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よしおえいさか
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1 論文表面科学 Vol. 35, No. 7, pp , 2014 クラスター SIMS 法による脂質分子の高感度検出とイメージングへの応用藤井麻樹子 1 宍戸理恵 2 鳥居聡太 3 中川駿一郎 3 瀬木利夫 3 4 青木学聡鈴木茂 2 1 松尾二郎京都大学大学院工学研究科附属量子理工学教育研究センター 2 東北大学多元物質科学研究所 3 京都大学大学院工学研究科原子核工学専攻 4 京都大学大学院工学研究科電子工学専攻京都府宇治市五ヶ庄宮城県仙台市青葉区片平 2 丁目京都府宇治市五ヶ庄京都府京都市西京区 (2014 年 3 月 14 日受付 ;2014 年 4 月 16 日掲載決定 ) Highly Accurate Lipid Analysis and Imaging Mass Spectrometry with Cluster SIMS Makiko FUJII 1, Rie SHISHIDO 2, Sota TORII 3, Shunichiro NAKAGAWA 3, Toshio SEKI 3, Takaaki AOKI 4, Shigeru SUZUKI 2 and Jiro MATSUO 1 1 Quantum Science and Engineering Center, Kyoto University, Gokasho, Uji, Kyoto Institute of Multidisciplinary Research for Advanced Materials, Tohoku University, Katahira, Aoba-ku, Sendai, Miyagi Department of Nuclear Engineering, Kyoto University, Gokasho, Uji, Kyoto Department of Electronic Science and Engineering, Kyoto University, Nishikyo-ku, Kyoto (Received March 14, 2014 ; Accepted April 16, 2014) In recent years, the analysis of biological samples has been extensively performed in pharmacokinetic and metabolic studies. The use of Secondary Ion Mass Spectrometry (SIMS) with conventional monomer ion beams, such as Ar +,Cs + or Ga +, in biological applications is difficult because of the low secondary ion yield of large organic molecules and the complicated fragment ion signals. The use of cluster ions as primary projectiles in SIMS has spread dramatically in the past decade. Bismuth (Bi) cluster ions are now the most familiarized primary ions in cluster SIMS because of the high convergence property and the high molecular ion yield. Argon gas cluster ion beam (Ar-GCIB) is also one of the most attractive primary projectiles for biological application because of the soft sputtering without damage accumulation. However, our knowledge of detection limit and sensitivity is still insufficient for the practical analysis of complex biological samples with cluster SIMS. In addition, imaging mass spectrometry with high spatial resolution is crucially essential for tissue and cell analysis. In this study, lipid standard samples were measured in order to examine the detection limit and the spatial resolution of our Ar-GCIB SIMS, and the results were compared with those of the commercial Bi cluster SIMS. The results indicated that Ar-GCIB SIMS has a capability to obtain the valuable information in biological analysis, however, the improvement on spatial resolution and sensitivity is still required. KEYWORDS : cluster SIMS, Bi cluster, Ar-GCIB, lipid, imaging mass spectrometry 1. 