24 香川大学農学部学術報告第 67 巻,15 て% としたが,C. libanoticumでは5% ショ糖を添加した. また, 培養温度はC. alpinumおよび C. purpurascens ではとしたが, 他の種では25 とした. また, 貯蔵前および貯蔵後の人工培地への播種前のいずれに

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あきたけちゅうか
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1 香川大学農学部学術報告第 67 巻 23~,15 低温下でのシクラメン属植物の花粉貯蔵高村武二郎石塚栄治 Pollen storage under low temperature in the genus Cyclamen Takejiro Takamura and Eiji Ishizuka Summary Pollen storage at, 5, - and - C was examined in 16 species of the genus Cyclamen. More than % pollen grains stored at - C after desiccation were germinated after the storage for 3 months in all the species. After the pollen storage for 6 and 9 months, germination percentage of pollen grains stored at - C after desiccation was larger than those stored at, 5 and - C in all the species except C. africanum. Thus, pollen storage at - C after desiccation was preferable to that at, 5 and - C in the genus Cyclamen. Key Words : Cyclamen, pollen, storage, low temperature 緒言 Cyclamen 属の種間交雑で種子が得られる交雑組み合わせは, わずかに数えるほどである (1). シクラメン園芸品種はC. persicumの改良により育成されてきたが,c. persicumと他の種との交雑では種子が得られていないこともあり, 長い間 C. persicum 以外の21 種のシクラメン属植物は園芸品種の改良に関与していなかった. しかしながら,Ishizaka and Uematsu (2) が, 胚珠培養を援用してシクラメン園芸品種 (C. persicum) とC. hederifoliumとの種間雑種を作出して以来, 園芸品種といくつかのCy- clamen 属野生種との雑種が作出されるようになり (3-8), 現在では園芸品種と野生種との種間雑種の複二倍体より育成された品種も存在する. C. persicum 以外のCyclamen 属植物には, 芳香性, 耐寒耐暑性, 赤葉や多様な形の葉など園芸品種には欠けている有用形質を有するものもあり, これらの植物は, 未利用の有用遺伝資源であると考えられる. したがって, 種間交雑後に胚珠培養等の胚救出技術を適用してシクラメン園芸品種と野生種または野生種と別の野生種との種間雑種を育成することにより, シクラメンの遺伝変異を拡大し, 新たな品種開発の可能性が広がるものと期待される. しかしながら,Cyclamen 属植物を日本で栽培した場合, 秋咲き, 冬春咲きおよび四季咲きに大別されるように, それぞれ開花期が異なる (8). そのため, 種間交雑を確実に行うためには, 花粉を貯蔵し, 交雑に用いる必要がある. そこで本研究では, 開花期の異なる種間交雑を可能とすることを目的として,Cyclamen 属野生種 16 種を用いて,5,-および- の低温での花粉貯蔵の可能性を調査した. 材料および方法香川大学農学部の温室で栽培されている秋咲きのC. africanum,c. cilicium,c. graecum,c. hederifolium,c. intaminatum,c. mirabile,c. rohlfsianum, 冬春咲きの C. alpinum,c. balearicum,c. creticum,c. libanoticum,c. parviflorum,c. persicum,c. pseudibericum,c. repandum, ならびに開花期に季節性が認められないC. purpurascensの開花株の葯を採取し,1 個ずつ薬包紙に包んで円筒形のプラスチック容器 ( 直径 3. cm, 高さ5.2 cm) に入れて密封し,,5,-または- で3,6 または9か月間の花粉貯蔵を試みた. なお, 貯蔵時には乾燥剤としてシリカゲルを同封し,-および- 貯蔵では5 で1 日間乾燥処理を行った.- 貯蔵では, 乾燥処理なしで貯蔵する処理区 (- 無乾燥貯蔵区 ) も設けた. (9) 貯蔵前と貯蔵後に既報の方法に準じて, 花粉を, ショ糖を添加した1% 寒天培地に置床し, 暗黒下 12 時間培養して花粉を発芽させた. ショ糖濃度は原則とし

