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- あおい のたけ
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1 Dual Index を持つ Library のシーケンサーセットアップ 小林孝史テクニカルアプリケーションサイエンティスト 2012 Illumina, Inc. All rights reserved. Illumina, illuminadx, BaseSpace, BeadArray, BeadXpress, cbot, CSPro, DASL, DesignStudio, Eco, GAIIx, Genetic Energy, Genome Analyzer, GenomeStudio, GoldenGate, HiScan, HiSeq, Infinium, iselect, MiSeq, Nextera, Sentrix, SeqMonitor, Solexa, TruSeq, VeraCode, the pumpkin orange color, and the Genetic Energy streaming bases design are trademarks or registered trademarks of Illumina, Inc. All other brands and names contained herein are the property of their respective owners.
2 Index シーケンシングとはなにか? 解析を行う DNA 断片 (library) の端に 識別のためのインデックスが付加されてある それぞれの DNA 断片がどのサンプル由来か同定が可能 簡単 ということは? サンプルを混ぜて (pooling) 解析して 後でクラスターをそれぞれのサンプルに振り分ければいい (de-multiplex) 多サンプル解析 (multiplex analysis) が可能 必要な作業 試薬は? サンプル調製の際にインデックス配列をつける作業 index 配列を読むためのシーケンスプライマー 解析のためのソフトウェア ( イルミナの製品で全て揃います ) 解析を行う DNA 断片 (Single-index library) の例 イルミナでは矢印の部分がインデックス配列を指します 2
3 Dual-Index シーケンシングとはなにか? インデックス配列を両端に 2 つ持つライブラリを解析する 一つのインデックスを持つもの (Single-Index; 最多 24 サンプル ) よりもたくさんのサンプル (Dual-Index; 最多 96 サンプル ) の多サンプル解析が可能です! ということは? 1 サンプル当たり より経済的に安価に解析が可能です! より具体的には 1 サンプルにつきデータ量がたくさん要らないサンプルについてまとめて多くのサンプルを解析できる 別なサンプル必要なデータ量 : 1Gbases 別なサンプル必要なデータ量 : 1Gbases 必要なデータ量 : 1Gbases MiSeq Output: max 8Gbases 残った部分のデータは実質捨ててしまう 3
4 Dual-Index シーケンシングに用いるライブラリは? 解析を行う DNA 断片 (Dual-index library) の例 P5 Index 2 Index 1 P7 イルミナでは矢印の部分がデュアルインデックス配列を指します Index 1 (i7): P7 配列近傍の 8 塩基 :12 種類 Index 2 (i5): P5 配列近傍の 8 塩基 :8 種類 12 x 8 = 96 種類の組み合わせ Single-index library 4
5 Index 2 Illumina のキットで Dual-Index を使用している製品は? Nextera kit 全般 TruSeq Amplicon 製品 TruSeq HT sample prep kit かんたんに調製が可能 TruSeq Amplicon と Nextera kit では専用のキットが用意されています サンプル調製時 (Nextera/TruSeq Amplicon) に : 96wellプレートの横にindex1の12 個のチューブを並べ 次に縦にindex2の8 個のチューブを並べる それぞれの組み合わせにより96 個のインデックスの組み合わせが可能 Index 1 5
6 Illumina のキットで Dual-Index を使用している製品は? Nextera kit 全般 TruSeq Amplicon 製品 TruSeq HT sample prep kit TruSeq HT kit では Dual-Index の付加したアダプターは 96well プレートで用意しております TruSeq DNA Adapter Plate (DAP) 注意 ) 一般的にキットが異なるとインデックスの配列も異なります 一緒に解析したい場合には サンプルシートの作成などご注意ください 6
7 Illumina のキットで Dual-Index を使用している製品は? ( まとめ ) TruSeq HT Sample Prep Kits - TruSeq DNA HT sample prep kit Dual Index ライブラリ Nextera Sample Prep Kits - Nextera DNA sample prep kit - Nextera XT sample prep kit - Nextera Exome sample prep kit TruSeq Amplicon Kits - TruSeq TSCA sample prep kit - TruSeq Amplicon cancer panel 7
8 Index シーケンスの種類 シングルリードで Single-Index を読む 短いリード 少ないサンプル シングルリードで Dual-Index を読む 短いリード たくさんのサンプル ペアエンドで Single-Index を読む 長いリード 少ないサンプル ペアエンドで Dual-Index を読む 長いリード 少ないサンプル 実際の解析方法は? フローセルの種類によって異なります 8
9 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 9 Flow cell surface
10 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 のシーケンシングプライマーが結合 Index 2 P5 primer Read 1 sequencing primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 10 Flow cell surface
