免疫組織化学染色

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1 免疫組織化学染色

2 平成 28 年度免疫組織化学サーベイ報告 免疫組織化学染色 (Ki-67) はじめに Ki-67は ヒトKi-67と特異的に反応し 休止期 (G0 期 ) を除く細胞周期の全周期 (G1 期 S 期 G2 期 M 期 ) で発現している核蛋白である 正常組織 腫瘍組織いずれも細胞増殖周期に入っている細胞に反応が見られる また 乳癌 大腸癌 乏突起膠腫 星状細胞腫など多くの腫瘍においては 化度 血管侵襲およびリンパ節転移といった腫瘍の悪性度や予後とよく相関することが知られており 細胞増殖マーカーとして非常に有用である よって精度管理を行うことは医療機関として重要な責務だと考える 材料および実施方法 今回使用した検体は乳腺腫瘍部と子宮頸部 ( 手術材料 ;10% ホルマリン液固定 ) を薄切し 同一標本上に載せた 室温で1 時間乾燥させたものを2 枚配布し各施設で染色していただいた なお 染色工程により染色結果に差異が生じると思われたので 所定の記入用紙を添付し 各施設で現在行っている方法の記入もお願いした また 一次抗体販売メーカーに同一標本を染色していただき その染色性を判定の基準として使用とした 判定方法 下記の事項を基準に判定した 1 目的とする細胞 部位が染色されていること 2 染色ムラや非特異反応がないこと 以上の項目について判定者は 兵臨技 病理細胞検査研究班解析委員と柳田絵美衣技師 ( 神戸大学附属病院病理部 ) で行い 病理医の立場から 伊藤智雄先生 ( 神戸大学附属病院病理部 ) にご確認頂いた 判定基準は 可. 診断上支障のない標本 否. 診断上支障をきたす標本 として 慎重なる評価判定を行った 結果 < 集計にあたって> 1) 申し込み施設 34に対し 回収 34 施設 (100%) であった 昨年のD2-40の参加 31 施設に比べ3 施設増加した < 集計結果 > Ki-67 染色についての集計結果は別表に示すごとくである また 日常業務でのKi-67 染色についても記載している

3 染色の判定結果および講評評価平成 28 年度の免疫染色サーベイではKi-67をテーマに染色 評価をおこなった 参加施設は34 施設で 参加メーカーはDako 社 Roche 社 Leica 社 ニチレイ社の4 社 各施設で使用した一次抗体メーカーの染色性と見比べ 染色強度や陽性率 非特異的反応 切片の剥離について メーカーの染色性と遜色ない染色性であった施設を A メーカーの染色性よりも弱いまたは強い 切片の剥離 細胞形態の異常がみられた施設は B とし 総合的評価をおこなった 今回の評価結果は A が18 施設 B が16 施設となり 約半数がBとの結果となった Dako 社の一次抗体を使用している施設が最も多く19 施設 Roche 社の一次抗体を使用している施設は 8 施設 次いでニチレイ社は6 施設 Leica 社は1 施設であった 染色対象は乳腺と子宮頸部であり 乳腺では癌部で高い陽性率を示し 子宮頸部では正常の上皮部で陽性細胞が確認できるものを使用した メーカー間での染色では 乳癌では同等の陽性率となり 子宮頸部の正常部においてメーカー間で差異が認められた 自動染色装置で染色した施設と 用手法で染色した施設間で違いが見られたのは 切片の剥離であり 用手法での抗原賦活を行っている施設の剥離が著しい結果となった 自動染色装置は標本を置く金属板に熱が加わるが 用手法での賦活化では温浴 MW オートクレーブ 圧力鍋全てにおいて 液中に気泡が発生するため切片が傷害を受けると考えられる また 用手法での2 施設では非特異な反応による切片の色づきが確認できた これは 抗原賦活化が強すぎるために起きたものと推測される さらに 別の2 施設では 細胞の溶解が見られ陽性像の評価が困難であった これも 賦活化処理が強すぎるためと考えられる これらの場合 抗原賦活化の時間を短くすること 賦活液のpH 調整で解決できると思われる 用手法で染色を行った施設の中には カウンター染色が強すぎる施設があった Ki-67は核内抗原であり カウンター染色が強すぎる場合 DABの陽性像が確認しにくくなるので カウンター染色の強度も考慮して染色してもらいたい 総合的見解として 使用した一次抗体のメーカーと染色に用いた自動染色装置のメーカーが同じであった施設では 相対的に良好な結果となっている メーカー推奨の抗体希釈倍率 反応時間と自動染色装置の推奨プログラム通り染色を行えば 無論理想の染色結果となる 一次抗体と自動染色装置のメーカーが異なる または 用手法で染色する場合は 一次抗体のデータシートをよく読み 一次抗体に最も適した条件で自動染色装置のプログラムを行うまたは 用手法のプロトコールを設計する必要がある 参加施設の判定結果 ( ランク総数 ) は ( 表 1) に示し 染色の評価は下記のごとくである ( 表 2)