序論第回表面科学学術講演会 ( 年月日日 ) にて発表近年, 薬物動態解析や代謝経路解明のための有機生体試料分析が盛んに行われている医療創薬分野で現在広く用いられる質量分析手法としては, 液体クロマト

2 352 表面科学第 35 巻第 7 号 (2014) グラフィー質量分析法 (Liquid Chromatography/Mass Spectrometry, LC MS) やマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry, MALDI MS) などが挙げられる 1 3) 一方, 一次イオンとして Ar +,Cs +,Ga + などの単原子イオンを用いる従来の二次イオン質量分析法 (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) は, 一次イオン照射による有機物試料表面の分子結合破壊の影響で, 有機生体試料分析への応用はきわめて困難であるとされてきた原子あるいは分子の集合体であるクラスターをビームとして用いる技術は,SIMS 法の生体試料分析への途を大きく拓いた 4 8) これは, クラスターイオンと試料構成原子との間で起こる多体衝突により, 完全に分子結合が破壊される一次イオン照射量 (static limit) に至る前に高効率に二次イオン信号を検出できることによるものである現在 SIMS 法の一次イオンとして最も広く用いられるクラスター種の一つはビスマス (Bi) クラスターである金属 Bi あるいはその合金から電界放出により生成される, 数個の Bi 原子からなる Bi クラスターイオンは, 光源がきわめて小さいことに起因して高い収束特性を有するため, 高空間分解能でのイメージング質量分析に有利である 9) 一方, 数千個前後のアルゴン原子の集合体をイオン化してビームとして用いるアルゴンガスクラスターイオンビーム (Argon Gas Cluster Ion Beam, Ar-GCIB) は, その非常に大きな質量に起因して, 等価的に極低エネルギーのイオンビームとなるこのため, Ar-GCIB 照射によりほとんどの有機物を低損傷でスパッタリング可能であり,SIMS 法の一次イオンビームとしてのみでなく,X 線光電子分光法 (X-ray Photoelectron Spectroscopy, XPS) の深さ方向分析におけるエッチング手法としても近年急速に普及している 10 12) 生体試料は多種多様な生体分子により構成されており, かつ, それぞれの分子の含有量はきわめて微量であるしたがって, 生体試料の高精度な SIMS 分析のためには, 高感度かつ高空間分解能でのイメージング質量分析が必須となる本研究では, 生体に比較的高濃度に含まれるリン脂質をモデル試料として用い, 市販の Bi クラスター SIMS 装置および我々の研究グループで独自に開発した Ar-GCIB SIMS 装置の生体試料分析に対する有用性に関する評価を行った 2. 実験 2. 1 試料作製クラスター SIMS 装置を用いた脂質分子の検出限界に関する検討を行うために,2 種類のリン脂質からなる混合試料を作製したリン脂質は生体細胞膜の脂質二重層を構成する主成分であり, 本研究では DSPC(1, 2- distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C 44H 88NO 8P,790.1 g/mol) および DPPC(1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphocholine, C 40H 80NO 8P,734.0 g/mol) の 2 種を混合して用いた検出限界を算出する目的で,10,1,0.1% の DPPC を DSPC に混合しクロロホルム溶媒に溶解させた脂質混合試料溶液を, スピンコート法を用いて Si 基板上に約 100 nm 堆積させたまた, 収束クラスタービームを用いた高空間分解能イメージング質量分析のため, 格子状のパターン付き脂質試料を作製したまず Si 基板上にスピンコート法を用いて膜厚約 200 nm の DSPC 薄膜を作製した後に, 真空蒸着法を用いて膜厚約 100 nm の Bi を堆積させたここで,400 lines/inch の Ni 製メッシュをメタルマスクとして用いることにより, 脂質が格子状に露出したパターン試料を作製した 2. 