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1 NGS をはじめよう!RNA-Seq 入門 ( キットの選び方 実験デザイン ) April 18, 2014 米田瑞穂イルミナ株式会社テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.

2 本日の Outline イルミナ RNA キットのラインナップ - 各キットの特長と原理 - 可能な同時解析のサンプル数 推奨のシーケンス条件 - インプット RNA のクオリティ -RNA キットで調製したライブラリーのクオリティ 2

3 RNA シーケンス (RNA-Seq) で何ができるか 発現プロファイリング解析 遺伝子の発現比較 エクソンの発現比較 スプライスバリアントの発現比較 アレルごとの発現比較 幅広いダイナミックレンジでの発現比較 アノテーションが充分で無い生物で発現比較 超微量からの発現解析 ncrnaの発現プロファイリング解析 赤字ーマイクロアレイでは難しいこと トランスクリプトーム解析 mrna 領域の網羅的推定 新規スプライスバリアントの発見 融合遺伝子の発見 ゲノム未知な生物において de novo アセンブルを用いて mrna 配列の網羅的取得 新規 ncrna の発見 July Vol 5 7 Nature Methods 5 (2008) The beginning of the end for microarrays? 3

4 RNA-Seq のワークフロー RNA の単離 ライブラリー 調製 シーケンス データ解析 4

5 RNA-Seq: イルミナ RNA キットの選択 1) TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 6) TruSeq Targeted RNA Expresstion Kit 5

6 RNA-Seq: イルミナ RNA キットの選択 1) TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 6) TruSeq Targeted RNA Expresstion Kit 6

7 1)TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 のワークフロー Total RNA から poly A を含む mrna を回収 AAAAA RNA の断片化 AAAAA NNNNNN ランダムプライマーを用いた cdna 合成 NNNNNN 2 本鎖 cdna 合成 末端修復 リン酸化 A テイル付加 P A P A P P インデックス付アダプターのライゲーション T A A T ビーズによるサイズ選択 PCR T A A T A T T A 7

8 1) TruSeq RNA Sample Prep kit v2 最もスタンダードなプロトコル ストランド情報なし RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA: ug 高品質 poly A を含む mrna を回収 精製済の mrna: ng 高品質 ストランド情報なし 24-plex (Set A B 両方を使用の場合 ) ハンズオンタイム :12 時間程度 poly A を含む mrna mrna 8

9 RNA-Seq: イルミナ RNA キットの選択 1) TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 6) TruSeq Targeted RNA Expresstion Kit 9

10 ストランド情報とは? ストランド情報 :2 つの DNA 鎖のどちらの鎖から RNA が生成されたのかを示す なぜストランド情報が重要なのか? 鋳型となる鎖がわかれば ゲノムに特異的にマッピングすることができるため 結果として効率よく配列を読むことができ サンプルとコストを抑えることかできる 遺伝子調節の重要な役割を示すアンチセンス RNA の発現を検出することが可能 10

11 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit は どのようにしてストランド情報が保持されるのか? R1 for antisense R2 for sense 11

12 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep kit ストランド情報あり RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA: ug 高品質 poly A を含む mrna を選択 精製済の mrna: ng 高品質 第 2 鎖 cdna の合成時に dutp を取り込み 第 2 鎖のからの増幅を阻止 LT kit: 24-plex (Kits A B 両方を使用の場合 ) HT kit: 96-plex ハンズオンタイム :9 時間程度 poly A を含む mrna mrna 12

13 RNA-Seq: イルミナ RNA キットの選択 1) TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 6) TruSeq Targeted RNA Expression Kit 13

14 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R ストランド情報あり, Ribo-zero + 2) TruSeq Stranded mrna RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA: ug FFPE サンプルに使用可能 対応生物種 : 1. ヒト / マウス / ラット 2. 細胞質 rrna 除去 第 2 鎖 cdna の合成時に dutp を取り込み 第 2 鎖のからの増幅を阻止 LT kit: 24-plex (Kits A B 両方を使用の場合 ) HT kit: 96-plex ハンズオンタイム :8 時間程度 mrna ncrna 14

15 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold ストランド情報あり, Ribo-zero + 2) TruSeq Stranded mrna RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA: ug FFPE サンプルに使用可能 対応生物種 : 1. ヒト / マウス / ラット 2. Gold ( ヒト / マウス / ラット ): ミトコンドリア + 細胞質 rrna 除去 第 2 鎖 cdna の合成時に dutp を取り込み 第 2 鎖のからの増幅を阻止 LT kit: 24-plex (Kits A B 両方を使用の場合 ) HT kit: 96-plex ハンズオンタイム :8 時間程度 mrna ncrna 15

16 RNA-Seq: イルミナ RNA キットの選択 1) TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 ストランド情報に興味がある 2) TruSeq Stranded mrna Sample Prep Kit ncrna にも興味がある 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit 細胞質だけでなくミトコンドリアの rrna も除去したい 3) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero H/M/R 4) TruSeq Stranded Total RNA Ribo-Zero Gold 6) TruSeq Targeted RNA Expression Kit 16

