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ゆみかおおはし
5 years ago
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1 日本臨床細胞学会関東連合学術集会 2012 年 9 月 8 日高崎呼吸器細胞診検体の液状化処理と非小細胞肺癌の診断治療のための遺伝子解析中西陽子 1 関利美 2 根本則道 1,2 1 日本大学医学部病態病理学系病理学分野 2 日本大学医学部附属板橋病院病理診断科

2 肺癌診療における細胞診の重要性検診における早期癌の発見生検困難手術適応のない進行肺癌の診断 LBC の活用 :ThinPrep2000( オリンパス ) 標本作製以外に残余検体の保存が可能標的細胞を含む貴重な検体免疫染色遺伝子発現解析遺伝子変異解析診断治療への情報提供

3 肺癌診療に求められていること細胞診の役割良性悪性非腫瘍腫瘍小細胞癌非小細胞癌肺癌薬物療法の進歩治療感受性副作用の予測に基づく厳密な治療法選択 EGFR 遺伝子変異 ALK 融合遺伝子腺癌扁平上皮癌大細胞癌その他細胞形態とともに細胞が持つ分子レベルの情報

4 LBC 免疫染色肺癌の組織型鑑別日本肺癌学会肺癌診療ガイドライン肺癌の病理細胞診断ガイドライン 2011 年 6 月より抜粋

5 TTF-1 CK7 CK18 CEA ThinPrep 法擦り合わせ法 Calretinin WT1 CK14 ThinPrep 法擦り合わせ法肺腺癌すべて第 51 回日本肺癌学会総会ワークショップ

6 カクテル抗体による免疫染色抗体 :NSCLC Cocktail Core Kit ( ハソロシー研究所 ) ADCC Cocktail 抗体 TTF-1, NapsinA SqCC Cocktail 抗体 P63, CK14 肺腺癌 ThinPrep 標本 (6 か月保存 ) ( 400) TTF-1 陰性肺腺癌 ThinPrep 標本 (3 か月保存 ) ( 400) 6 第 49 回日本臨床細胞学会秋季大会

7 LBC 免疫染色染色性に問題ない ThinPrepで塗沫したプレパラートは賦活処理も可能 6か月程度保存(4 ) しても染色可能ただし肺癌組織型鑑別には複数の染色が必要細胞数が少ない場合は困難 (LBCに限らず)

8 LBC 遺伝子発現解析による肺癌の組織型鑑別少数細胞から一度に多数の解析可能

9 LBC とレーザーマイクロダイセクション一層の細胞を顕微鏡下で観察しながら異型細胞を回収検体保存液に浮遊させた細胞検体を自動塗沫 ThinPrep2000( オリンパス ) PALM MBⅢ-N(ZEISS) 組織細胞化学

10 胸水 10 症例の遺伝子発現解析 ThinPrep 標本レーサーマイクロタイセクションリアルタイム RT-PCR 症例 7: 胃癌の転移症例 8: 肺扁平上皮癌その他 : 肺腺癌 1 種類のマーカーでは鑑別困難性別年齢病期細胞診 1 M 65 4 Class V AC 2 M 78 3B Class V AC 3 M 61 3B Class V AC 4 M 77 4 Class V AC 5 F 86 4 Class V AC 6 M 69 3B Class V AC 7 M 64 4 Class V AC 8 M 80 3B Class III 9 M 80 3B Class V Ca 10 F 75 3B Class V AC 症例内因性コントロール腺癌扁平上皮癌転移性悪性中皮腫 CK7 CK18 TTF-1 CEA CK6 CK14 CK20 WT1 Calretinin

11 LBC 遺伝子発現解析肺癌の組織型鑑別少数の細胞から一度に多数の標的分子を解析できる免疫染色の結果を予測できる可能性複数年保存した ThinPrep 検体でも細胞の同定が可能であれば解析できる細胞量少なく診断困難な症例に有用

12 LBC EGFR 遺伝子変異解析肺腺癌における EGFR-TKI 治療感受性予測進行肺癌では細胞診検体のみの場合あり迅速高感度正確な評価結果が求められる偽陰性の回避右 :Thinprep2000( オリンパス ) 左 :i-densy TM 5310 (ARKRAY) 細胞同定の重要性

13 方法 -QP 法 - 沈渣沈渣 i-densy TM IS-5310 ( アークレイ ) 1-2mL 腫瘍細胞確認沈渣細胞沈渣 DNA 溶液を分注沈渣 L858R(exon 21) EGFR-TKI 感受性 exon19 deletion EGFR-TKI 感受性 T790M(exon 20) EGFR-TKI 耐性 KRAS codon12,codon13 BRAF V600E 試薬パックチップ反応チューブを装置にセットしスタート