2 24 香川大学農学部学術報告第 67 巻,15 て% としたが,C. libanoticumでは5% ショ糖を添加した. また, 培養温度はC. alpinumおよび C. purpurascens ではとしたが, 他の種では25 とした. また, 貯蔵前および貯蔵後の人工培地への播種前のいずれにおいても, 一部の花粉を採取し, 酢酸カーミンで染色して花粉の染色率を調査した. いずれの種においても, 花粉の染色率および人工培地上での花粉発芽率の調査については, ぞれぞれおよび個の花粉を用いて3 反復の実験を行った. 結果秋咲きCyclamen 属野生種と花期に季節性が認められないC. purpurascensにおける貯蔵後の花粉のアセトカーミン染色率および人工培地上での発芽率をそれぞれ第 1 図および第 2 図に示した. いずれの種の花粉においても貯蔵 3および6か月後では高いアセトカーミン染色率を示し, 貯蔵 9か月後においてもC. mirabileの貯蔵区を除くすべての処理区で75% 以上の高い値が示された ( 第 1 図 ). 一方, アセトカーミン染色率と異なり, 人工培地上での花粉発芽率はいずれの処理区においても貯蔵後, 特に6か月以上の貯蔵後に大きく低下した ( 第 2 図 ).C. africanum,c. cilicium,c. graecum,c. mirabileおよびc. purpurascensでは貯蔵区以外の処理区で,C. hederifoliumおよびc. rohlfsianumではおよび5 貯蔵区以外の処理区で,C. intaminatumでは- 貯蔵区および - 無乾燥貯蔵区で貯蔵 3か月後に貯蔵前の% 以上の発芽率が認められた. しかしながら, 貯蔵 6か月後ではC. ciliciumの- 貯蔵区, ならびにC. graecumの -,- 無乾燥および- 貯蔵区でのみ貯蔵前の% 以上の発芽率が維持され, 貯蔵 9か月後ではいずれの種のいずれの処理区においても, 貯蔵前の% 以下の発芽率であった.C. africanumでは, 貯蔵 6か月後の花粉発芽率は- 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区で他の処理区より有意に高い値を示した.C. cilicium,c. graecumおよびc. rohlfsianumでは, 貯蔵 6か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区で最も高い値を示し, 貯蔵 9か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区で他の処理区より高い値を示した.C. hederifoliumおよびc. purpurascensの貯蔵 6か月後および9か月後での花粉発芽率は,- 貯蔵区で他の処理区より高い値を示した.C. mirabileにおける貯蔵 6か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区で他の処理区よりも高い値を示し, 貯蔵 9か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区で最も高い値を示した.C. intaminatumの貯蔵 9か月後では,- 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区のみで花粉発芽が認められた. 