17 17 5) TruSeq Small RNA Kit のワークフロー

18 5) TruSeq Small RNA Sample Prep Kit ストランド情報あり RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA:1 ug 予め 1-10 ug の total RNA から精製した small RNA 高品質 Dicer-Drosha 経路を経ていること 3 / 5 アダプターを独立して結合させるためストランド情報の保持が可能 48-plex (Set A-D を使用した場合 ) ハンズオンタイム : 24 時間程度 Dicer-Drosha 経路を経た microrna 18

19 19 6) TruSeq Targeted RNA Expression Kit のワークフロー

20 6) TruSeq Targeted RNA Expression Kit ストランド情報あり RNAサンプル キットのプロトコル アウトプット データ Total RNA: 50 ng 100 ng, 200 bp 以上の FFPE サンプル ULSO DLSO がそれぞれ結合するのでストランド情報が保持される パネルにカスタム領域を加えることが可能 サンプルは 384-plex まで設定可能 ハンズオンタイム : 4 時間程度 各遺伝子の発現レベル 1 ランにつき 384 サンプルまで測定可能 20

21 Targeted RNA Small RNA Total RNA mrna RNA キット一覧表 Input Protocol Output 情報 Input Total RNA 量 FFPE 対応している生物種 ストランド情報 ハンズオン Plex 数 mrna ncrna Small RNA TruSeq RNA v ug 真核生物 12 時間 24 TruSeq Stranded mrna ug 真核生物 9 時間 96 TruSeq Stranded Total RNA ug ヒト / マウス / ラット 8 時間 96 TruSeq Small RNA 1 ug 指定なし 24 時間 48 TruSeq Targeted RNA Expression 50 ng * ヒト / マウス / ラット 4 時間 384 * FFPE サンプルまたは分解が進んだサンプルの場合は 100ng 21

22 シーケンスサンプル調製キット Kit Selector あなたのアプリケーションに適したサンプル調製キットを探す 2014/03/31 クリックして選びながら進みます イルミナサポートウェビナー ( 22

23 インプット RNA のクオリティ 必要なクオリティ条件 : 1) TruSeq RNA v2 2) TruSeq Stranded mrna 5) TruSeq Small RNA : RIN>8* FFPE サンプルは使用不可 哺乳類に対してのみ 他の生物種については 各文献を参照 : 単離した mrna small RNA サンプルも使用可能 ( ユーザーガイド参照 ) 3), 4) TruSeq Strande Total RNA 各種 6) TruSeq Targeted Expression RNA : FFPE サンプルの使用可能 クオリティチェックの測定方法は? Bioanalyzer で RNA chip を用いて RIN 値を測定 ホルムアルデヒドを含む 1% アガロースゲルを用いた電気泳動後 EtBr で染色してバンドを確認 インプット RNA のクオリティは RNA-Seq では重要なファクターとなる 23

24 インプット RNA のクオリティに基づいたキットの選択 インプット RNA のクオリティの違いによるキットの選択 : 良いクオリティ : いずれのキットも使用可能 悪いクオリティ : TruSeq Stranded Total RNA Kit 各種を推奨 分解が進んだサンプル FFPE サンプル どのキットを選択する場合にでも インプット RNA のクオリティが基準となる インプット RNA のクオリティによって変わる total RNA の必要量 : 良いクオリティ : 100 ng 悪いクオリティ : 100 ng 以上 24

25 調製したライブラリーのクオリティチェックのポイント 調製したライブラリーの Bioanalyzer を用いたクオリティチェック : 断片長の大きさ 想定外のピークはないか? Primer dimer Adapter dimer Bubble product: 問題はない AMPure beads のキャリーオーバー コンタミ : ライブラリーの調製 Bioanalyzer 参照 : イルミナサポートウェビナーシリーズ /10/18 Bioanalyzer を使用した Library QC とトラブルシューティング qpcr を用いたライブラリーの定量 : Qubit & Nanodrop: 正確ではない qpcr: 推奨 参照 : イルミナサポートウェビナーシリーズ /09/28 Bioanalyzer と qpcr を使用したライブラリの定性 定量評価 25

26 Summary 研究の目的 インプット RNA のクオリティによって RNA-Seq のライブラリー調製に用いるイルミナ RNA キットを選択することが可能 - Kit Selector の利用 ランの成功には インプット RNA のクオリティが重要 - Bioanalyzer を用いたインプット RNA の RIN 値の測定 - ホルムアルデヒドを含む 1% アガロースゲルを用いた電気泳動 RNA キットで調製したライブラリーのサイズ確認と定量が重要 - Bioanalyzer を用いた断片長の確認 - qpcr を用いた定量 26

27 サポートウェビナーにご参加いただきありがとうございました 本日のセッション終了後のご質問は で承ります 27