2 Bi クラスター SIMS 測定東北大学多元物質科学研究所所有の TOF. SIMS5 (ION-TOF GmbH, Germany) は, 現在最も普及している Bi クラスターイオン源を搭載した SIMS 装置の一つである単原子イオンビームである Bi + に加え, 数種の Bin p+ (n 2,p 1, ともに自然数 ) クラスターイオンビームを生成可能であるうち, 本研究においては Bi3 + を一次イオン種として用いたまた, いずれの試料の測定においても, 一次イオンの加速エネルギーは 25 kev とし, 質量分析器は正イオン測定モードとした Fig. 1 (a) に装置の概略図を示す一次イオンビームをパルス化して二次イオンの飛行時間を測定する機構である本装置では, 一次イオンのパルス幅を圧縮し質量分解能を向上させる Bunching モードと呼ばれる測定モードと, 一次イオンパルスの圧縮を行わずにビームの収束性を高め, 高空間分解能で質量イメージの測定を行うための Burst Alignment モードと呼ばれる測定モードが選択できる本研究では, 両者の比較のためにそれぞれのモードで脂質混合試料およびパターン付き脂質試料の測定を行った 2. 3Ar-GCIB SIMS 測定京都大学量子理工学教育研究センターで開発した Ar- GCIB SIMS 装置は, 一次イオン源として独自の収束機構を採用した収束 Ar-GCIB を搭載し, 質量分析部には市販の直交加速型飛行時間質量分析計 (orthogonal acceleration Time-of-Flight Mass Spectrometer, oa-tof MS) を使用している 13) 従来 LC/MS 法などに用いられてきた oa-tof MS を SIMS 法の質量分析器として用いることで, 市販の ToF 型 SIMS 装置とは異なり, 一次イオン

3 藤井麻樹子宍戸理恵鳥居聡太中川駿一郎瀬木利夫青木学聡鈴木茂松尾二郎 353 Fig. 1. Schematic image of (a) Bi cluster SIMS apparatus and (b) Ar-GCIB SIMS apparatus. ビームをパルス化する必要がなくなったこれにより, 通常長い測定時間を要する高い一次イオン照射量のイメージング質量分析においても, 従来法の 1000 分の 1 程度の測定時間での高速測定が実現できるまた, 得られる質量スペクトルの質量分解能が一次イオンのパルス幅と無関係となること, さらには高周波 (Radio Frequency, RF) トラップによるイオンクーリングを行うために低電界での引き出しでも二次イオンの輸送効率が高いことなど, これまでの SIMS 装置にはない特徴を有している 14 16) Fig. 1(b) に Ar-GCIB SIMS 装置の概略図を示す本研究ではいずれの試料に対しても, 用いた Ar-GCIB は加速電圧 10 kev, 平均クラスターサイズは約 1000 atoms/cluster であり, 質量分析器は正イオン測定モードとした 3. 結果および考察 3.1 検出限界 Fig. 2(a) および (b) にそれぞれ,Bi クラスター SIMS と Ar-GCIB SIMS を用いて取得した DSPC の質量スペクトルを示すなお,Fig. 2(a) に示す Bi クラスター SIMS の測定結果は高質量分解能の Bunching モー Fig. 2. Mass spectra of DSPC acquired with (a) Bi cluster SIMS and (b) Ar-GCIB SIMS. ドを用いて取得したものである一次イオンのドーズ量は Bi クラスター SIMS で 7.8E+11 ions/cm 2, Ar-GCIB SIMS で 2.0E+12 ions/cm 2 であった水素付加分子イオン [M+H] + に加え, いくつかの特徴的なフラグメントイオンが検出された特に, リン脂質のヘッドグループに由来する m/z 184.1(C 5H 15NO 4P) の信号が, いずれの SIMS 装置を用いた場合にも高強度に検出された Fig. 2 に示す質量スペクトルは, この m/z のフラグメントイオン強度を用いて規格化を行ったものである Bi クラスター SIMS の質量スペクトルでは低質量領域で煩雑なフラグメントイオンが検出されているのに対し,Ar-GCIB SIMS では分子イオンおよび高質量側のフラグメントイオン信号が高い比率で検出されていることがわかるこれは,Ar-GCIB が有機物の分子結合の切断を抑制したソフトなスパッタリングを行えることと,oa-ToF MS の RF トラップにより高質量の二次イオンを効率よく質量分析部へ輸送可能であることに起因するまた,Fig. 2 に示す質量スペクトルの DSPC 分子イオンピークをフィッティングし, 質量分解能を算出した結果,Bi クラスター SIMS では Bunching モードで m/δm 6500,Burst Alignment モードで m/ Δm 1200, Ar-GCIB SIMS で m/δm 8700 となった

354 表面科学第 35 巻第 7 号 (2014) Fig. 4. (color online). Results of imaging mass spectrometry, (a) optical microscope image, (b) mass image of m/z 184.