4 参加施設の判定結果 ( ランク総数 )( 表 1) 判定 可. 診断上支障のない標本否. 診断上支障をきたす標本 標本数 34 0 (%) 100% 0% 目的とする細胞 部位が染色され 判定に影響のある染色ムラや可非特異反応が見られない 病理診断をするにおいて差し支えのな診断上支障のない標本い標本である 目的とする細胞 部位が染色されていない または判定に影響の否ある染色ムラや非特異反応が見られる 診断上支障をきたす標本診断上支障をきたす標本である 結語 Ki-67 染色の精度管理における結果は 診断上支障のない標本 と判定されたのが 34 施設中 34 施設 (100%) という満足な結果が得られた ( 文責 : 病理細胞検査研究班 精度管理解析 編集委員 )

5 平成 28 年度 ( 第 36 回 ) 兵臨技臨床検査精度管理 免疫染色検査報告書 ( 表 2) 施設番号 判定子宮頸部乳腺腫瘍部評価 備考 可 可 B 若干弱い陽性 可 可 A 可 可 A 可 * 可 * B 細胞融解 非特異反応 剥離 賦活に問題あり 可 可 A 剥離あり 可 可 B 若干非特異あり 可 可 B 剥離あり 可 可 A 剥離あり 可 可 A 可 可 B 若干弱い陽性 染色ムラ 可 可 B 非特異反応あり 可 可 A 可 可 A 可 可 A 可 可 B 剥離あり 子宮頸部弱い陽性 可 可 B 若干の染色ムラ 可 可 A 可 可 A 可 可 A 扁平上皮の陽性率高い 可 可 B 若干弱い陽性率 可 可 B 若干弱い陽性率 可 可 B 扁平上皮の陽性率高い 可 可 A 剥離あり 可 可 B 若干弱い陽性率 若干の染色ムラ 可 可 A カウンター染色強め 可 可 B 剥離あり 弱い陽性率 可 可 A 剥離あり 若干の染色ムラ 可 可 A 可 可 A 可 * 可 * B 細胞融解 非特異反応 剥離 賦活に問題あり 可 可 B 剥離あり 可 可 A 可 可 A 剥離あり 可 可 B 弱い染色率 判定 診断に影響の無いものは 可 とする 可 * は診断には影響は無いが 注意が必要な場合

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7 Ki-67 染色についての集計 1. 貴施設では 1 ヶ月何枚位 Ki-67 染色をしていますか 染色枚数 % 10 枚以下 % 11~30 枚 % 31~50 枚 2 6 % 51 枚以上 7 21 % 2. 何 μm で薄切していますか 厚さ (μm) % % ~ % ~ % ~5 2 6 % 3. 今回貴施設で行った方法を下記の欄に具体的に記入して下さい (1) 染色方法 染色方法 % 自動染色装置 % 用手法 7 21 % 染色機器 % VENTANA( ロシュ ) % Leica 6 22 % ニチレイ 1 4 % ロシュ ベンチマーク XT:9 施設 GX:4 施設 ULTRA:4 施設 LT:2 施設 記載なし :1 施設 ライカ BOND MAX:5 施設 BOND Ⅲ:1 施設 ニチレイ HISTOSTAINER 36A:1 施設 (2) 使用試薬 一次抗体 メーカー名 自動染色 用手法 合計 Dako % VENTANA % ニチレイ % Novocastra (Leica) % 記載無し % Dako 抗ヒト Ki-67 マウスモノクローナル抗体 (MIB-1) 抗ラット Ki-67 マウスモノクローナル抗体 (MIB-5) VENTANA Ki-67 ウサギモノクローナル抗体 (30-9) ニチレイ 抗 Ki-67 ウサギモノクローナル抗体 (SP6) Novocastra Ki-67(MM-1) %

