはリキューしても 上 書 きされません リキュー 結 果 はAlignmentフォルダの 数 字 がインクリメントされたフォルダに 生 成 され 過 去 のAlignmentディレクトリは 保 存 されます フォルダやファイルの 更 新 時 間 情 報 もご 確 認 に 役 立 ちます 31
FASTQファイルの 命 名 規 則 * v1.3 例 ; MySampleA_S1_L001_R1_001.fastq.gz ファイルの 命 名 規 則 は 以 下 の 通 りです a_sb_lc_rd_001.fastq.gz とした 場 合 ; a サンプル 名 (サンプルシートで 指 定 したサンプル 名 ) Sb サンプル 番 号 (サンプルシートで 指 定 したサンプルを 行 の 上 から1,2,3..とふって 行 った 番 号 0はどのサンプルにも 帰 属 できなかったもの) Lb レーン 番 号 (MiSeqでは 現 在 1レーンのみのため 必 ずL001になります) Rc リード 番 号 (リード1はR1, リード2はR2になります) * v1.1.6ではサンプル 毎 ではなく タイルグループ 毎 のFASTQとなり 命 名 規 則 も 異 なりましたので ご 注 意 ください 32
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まずは Help! 34
Q:MSRで 解 析 結 果 がでてきません 35
Errorは 出 ていますでしょうか? MSR 左 ペインのランのiconは 緑 の? 赤 の? MSRのErrorタブに 開 始 と 終 了 のログステートメントが ありますか? MSRのErrorログにステートがあった 場 合 は その 内 容 を 読 み 修 正 後 再 度 リキューして 下 さい MSRのErrorログになにもなくLogsタブにも 開 始 した 痕 跡 がない 次 へ 36
RTAによる 一 次 解 析 は 終 了 していますか? MSRが 解 析 に 必 要 とする 特 に 以 下 のファイルは ランフォルダの 直 下 にそろっていますか? RTAComplete.txt SampleSheet.csv RunInfo.xml バックグラウンドでまだRTAが 働 いていて MSRが 解 析 を 待 機 して る 状 態 があり 得 ます RTAComplete.txt というRTA 終 了 フラグファイ ルが 生 成 されておらず 稼 働 中 でしたら 慌 てずにそのままお 待 ちくだ さい 終 了 している ファイルもある 次 へ. 37
SampleSheet はOKですか? SampleSheetはIEMで 作 成 したものですか? SampleSheetはカンマ 区 切 りの 間 の 値 が 二 重 カッコで 囲 ま れていませんか? => Excelなど 表 計 算 ソフトでは 見 えない 場 合 があ りますので notepadなどテキストエディタでご 確 認 下 さい Illegal Charactersは 使 われていませんか?? ( ) [ ] / = + < > : ; " ', * ^ &. 38
リファレンス 配 列 はどうでしょう? SampleSheetで 指 定 したリファレンスゲノムのフォルダの 下 に.fastaあるいは.faという 拡 張 子 をもつFASTAファイルが ありますか? SampleSheetで 指 定 したリファレンスゲノムのFASTAファ イルのコメント 部 に 以 下 のIllegal Charactersが 含 まれていま せんか?? ( ) [ ] / = + < > : ; " ', * ^ &. 39
表 示 させているリポジトリはあっていますか? ( 特 に MSRスタンドアロンをお 使 いの 場 合 ) MSRの 左 ペインには ランを 示 す 四 角 いラベルが 見 えてい ますか? いくつか 前 のランもあるはずの 場 合 それらのランも 左 ペ インに 表 示 されていますか? 違 った 場 所 をみている 場 合 は MSRのリポジトリボタンを 押 し どこの 場 所 をリポジトリとしているかご 確 認 下 さい 40
MSRはサービスしていますか? MiSeq Reporterがサービスをしているか 調 べる Start button -> Control Panels -> Administrative Tools -> Services MiSeqReporter サービスをハイライトさせStatus 列 の 表 示 を 確 認 します 右 クリックで 起 動 停 止 再 起 動 が 選 べま すので 止 まっていた 場 合 は 起 動 して 下 さ い 41
Appendix: IPアドレスの 確 認 方 法 Windows Startボタンを 押 し Rを 押 すことでRun windowのフィールド へ 移 動 します cmdというコマンドを 打 ち 込 みOKを 押 します ipconfigコマンドを 打 ち 込 みEnterキーを IP v4 の 箇 所 にIPが 表 示 されます 42
43 techsupport@illumina.com