11 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 を解析 (Read1) Index 2 P5 primer Read 1 sequencing primer DNA insert Sequence P7 primer Index 1 P7 grafting primer 11 Flow cell surface
12 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer Read 1 sequencing primer DNA insert Sequence P7 primer Index 1 P7 grafting primer 12 Flow cell surface
13 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 のシーケンシングプライマーが結合 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 P7 grafting primer 13 Flow cell surface
14 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 を解析 (Index1 read) Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 Index 1 read 8 cycles P7 grafting primer 14 Flow cell surface
15 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 read の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 15 Flow cell surface
16 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 Sequencing Primer Index 2 P5 primer Index2 のシーケンシングプライマーを結合 DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 16 Flow cell surface
17 シングルリードのフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index 2 Sequencing Primer Index 2 Index 2 read 8 cycles P5 primer Index2 を解析 ラン終了 DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer 17 Flow cell surface
18 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む 18
19 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 シーケンシングプライマーを結合 Index 2 P5 primer Read1 Sequencing Primer DNA insert P7 primer Index 1 P7 grafting primer P5 grafting primer 19 Flow cell surface
20 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 を解析 Index 2 P5 primer SBS Sequencing Primer DNA insert Sequence P7 primer Index 1 P7 grafting primer P5 grafting primer 20 Flow cell surface
21 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Read1 の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer SBS Sequencing Primer DNA insert Sequence P7 primer Index 1 P7 grafting primer P5 grafting primer 21 Flow cell surface
22 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 のシーケンシングプライマーを結合 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 P7 grafting primer P5 grafting primer 22 Flow cell surface
23 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 を解析 Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Sequencing Primer Index 1 Index 1 read 8 cycles P7 grafting primer P5 grafting primer 23 Flow cell surface
24 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Region complementary to P5 grafting primer Index1 read の伸長鎖を外す Index 2 P5 primer DNA insert P7 primer Index 1 Index 1 read 8 cycles P7 grafting primer P5 grafting primer 24 Flow cell surface
25 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む 保護基を外し フローセル上の P5 grafting primer に結合させる P5 grafting primer 25 Flow cell surface
26 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む 画像を取得しない 7cycle 7 chemistry only cycles P5 grafting primer 26 Flow cell surface
27 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Index2 を解析 フローセル上の DNA 鎖を使用するので (Index2) プライマーは必要ない Index 2-8 cycles 7 chemistry only cycles P5 grafting primer 27 Flow cell surface