4 354 表面科学第 35 巻第 7 号 (2014) Fig. 4. (color online). Results of imaging mass spectrometry, (a) optical microscope image, (b) mass image of m/z obtained with Bi cluster SIMS, (c) mass image of m/z obtained with Bi cluster SIMS, (d) mass image of m/z obtained with Ar-GCIB SIMS, (e) mass image of m/z obtained with Ar-GCIB SIMS. Fig. 3. (color online). Mass spectra of lipid mixture sample acquired with (a) Bi cluster SIMS and (b) Ar-GCIB SIMS. Fig. 3(a) および (b) はそれぞれ,Bi クラスター SIMS および Ar-GCIB SIMS を用いて取得した, 脂質混合試料の質量スペクトルである DPPC の濃度を変えて DSPC へ添加した各試料の測定で得られた質量スペクトル中の,DPPC の水素付加分子イオンピーク (m/z 734.6) 付近のみを拡大して示した各質量スペクトルのピーク強度には, 前述のリン脂質ヘッドグループに由来する特徴的フラグメントイオンである m/z のピーク強度を用いて規格化処理を施したまた,0% DPPC(100% DSPC) 試料を除くすべての質量スペクトルにオフセット処理を施して示した主同位体のみからなる DPPC の水素付加分子イオン (m/z 734.6) に加え, 13 炭素の同位元素 C を一つおよび二つ含む DPPC 分子の水素付加分子イオンピークが m/z およびにそれぞれ明瞭に確認された Fig. 3 に示した各濃度における DPPC 分子イオン強度から,Bi クラスター SIMS の測定結果ではバックグラウンドの影響で,0.1% 試料での DPPC 分子イオン信号をピークとして確認することは困難であるのに対し, Ar-GCIB SIMS では 0.1% までの DPPC 分子イオンピークを明瞭に確認することができる以上より,Ar-GCIB SIMS は,DSPC と DPPC のような類似の構造を有する脂質の混合系に対し, 高い定量性と感度を有することが明らかとなったまた,Bi クラスター SIMS における検出限界を決定する最も大きな要因の一つはバックグラウンドであることが明らかとなった 3.2 イメージング質量分析得られた質量イメージを Fig. 4 に示す Bi クラスター SIMS 測定における一次イオンのドーズ量は 4.0E+12 ions/cm 2, 視野は µm 2 に対してピクセルであったまた,Ar-GCIB SIMS 測定では, 一次イオンのドーズ量 4.2E+14 ions/cm 2, 視野を µm 2 に対してピクセルとした Fig. 4(a) は測定試料の光学顕微鏡像,Fig. 4(b) および (c) はそれぞれ Bi クラスター SIMS 装置の Burst Alignment モードを用いて取得した DSPC ヘッドグループ由来のフラグメントイオン (m/z 184.1) および水素付加分子イオン (m/z 790.6) の質量イメージであるさらに,Fig. 4 (d) および (e) には Ar-GCIB SIMS 装置を用いて取得した, フラグメントイオン (m/z 184.1) および水素付加分子イオン (m/z 790.6) の質量イメージを示す 17) Fig. 2 に示したように, 分子イオンに比してフラグメントイオンの二次イオン強度が高いことに起因して, フラグメントイオンの質量イメージの方がより明瞭であることがわかる得られたフラグメントイオンの質量イメージから算出した空間分解能は,Bi クラスター SIMS では Burst Alignment モードで約 1µm,Bunching モードでは約 11 µm,ar-gcib SIMS では約 4µmであった Bi クラスター SIMS 法は, 液体金属イオン源の高い収束特性に起因して, 高い空間分解能でのイメージング質量分析が可能な手法であるが, 一方で Fig. 4(c) からわかるように, 分子イオンの質量イメージ取得は難しいこれは Bi クラスターイオンの照射により有機物の

5 藤井麻樹子宍戸理恵鳥居聡太中川駿一郎瀬木利夫青木学聡鈴木茂松尾二郎 355 結合破壊が起こり, ある一次イオン照射量 (static limit, 一般に 1.0E+12 ions/cm 2 前後とされる ) を超えると分子イオンの信号を検出できなくなるために, 分子イオンの信号量を十分に積算することが困難なためである本手法は, 工業材料のように純度の高い材料の分析に際しては, フラグメントイオン信号を用いた高空間分解能でのイメージング質量分析手法としてきわめて有用である一方で, 生体試料を構成する有機物の組成はきわめて複雑であり, 有意な分布情報を得るためには, フラグメントイオンではなく, 分子イオン信号を用いた質量イメージの取得が必須となる 3. 1 節で用いた DSPC と DPPC を例に取れば, この 2 種のリン脂質は分子量が異なるものの, 類似の化学構造を有するために, 生成するフラグメントイオン種はほぼ同一であるそのため, 両者の識別のためには分子イオンの取得が必須となるこれに対して,Ar-GCIB SIMS は有機物試料の結合破壊を起こすことなく,static limit を大きく超えても分子イオンの信号を取得可能であるしたがって, 生体試料の高感度かつ高空間分解能でのイメージング質量分析の実現には,Ar-GCIB のさらなる収束と, バックグラウンド低減等が肝要であると結論づける 4. 