冬春咲きCyclamen 属野生種の貯蔵後の花粉のアセトカーミン染色率および人工培地上での発芽率をそれぞれ第 3 図および第 4 図に示した. 秋咲き野生種やC. purpurascensと同様に多くの種において貯蔵 3および6 か月後では高いアセトカーミン染色率を示したが,C. creticumにおいては, 貯蔵区および5 貯蔵区では貯蔵 6か月後には75% 以下のアセトカーミン染色率となり, 貯蔵 9か月後ではいずれの処理区においても% 以下の花粉しか染色されなかった ( 第 3 図 ). 一方, 秋咲き野生種やC. purpurascensと異なり, 春咲き野生種の人工培地上での花粉発芽率は, アセトカーミン染色率よりは明らかに低い値ではあるものの, いずれの種においても- 貯蔵区での貯蔵 3か月後では 75% 以上の高い値であった ( 第 4 図 ). また, 貯蔵 6か月後においても,C. creticum 以外のすべての春咲き野生種で,- 貯蔵区または- 貯蔵区と- 無乾燥貯蔵区の両方の花粉発芽率が貯蔵前の% 以上の値を示した. しかしながら, 貯蔵 9か月後ではいずれの種においても, 貯蔵前の% 以上の発芽率が維持された処理区は認められなかった.C. alpinum,c. creticumおよび C. libanoticumでは, 貯蔵 6か月後および9か月後での花粉発芽率がいずれにおいても,- 貯蔵区で最も高い値を示した.C. parviflorumにおいては, 貯蔵 6か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区で最も高い値を示し, 貯蔵 9か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区で他の処理区より高い値を示した.C. balearicumでは, 貯蔵 6か月後での花粉発芽率は- 貯蔵区で最も高い値を示し, 貯蔵 9か月後での花粉発芽率は - 無乾燥貯蔵区で他の処理区より高い値を示した. C. persicum,c. pseudibericumおよびc. repandumにおいては, いずれにおいても貯蔵 6か月後での花粉発芽率は - 貯蔵区および- 無乾燥貯蔵区で他の処理区よりも高い値を示したが, 貯蔵 9か月後での花粉発芽率は C. persicumでは- 無乾燥貯蔵区,C. pseudibericumでは- 貯蔵区,C. repandumでは- 貯蔵区および - 無乾燥貯蔵区で最も高い値を示した. 考察低温下で花粉の生理活動を抑えて貯蔵する方法は一般的に用いられているが (),Cyclamen 属植物の低温下での花粉貯蔵に関する情報はほとんどない. 本研究の結果,C. intaminatum 以外の種における3か月の花粉貯蔵では,- 貯蔵区,- 無乾燥貯蔵区および-