28 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む クラスターの再形成を行う ( ブリッジ PCR) Index 2 index read 8 cycles 7 chemistry only cycles P5 grafting primer 28 Flow cell surface
29 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む DNA 鎖を変性する Original strand New strand 29 Flow cell surface
30 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Read1 で用いた鎖を切断し P5 のブロックする New strand 30 Flow cell surface
31 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Read2 シーケンシングプライマーを結合 Read 2 Sequencing Primer 31 Flow cell surface
32 ペアエンドフローセルで Dual-Index を読む Read2 を解析 ラン終了 Read 2 Sequencing Primer Sequence 32 Flow cell surface
33 ここまでのまとめ Dual-Index シーケンシングとは? 2 つのインデックス配列 (Index 1(i7) and Index 2 (i5) ) を持つ Dual Index ライブラリを解析 最も多くて 96 種類の Dual-Index ライブラリが作製できる (12 Index 1 x 8 Index 2) Dual-Index ライブラリは下記のキットで作製可能 TruSeq HT Nextera 各種 TruSeq Amplicon kit. Dual Index の概要 : 33
34 34 HiSeq/Genome Analyzer を使用する場合
35 Dual-Index シーケンスに必要な試薬キット ライブラリ Nextera sample prep kit TruSeq HT sample prep kit サンプル調製キット クラスター 形成 TruSeq Cluster Kit v2 GA TruSeq Cluster Kit v3 HS cbot/cluster generation シーケンス TruSeq SBS Kit v5 GA TruSeq SBS Kit v3 HS HiSeq/GA シーケンス プライマー Dual-Index Sequencing Primer Box Nextera TruSeq HT single flow cell HiSeq/GA 35
36 TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit for Single-Read flow cell FC TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Kit for Paired-End flow cell PE HP10- Read1 sequencing primer mix HP12- Index 1(i7) sequencing primer mix HP9- Index 2 (i5) sequencing primer HP10-Read1 sequencing primer mix HP12- Index 1 (i7) sequencing primer mix HP11- Read2 sequencing primer mix 必要な時 Nextera 各種のキットを使用して作製されたライブラリ Single-Read TruSeq HT flow cell を使用して Dual Index ランを行う場合 TruSeq あるいは Nextera の各種のキットを使用して作製された全てのライブラリに対応 TruSeq と Nextera で作製されたライブラリを同じフローセルの別レーンで解析する場合 36
37 シーケンスプライマーについて Nextera ライブラリ Dual-Index Sequencing Primer Kit が必要 TruSeq HT ライブラリ Dual- Index Sequencing Primer Kit, Single-read flow cell が必要 Single- Read FC Paired-End Read FC Single- Read FC Paired-End Read FC R1:HP10 R1: HP10 R1: HP6/10 R1: HP6/10 I1: HP12 I1: HP12 I1: HP8/12 I1: HP8/12 I2: HP9 I2: grafted P5 I2: HP9 I2: grafted P5 R2: HP11 R2: HP7/11 37
38 シングルリードのランに必要な試薬 IEM を用いた サンプルシート の作成 SBS 試薬の セット Index read 用の試薬のセット それぞれの シーケンス反応 の開始 Single-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3-3.5mls #17: HP8 か HP12 Dual index #19: HT2 #18: Diluted HP3-4mls #17: HP8 or HP12 #16: HP9 38
39 シングルリードのランに必要な試薬 IEM を用いた サンプルシート の作成 SBS 試薬の セット Index read 用の試薬のセット それぞれの シーケンス反応 の開始 Single index #19: HT2 #18: Diluted HP3-3.5mls #17: HP8 or HP12 Dual-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3-4mls #17: HP8 か HP12 #16: HP9 39
40 ペアエンドのランに必要な試薬 IEM を 用いたサンプルシート SBS 試薬のセット Index read に用いる試薬のセット Read1 と Index read sequencing Read2 に使用する試薬のセット Read2 用の SBS 試薬のセット Read2 の sequencing の作成 Single-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3-3.5mls #17: HP8 か HP12 Dual index #19: HT2 #18: Diluted HP3-4mls #17: HP8 or HP12 #10: RMX 40