14 EGFR 遺伝子変異解析 QP 法による結果と DNA ダイレクトシーケンス法による解析結果 QP 法 EGFR 遺伝子野生型 (WT) EGFR 遺伝子変異型 (L858R) EGFR 遺伝子変異型 (exon19 欠失 ) EGFR 遺伝子変異型 (T790M) Exon 21 L858R Exon 19 deletion Exon 20 T790M DNA ダイレクトシーケンス法 Exon 21 L858R Exon 19 E746V, L747-S752 del Exon 19 E746-A750 del Exon 20 T790M 第 101 回日本病理学会総会

15 胸水 ( 腫瘍細胞多数 ) 胸水 ( 腫瘍細胞多数 ) DNA 抽出不要検体採取から結果の評価まで約 90 分胸水 ( 腫瘍細胞少数 ) 気管支洗浄液 ( 腫瘍細胞少数 ) DNA 抽出必須マイクロタイセクション細胞転写法

16 検体 EGFR 変異 QP 法 Clamp 法胸水 N= 歳 (51-86) M:F 17:8 気管支洗浄液 N= 歳 (48-75) M:F 8:2 細胞診検体からの EGFR 遺伝子変異解析結果変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M 野生型非腫瘍腫瘍 DNA 抽出後変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M 野生型非腫瘍腫瘍 DNA 抽出後 /19 19/ /1 7/8 8/ / /7 シーケンス法細胞診 Ⅳ:1,Ⅴ:4 Ⅲ:1 Ⅳ:1,Ⅴ:18 Ⅴ:1 Ⅱ:1 Ⅲb:1,Ⅳ:1,Ⅴ:6 DNA 量 (ng/μl) ±330.0 検出限界 DNA 量 0.1ng/μL 40.8 ± ng/μL 第 101 回日本病理学会総会

17 剥離した細胞診検体 ( パパニコロウ標本 ) からの EGFR 遺伝子変異解析結果検体 EGFR 変異 QP 法 Clamp 法シーケンス法細胞診 DNA 量 (ng/μl) 検出限界 DNA 量胸水 46, F 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M Ⅴ ng/μL 気管支擦過細胞 67, F 変異型 Exon19deletion Exon21 L858R Exon 20 T790M Ⅴ ng/μL 胸水 ( ギムザ染色 ) 気管支擦過細胞 ( ギムザ染色 ) 第 101 回日本病理学会総会

年齢性細胞診クラス QP 法 +Tm 解析 PCR clamp 法シーケンス法治療胸水 ( 細胞沈渣 ) 1 65 M Ⅴ L858R L858R L858R ケフィチニフ ( 継続中 ) 2 78 M Ⅴ WT WT 3 61 M Ⅴ WT WT 4 77 M Ⅴ WT WT 5 86 F Ⅴ WT WT 6 69 M Ⅴ WT WT 7 64 M Ⅴ WT WT 8 80 M Ⅴ

L858R L858R ヘメトレキセト ( 継続中 ) 16 85 F Ⅴ WT WT 17 67 M Ⅴ WT WT 18 64 M Ⅴ L858R L858R L858R ケフィチニフ ( 継続中 ) 19 51 F Ⅴ WT WT 20 68 F Ⅴ WT WT 21 66 M Ⅴ WT WT 22 78 M Ⅴ WT WT 23 73 M Ⅴ WT WT 24 56 M Ⅳ WT