3 高村武二郎他 : 低温下でのシクラメン属植物の花粉貯蔵 25 貯蔵区でいずれも貯蔵前の% 以上の花粉発芽率が維持された.C. intaminatumにおいても,- 無乾燥貯蔵区および- 貯蔵区では貯蔵前の% 以上の花粉発芽率を示した. 一方,6か月以上の長期間花粉を貯蔵した場合には, 貯蔵 9か月後のC. africanumを除いて, 貯蔵後の花粉発芽率は- 貯蔵区で- 貯蔵区より高い値を示した. これらのことから,Cyclamen 属植物の花粉貯蔵, 特に6か月以上の長期貯蔵では,- で貯蔵することが望ましいと考えられる. 本研究で用いたC. africanum,c. persicumおよびc. repandumを除くすべての種において, 貯蔵 6か月後と貯蔵 9か月後のいずれかまたは両方で- 貯蔵区の貯蔵後の花粉発芽率が- 無乾燥区より有意に高い値を示した. また,C. balearicum とC. persicumの貯蔵 9か月後を除いて, 貯蔵 6か月後および貯蔵 9か月後に- 貯蔵区の花粉発芽率が- 無乾燥貯蔵区より有意に低い値を示すことはなかった. 貯蔵中の花粉の水分が多いと, 呼吸などの生理活動により発芽に必要な物質が消耗される可能性がある (). また, 水分が凍結する温度で貯蔵する場合には, 花粉内部の水分凍結による物理的破壊作用が生じることが容易に予想され, 花粉の冷凍貯蔵ではその作用を防ぐために貯蔵前の花粉の乾燥が効果的であることが報告されている (11). 実際, 花粉の水分含量は花粉貯蔵に影響を及ぼす大きな要因であり (12,13), 液体窒素を用いたトマト花粉の超低温貯蔵では,6.8および 9.3% に含水率を下げた花粉が貯蔵に適当であったと報告されているように (13), いくつかの植物では何らかの乾燥処理が超低温下での花粉貯蔵に有効であると報告されている (14-17). 本研究の- 無乾燥貯蔵区ではシリカゲルを同封したため, 花粉内部の水分が凍結される前にいくらかの乾燥効果が生じたと考えられるが, それを考慮しても多くのCyclamen 属植物ででの花粉貯蔵前の1 日間の乾燥処理が有効であったことが示唆される. 本学で栽培した秋咲きのCyclamen 属植物は, 主に9 月下旬から月に, 冬春咲きのCyclamen 属植物では種によって異なるが, 主に1 月中旬から4 月にかけて開花しており ( データ未掲載 ), 埼玉県での開花時期として報告されているものとほぼ同様であった (8). これは, 日本の多くの地域で秋咲きのCyclamen 属植物を花粉親として春咲きのCyclamen 属植物に交雑する場合には3 6か月の, 春咲きのCyclamen 属植物を花粉親として秋咲きの Cyclamen 属植物に交雑する場合には6 9か月の花粉貯蔵が必要となることを意味する. 本研究の結果,- 貯蔵区で比較的高い花粉発芽率が長期間維持されることが示されたが, 貯蔵 9か月後に貯蔵前の% 以上の発芽率を維持できた種は認められなかった. いくつかの植物では, 液体窒素中で1 年またはそれ以上比較的高い花粉発芽率を維持しながら貯蔵できることが報告されている (14,16,18,19). したがって,Cyclamen 属植物においても6 か月を超える花粉貯蔵を想定して, 液体窒素中での花粉貯蔵を検討することが望ましいと思われる. なお, 本研究では, いずれの処理区においても, 貯蔵 3,6 および9か月後のアセトカーミン染色率と人工培地上での花粉発芽率に明確な差異が認められた. 貯蔵前より貯蔵後でその差異が顕著になっていること, 本研究では密閉したシャーレ内の寒天培地上で花粉を培養しており, 貯蔵後の花粉の吸水は十分に行われたと考えられること等を鑑みると, 貯蔵後には, アセトカーミンには染色されるものの発芽能力は著しく低下している花粉が多く存在しているものと推測される. したがって, 一般にアセトカーミン染色が花粉稔性の簡易推定法として用いられることもあるものの,Cyclamen 属野生種の花粉貯蔵において花粉稔性を調査する場合は, 少なくとも人工培地上での花粉発芽を調査する必要があることが示唆される. 摘要 Cyclamen 属野生種 16 種を用いて,,5,-および - での花粉貯蔵の可能性を調査した. 貯蔵 3か月後ではすべての種において, 乾燥処理した後に- で貯蔵した- 貯蔵区で貯蔵前の% 以上の花粉発芽率が維持された. また,6か月以上の長期間花粉を貯蔵した場合には,C. africanumを除いたすべての種で, 貯蔵後の花粉発芽率は,- 貯蔵区で他の温度で貯蔵した区より高い値を示した. これらのことから,Cyclamen 属植物の花粉貯蔵においては, 乾燥処理した後に- で貯蔵することが望ましいと考えられた.