41 ペアエンドのランに必要な試薬 IEM を 用いたサンプルシート SBS 試薬のセット Index read に用いる試薬のセット Read1 と Index read sequencing Read2 に使用する試薬のセット Read2 用の SBS 試薬のセット Read2 の sequencing の作成 Single index #19: HT2 #18: Diluted HP3-3.5mls #17: HP8 or HP12 Dual-Index #19: HT2 #18: Diluted HP3-4mls #17: HP8 か HP12 #10: RMX 41
42 ペアエンドのランに必要な試薬 IEM を 用いたサンプルシート SBS 試薬のセット Index read に用いる試薬のセット Read1 と Index read sequencing Read2 に使用する試薬のセット Read2 用の SBS 試薬のセット Read2 の sequencing の作成 Single-Index RMX を含めすべての試薬をセット Dual index Prepare PE reagents except RMX 42
43 ペアエンドのランに必要な試薬 IEM を 用いたサンプルシート SBS 試薬のセット Index read に用いる試薬のセット Read1 と Index read sequencing Read2 に使用する試薬のセット Read2 用の SBS 試薬のセット Read2 の sequencing の作成 Single index Prepare RMX along with all other reagents Dual-Index RMX 以外の試薬をセット 43
44 必要な SBS 試薬 HiSeq ランの種類 サイクル数 総サイクル数 SBS Kits (200-cycle) Dual- Indexed Paired-End Dual- Indexed Single- Read SBS kits (50-cycle) (7) * 93+8+(7) * 76+8+(7) (7) (7)
45 必要な SBS 試薬 HiSeq ランの種類 サイクル数 総サイクル数 SBS Kits (200-cycle) Dual- Indexed Paired-End Dual- Indexed Single- Read SBS kits (50-cycle) (7) * 93+8+(7) * 76+8+(7) (7) (7)
46 HCS を使用しての Recipe の作成 46
47 Recipe の互換性 - GA ランの種類 Non-Indexed Single-Read Single-Indexed Single-Read Recipe GA2_151Cycle_SR_v10 GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library Dual-Indexed Single-Read Non-Indexed Paired-End Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_SR_v10(px) GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px) GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_v10(px)- dual-indexed library Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_PE_v10(px) Single-Index ライブラリ : recipe v8.5 Index 無しのライブラリと Dual-Index ライブラリ : recipe v10 47
48 Recipe の互換性 - GA ランの種類 Non-Indexed Single-Read Single-Indexed Single-Read Recipe GA2_151Cycle_SR_v10 GA2-PEM(2X)_MP_151+7Cycle_SR_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_151+8Cycle_SR_v10(px)- dual-indexed library Dual-Indexed Single-Read Non-Indexed Paired-End Single-Indexed Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_SR_v10(px) GA2-PEM(2X)_2x151Cycle_v10(px) GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_v8.5(px)- single-indexed library GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_v10(px)- dual-indexed library Dual-Index Paired-End GA2-PEM(2X)_MP_ Cycle_PE_v10(px) Single-Index ライブラリ : recipe v8.5 Index 無しのライブラリと Dual-Index ライブラリ : recipe v10 48
49 サンプルシートの作成 - HiSeq/GA Illumina Experiment Manager (IEM; 最新版は version1.4) を使用しての サンプルシートの作成をお薦めしております. CASAVA で解析を行うためには必ずサンプルシートの作成が必要です サンプルシートが作成されていれば index 配列の情報がラン中に閲覧することが出来ます CASAVA 49
50 ソフトウェアの互換性 Platform Control software * Analysis * Sample sheet * HiSeq1000/2000 HCS1.5 CASAVA1.8.2 Illumina Experiment Manager 1.2 Genome Analyzer SCS2.10 CASAVA Illumina Experiment Manager 1.2 MiSeq MCS1.2 MiSeq Reporter 1.1 Illumina Experiment Manager 1.2 Sequencing primers # TruSeq dual Index sequencing primer kit TruSeq dual Index sequencing primer kit -- * このバージョンより新しいもの # Nextera 由来のライブラリと Single-Read TruSeq HT flow cells を使用する場合に必要 50