8 二次抗体 発色基質 メーカー名 自動染色 用手法 合計 ニチレイ 二次抗体 : 発色 : ニチレイ ユニバーサルキット : 施設 ユニバーサルキット : 施設 記載なし : 施設 ニチレイ ヒストファインシンプルステイン ヒストファイン 基質キット : 施設 : 施設 +ニチレイ キット ポリマー試薬 ヒストファイン 基質キット (3) 染色プロトコール 抗原賦活化 抗原賦活化 するしない 自動染色 用手法 抗原賦活化方法 賦活装置 緩衝液名 緩衝液 処理温度処理時間 自動染色 染色装置 染色装置 ニチレイ染色装置 ヒストファイン抗原賦活液 ~ 記載なし 室温 用手法 電子レンジ ウォーターバス ヒストファイン抗原賦活液クエン酸緩衝液ヒストファイン抗原賦活液 回 オートクレーブ ヒストファイン抗原賦活液

9 一次抗体 染色法 一次抗体メーカー 一次抗体希釈倍率 反応温度 反応時間 希釈済み 希釈済みを 倍 室温 ~ 倍 記載なし 記載なし 記載なし 希釈済み 希釈済みを 倍 記載なし 記載なし 記載なし 希釈済み 室温 倍以上 室温 記載なし 記載なし 記載なし 倍 室温 ニチレイ ニチレイ 希釈済み 室温 用手法 ニチレイ 倍 室温 希釈済み 室温 希釈済みを 倍 室温 二次抗体 染色法 二次抗体メーカー 反応温度 反応時間 室温 記載なし 記載なし 室温 ニチレイ ニチレイ 室温 用手法 室温 ニチレイ 室温 発色基質 染色法 二次抗体メーカー 反応時間 記載なし ニチレイ ニチレイ 用手法 日常業務での ~ ニチレイ染色についての集計

10 1. 固定液 固定液の種類 % ホルマリンホルマリン ( 濃度記載なし ) % 中性緩衝ホルマリン % 中性緩衝ホルマリン % 中性緩衝ホルマリン中性緩衝ホルマリン ( 濃度記載なし ) マスクドホルム 2. 採取から固定までの時間 3. 固定時間 時間直ちに以内以内以内時間以内時間以内不明記載なし 固定時間時間以上時間以内時間以内時間以上時間以内時間以内時間以内時間以内 4. コントロールの有無 ありなし 自動染色用手法 コントロールの材料 材料マルチコントロール扁桃虫垂リンパ節胃癌細胞 ( 肺 大腸 ) 過去に陽性であった検体

11 5. 染色のコツがあれば記入してください 用手法 各反応時間を厳守する 賦活化処理後はスムーズに染色を行う ( 処理中に次の工程で使用する試薬を室温に戻しておく ) 抗体は蓋をしっかり閉め タッパに入れて冷蔵保存する 自動染色装置 コーティングガラスを使用する 染色装置のメンテナンス 染色前にポンプ処理をし 液の吐出を確認する ガラスの撥水を抑制するために 開始前にスキムミルクにつける 一次抗体の最適濃度をしっかり検討する ヘマトキシリンは自家製のものを使用している 6. 日常業務の免疫組織化学での悩みなどあればご記入してください 用手法 コントロールが入手できていない一次抗体の免疫染色 背景の非特異染色がやや強い 骨髄液で p53 を染めると背景が染まりやすくなる 自動染色装置 撥水防止にスキムミルクに入れているが 撥水が原因と思われる染色不良が起こることがある 撥水を完全に防止するにはどうすればよいか 抗体の管理方法をどうすればよいか 染色頻度が少ない抗体は期限内に使い切れないことがある 一次抗体の種類が多く 管理が難しい スライドガラスはどれが良いか教えてほしい コントロールの確保 管理をどうすればよいか 一次抗体のメーカーを選定する際 二次抗体との相性を検討する必要があり サンプル提供してくれるメーカーでないと購入対象にできない

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