18 年齢性細胞診クラス QP 法 +Tm 解析 PCR clamp 法シーケンス法治療胸水 ( 細胞沈渣 ) 1 65 M Ⅴ L858R L858R L858R ケフィチニフ ( 継続中 ) 2 78 M Ⅴ WT WT 3 61 M Ⅴ WT WT 4 77 M Ⅴ WT WT 5 86 F Ⅴ WT WT 6 69 M Ⅴ WT WT 7 64 M Ⅴ WT WT 8 80 M Ⅴ WT WT 9 80 M Ⅴ WT WT F Ⅴ L858R L858R L858R ケフィチニフ F Ⅴ L858R,T790M L858R,T790M L858R,T790M ケフィチニフ ( 耐性化憎悪し死亡 ) F Ⅴ UD WT( 生検 ) F Ⅴ WT WT M Ⅴ WT WT M Ⅳ L858R L858R L858R ヘメトレキセト ( 継続中 ) F Ⅴ WT WT M Ⅴ WT WT M Ⅴ L858R L858R L858R ケフィチニフ ( 継続中 ) F Ⅴ WT WT F Ⅴ WT WT M Ⅴ WT WT M Ⅴ WT WT M Ⅴ WT WT M Ⅳ WT WT M Ⅲ WT ND 気管支洗浄液 ( 細胞沈渣 ) 1 48 M Ⅴ WT WT 2 57 M Ⅴ WT WT 3 67 M Ⅱ WT ND 4 55 F Ⅴ WT WT 5 75 F Ⅳ WT WT 6 70 M Ⅴ WT WT 7 67 M Ⅴ ex19del ex19del ex19del Ope トセタキセル+カルホフラチン ( 継続中 ) 8 73 M Ⅴ WT WT 9 69 M Ⅴ WT WT M Ⅲb WT ND 細胞転写法による過去のパパニコロウ標本 ( 精製 DNA) 1 67 F Ⅴ exon19del exon19del exon19del ヘメトレキセト +カルホフラチンヘメトレキセトエルロチニフ ( 継続中 ) 2 46 F Ⅴ ex19del,t790m ex19del,t790m ex19del,t790m ケフィチニフエルロチニフ ( 憎悪し死亡 ) パラフィン包埋組織 ( 精製 DNA) 1 75 F L858R L858R L858R ケムシタヒンケフィチニフ ( 合併症あり憎悪し死亡 ) 2 80 M WT UD WT 3 67 F ex19del ex19del ex19del ケフィチニフ ( 継続中 ) 4 67 F ex19del ex19del ex19del ヘメトレキセト +カルホフラチンヘメトレキセトエルロチニフ ( 継続中 ) 5 85 M ex19del ex19del ex19del BSC ( 経過観察中 ) 6 75 M L858R L858R L858R トセタキセル ( 継続中 ) EGFR 遺伝子変異は各法で同様に検出野生型症例でパラフィン組織 1 例 clamp 法で検出不可も本法シーケンス法では検出可能感受性変異陽性例 13 例中 EGFR-TKI 治療 7 例 5 例は奏功し継続中 2 例は耐性化後死亡 T790M 変異第 52 回日本肺癌学会総会

QP 法を用いた KRAS および BRAF 遺伝子変異解析進行肺癌症例 (2009-2010stage ⅢB, Ⅳ) 生検のパラフィン切片 : 49 例細胞検体 : 18 例 i-densy( アークレイ ) を用いた QP 法と Tm 解析により KRAS codon12,codon13 遺伝子 BRAF V600E 遺伝子の変異解析その他 38.

19 QP 法を用いた KRAS および BRAF 遺伝子変異解析進行肺癌症例 ( stage ⅢB, Ⅳ) 生検のパラフィン切片 : 49 例細胞検体 : 18 例 i-densy( アークレイ ) を用いた QP 法と Tm 解析により KRAS codon12,codon13 遺伝子 BRAF V600E 遺伝子の変異解析その他 38.9% BRAF 変異 4.1% KRAS 変異 22.4% EGFR 変異 34.6% EGFR 変異群 KRAS 遺伝子変異 Codon 12-Ser: tagtggc Codon 12-Asp: tgatggc KRAS or BRAF 変異群 Log-rank p=0.06 その他の群 Log-rank p=0.02 第 101 回日本病理学会総会

20 LBC EGFR 遺伝子変異解析肺腺癌における EGFR-TKI 治療感受性予測迅速簡便省スペースなどの技術開発により右 :Thinprep2000( オリンパス ) 左 :i-densy (ARKRAY) ベッドサイド分子細胞診断 One-day 分子細胞診断治療に直結する細胞診第 50 回日本臨床細胞学会秋季大会

21 LBC ALK 融合遺伝子の検出肺腺癌 ALK 融合遺伝子陽性クリゾチニブ治療感受性

22 ALK 肺癌患者の胸水パパニコロウ /HE ニチレイ ALK 検出キット摺合せ Abcam ALK(5A4) 1/50 + DAKO FLEX Linker Thinprep Thinprep セルブロック

23 肺癌診療における細胞診の役割 LBC を活用した組織型鑑別 EGFR 遺伝子変異解析 ALK 融合遺伝子変異解析今後分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC Thinprep 法の活用が期待される今後細胞診技術に求められること適切な検体採取 ( 形態や分子のダメージを減らす ) 適切な検体保存 ( あらたな治療標的分子の解析 )

24 肺癌診療における細胞診の役割 LBC を活用した組織型鑑別 EGFR 遺伝子変異解析 ALK 融合遺伝子変異解析今後分子標的薬の開発と共にさらに増える可能性 LBC Thinprep 法の活用が期待される今後細胞診技術に求められること適切な検体採取 ( 形態や分子のダメージを減らす ) 適切な検体保存 ( あらたな治療標的分子の解析 )

Bethesda system

Bethesda system 第 26 回日本臨床細胞学会関東連合会学術集会シンポジウム新しい細胞診技術による診断精度の向上と臨床支援 LBCを用いた分子病理診断の現状と可能性東海大学医学部付属病院病理検査技術科 1) 東海大学医学部基盤診療学系病理診断学 2) 伊藤仁 1), 小山田裕行 1), 古田島繁美 1), 加戸伸明 1), 宮嶋葉子 1) 芹澤昭彦 1), 井野元智恵 2), 梶原博 2), 中村直哉 2) 平成