51 まとめ シーケンスプライマー : Nextera ライブラリ あるいは Single-Read TruSeq HT flow cell を使用の場合 : Dual-Index sequencing primer box (SR: FC ; PE: PE ) が必要 Paired-End TruSeq HT flow cell: クラスターキット内の sequencing primer を使用 装置と解析用のソフトウェアのアップデートを忘れずに Index read 用の試薬 : SBS 試薬 たとえば HiSeq で 2x100 dual index のランを行う場合には 23 cycles (8+7+8) 分を考慮して 50 cycle kits を 4 キット用意する必要が有ります レシピ (HiSeq) HCS1.5 を使用される場合は Single-Read HT2 Diluted HP3 HP8/HP12 HP9 Paired-End HT2 Diluted HP3 HP8/HP12 RMX 7 塩基のインデックス配列を読む場合には TruSeq multiplex sequencing primer box を 8 塩基のインデックス配列を読む場合には TruSeq Dual-Index sequencing primer Kit を使用する (GA) Dual-Index ライブラリを解析するには GA recipe v10 を使用する 51
52 52 MiSeq を使用される場合
53 Dual-Index シーケンスのワークフロー Nextera TruSeq Amplicon TruSeq HT P5 Index 2 Rd1 seq primer Insert Index 1 P7 Rd2 seq primer 53
54 必要な Sequencing Primer TruSeq Dual-Index Sequencing Primer Box (FC , PE ) は MiSeq を使用される場合には必要ございません! (MiSeq カートリッジに必要なプライマーがすべて入っている ) MiSeq のフローセルは Paired-End のみです そのため カートリッジには HP09(index2 プライマー ) がありません Position Reagent Name Description 12 HP10 Read 1 Primer Mix 13 HP12 Index 1 Primer Mix 14 HP11 Read 2 Primer Mix 54
55 サンプルシートの作成 Illumina Experiment Manager (IEM) を使用します MiSeq の OS である MCS (MiSeq Control Software) は ランの種類 や サイクル数 についてサンプルシートを参照する設定になっておりますので サンプルシートはすべてのランに必要になります Index 配列の入力フォーマットは CASAVA と MCS で異なるので注意 MiSeq CASAVA 55
56 MiSeq を使用する際のまとめ Dual-Index シーケンスに必要なプライマーは MiSeq のカートリッジに標準装備されています サンプルシートはそれぞれのランに対して用意します Illumina Experiment Manager (IEM; 現行 version 1.4) を使用してサンプルシートを作成します (MyIllumina からダウンロード可能 ) 56
57 57 Sequencing Primers について
58 HiSeq1000/2000 Genome Analyzer MiSeq Sequencing Primers について ( まとめ ) TruSeq HT Nextera TruSeq Amplicon MiSeq reagent kit TruSeq HT Single-Read Paired-End TruSeq Sequencing primer box for SR PE cluster kit v3 TruSeq Sequencing primer box for PE Nextera Single-Read Paired-End TruSeq Sequencing primer box for SR TruSeq Sequencing primer box for PE 58
59 よくあるご質問リスト ペアエンドフローセル ペアエンドライブラリを用いて Dual Index のシングルリードを行うことは出来ますか? Read2 のサイクル数を 0 に設定すれば可能 その場合は Index2 を解析した時点で終了します Sequencing Analysis Viewer (SAV) で Index read の結果が見られないのはなぜですか? ランを開始する前にサンプルシートが必要です SAV v1.8 以上のバージョンがインデックス情報を得るのに必要です Dual-Index シーケンシングで RMX が使用されるのはいつですか? ペアエンドのランには RMX は Index 2 (i5) Read の際に必要です Read 2 では必要ではありません 現行の TruSeq Dual-Index Primer Kit はすべての TruSeq ライブラリに対応していますか? 昔 Epicentre 社より販売されていました Nextera kit にも対応していますか? TruSeq Dual Index primer kit は Illumina Nextera primers に加えすべての TruSeq ライブラリに対応していますが 昔販売されていました Epicentre の Nextera kit には対応しておりません 59
60 Dual Indexing FAQs Dual-Index のインデックスランでも Single-Index の場合と同様に補正のための 1 サイクルが必要になりますか? No, 6 塩基 (+ 補正 1 塩基 ) の Single-Index に比べて Dual-Index は 8 塩基の配列になるので補正のサイクルが必要になりません Dual-Index シーケンシングでは通常のシーケンシングに比べてどれだけの時間がかかりますか? HiSeq で v3 SBS reagents と v3 flow cell を使用される場合 それぞれのサイクルごとに 53 分 ( 計 16 サイクル (8+8)) とペアエンドの場合はケミストリーオンリーの 7 サイクルに 2 時間かかるので 通常の HiSeq ランに比べて ~16 時間ほど必要です Illumina Dual-Index ライブラリはほかのライブラリと同一レーンで解析可能ですか? No, ですが同じフローセルで解析することは可能です その際は TruSeq Dual- Index Sequencing Primer kit を必ずご使用ください また その際は Illumina PhiX control library のスパイクインをお試しください 60
61 ご清聴ありがとうございました ご質問は でも承ります 61
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