結論本研究では,Bi クラスター SIMS 装置および Ar- GCIB SIMS 装置を用いて, 脂質混合試料の検出限界および高空間分解能でのイメージング質量分析に関する検討を行った脂質混合試料の検出限界検討では,Ar- GCIB SIMS の検出限界が 0.1% 以下であることが明らかとなったこれは Ar-GCIB の高い二次分子イオン収率と oa-tof MS の低いバックグラウンドに起因するものであると考えられるまた,Bi クラスター SIMS 装置の検出限界を決める要因がバックグラウンドであることが明らかになったまた, パターン付き脂質試料を用いたイメージング質量分析では,Bi クラスター SIMS 法で約 1µm,Ar-GCIB SIMS 法で約 4µmという空間分解能が得られた Bi クラスターイオンビームの高い収束特性を活かした質量イメージを取得できた一方で, 分子イオンを用いた高精度なイメージング質量分析のためには Ar-GCIB SIMS 法のさらなる高空間分解能化が不可欠であることが明らかとなった謝辞本研究の一部は, 日本学術振興会特別研究員奨励費によって補助されていることをここに記し, 謝します文 1) S. Khatib-Shahidi, M. Andersson, J.L. Herman, T.A. Gillespie and R.M. Caprioli : Anal. Chem. 78, 6448 (2006). 2) S.J. Atkinson, P.M. Loadman, C. Sutton, L.H. Patterson and M.R. Clench : Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 1271 (2007). 3) C.S. Tamvakopoulos, L.F. Colwell, K. Barakat, J. Fenyk- Melody, P.R. Griffin, R. Nargund, B. Palucki, I. Sebhat, X. Shen and R.A. Stearns : Rapid Commun. Mass Spectrom. 14, 1729 (2000). 4) N. Winograd : Anal. Chem. 77, 142A (2005). 5) A. Wucher : Appl. Surf. Sci. 252, 6482 (2006). 6) C.M. Mahoney : Mass Spectrom. Rev. 29, 247 (2010). 7) J.S. Fletcher, N.P. Lockyer and J.C. Vickerman : Mass Spectrom. Rev. 30, 142 (2011). 8) TOF-SIMS : Surface Analysis by Mass Spectrometry, ed. by J.C. Vickerman and D. Briggs (IM Publications, 2001). 9) F. Kollmer : Appl. Surf. Sci. 231, 153 (2004). 10) H. Gnaser, K. Ichiki and J. Matsuo : Surf. Interface Anal. 45, 138 (2013). 11) H. Gnaser, M. Fujii, S. Nakagawa, T. Seki, T. Aoki and J. Matsuo : Rapid Commun. Mass Spectrom. 27, 1490 (2013). 12) I. Yamada, J. Matsuo, N. Toyoda and A. Kirkpatrick : Mater. Sci. Eng. R. R34, 231 (2001). 13) K. Ichiki, J. Tamura, T. Seki, T. Aoki and J. Matsuo : Surf. Interface Anal. 45, 522 (2013). 14) I.V. Chernushevich, A.V. Loboda and B.A. Thomson : J. Mass Spectrom. 36, 849 (2001). 15) J.H.J. Dawson and M. Guilhaus : Rapid Commun. Mass Spectrom. 3, 155 (1989). 16) M. Guilhaus, D. Selby and V. Mlynski : Mass Spectrom. Rev. 19, 65 (2000). 17) J. Matsuo, S. Torii, K. Yamauchi, K. Wakamoto, M. Kusakari, S. Nakagawa, M. Fujii, T. Aoki and T. Seki : Appl. Phys. Express. 7, (2014). 献

図 2 TOF-SIMS 測定の模式図. され, それまで数 10 μm であったビーム径が, 一気にサブミクロンにまで向上した. ただし, 当時のイオン源は Ga のみであったため, 無機材料の応用例が中心であった. 液体金属型イオン銃はサブミクロンのビーム径に加え, 高質量分解能も容易に達成でき

図 2 TOF-SIMS 測定の模式図. され, それまで数 10 μm であったビーム径が, 一気にサブミクロンにまで向上した. ただし, 当時のイオン源は Ga のみであったため, 無機材料の応用例が中心であった. 液体金属型イオン銃はサブミクロンのビーム径に加え, 高質量分解能も容易に達成できナノイオンプローブによる新規顕微計測技術の展開 TOF-SIMS による有機材料の 3 次元ナノスケールイメージ解析 Three Dimensional Nano Scale Image Analysis of Organic Materials Using TOF-SIMS 飯田真一 Shin-ichi Iida アルバックファイ株式会社要旨表面に非常に敏感で, 元素あるいは分子種を高感度で検出可能な飛行時間型二次イオン質量分析法