4 26 香川大学農学部学術報告第 67 巻,15 Percentage of pollen grains stained with acetocarmine C. africanum 98.±.3 C. graecum 98.6±.2 C. intaminatum 97.1±.5 C. rohlfsianum 98.2± nd - 3 months 6 months 9 months C. clicium 98.2±.3 C. hederifolium 97.4±.4 C. mirabile 97.6±.3 C. purpurascens 97.3± nd - 第 1 図. 秋咲き Cyclamen 属野生種および C. purupurascens 花粉の 3,6 および 9 か月間貯蔵後のアセトカーミン染色率に及ぼす貯蔵温度の影響. バーは標準誤差を示す. 種名の後の数字は貯蔵前のアセトカーミン染色率 (%).nd: 乾燥処理なしで貯蔵.

5 高村武二郎他 : 低温下でのシクラメン属植物の花粉貯蔵 27 Percentage of pollen grains germinated 3 months 6 months 9 months C. africanum.7±2.4 C. cilicium 86.7±1.2 C. graecum 97.3±.3 C. hederifolium 86.±1.5 C. intaminatum 81.3±.9 C. rohlfsianum 97.3± nd - C. mirabile 96.±.6 C. purpurascens 97.3± nd - 第 2 図. 秋咲き Cyclamen 属野生種および C. purupurascens 花粉の 3,6 および 9 か月間貯蔵後の人工培地上での花粉発芽に及ぼす貯蔵温度の影響. バーは標準誤差を示す. 種名の後の数字は貯蔵前の花粉発芽率 (%).nd: 第 1 図参照.

balearicum 98.4±.3 C. libanoticum 97.1±.2 C. persicum 97.5±.3 C. repandum 98.1±.2 5 - - nd - 第 3 図.

6 28 香川大学農学部学術報告第 67 巻,15 Percentage of pollen grains stained with acetocarmine C. alpinum 97.7±.2 C. creticum 97.7±.3 C. parviflorum 98.±.4 C. psudibericum 97.9± nd - 3 months 6 months 9 months C. balearicum 98.4±.3 C. libanoticum 97.1±.2 C. persicum 97.5±.3 C. repandum 98.1± nd - 第 3 図. 冬春咲き Cyclamen 属野生種花粉の 3,6 および 9 か月間貯蔵後のアセトカーミン染色率に及ぼす貯蔵温度の影響. バーは標準誤差を示す. 種名の後の数字は貯蔵前のアセトカーミン染色率 (%).nd: 第 1 図参照.

7 高村武二郎他 : 低温下でのシクラメン属植物の花粉貯蔵 29 Percentage of pollen grains germinated C. alpinum 95.±.6 C. creticum 92.7±1.8 C. parviflorum 94.±1.5 C. psudibericum 92.3± nd - 3 months 6 months 9 months C. balearicum 93.±1. C. libanoticum 91.7±.9 C. persicum 96.±.6 C. repandum 95.3± nd - 第 4 図. 冬春咲き Cyclamen 属野生種花粉の 3,6 および 9 か月間貯蔵後の人工培地上での花粉発芽に及ぼす貯蔵温度の影響. バーは標準誤差を示す. 種名の後の数字は貯蔵前の花粉発芽率 (%).nd: 第 1 図参照.

8 香川大学農学部学術報告第 67 巻,15 引用文献 ⑴ Grey-Wilson, C.: Cyclamen, Timber Press, Portland (2). ⑵ Ishizaka, H. and Uematsu, J.: Production of interspecific hybrids of Cyclamen persicum Mill. and C. hederifolium Ation. by ovule culture. Japan. J. Breed., 42, (1992). ⑶ Ishizaka, H. and Uematsu, J.: Production of interspecific hybrids of Cyclamen persicum Mill. and C. purpurascens Mill. produced by ovule culture. Euphytica, 82, (1995). ⑷ Ishizaka, H.: Interspecific hybrids of Cyclamen persicum and C. graecum, Euphytica, 91, (1996). ⑸ Eward, A.:Interspecific hybridization between Cyclamen persicum Mill. and C. purpurascens Mill. Plant Breeding, 115, (1996). ⑹ 澁澤直恵, 小川謙司 : 胚珠培養法を用いたCyclamen persicum Mill. とC. rohlfsianum Aschers. およびC. persicumとc. libanoticum Hildebrの種間雑種の作出. 東京農試研報.,27,9-15(1997). ⑺ 高村武二郎, 山田理恵子, 田中道男 : シクラメン園芸品種 (Cyclamen persicum Mill.) と C. purpurascens Mill. の種間雑種作出に及ぼす種子親の遺伝子型の影響. 香川大学農学部学術報告,54,45-48 (2). ⑻ Ishizaka, H.: Interspecific hybridization by embryo rescue in the genus Cyclamen, Plant Biotechnol., 25, (8). ⑼ 高村武二郎, 石塚栄治 : 人工培地上におけるC. coumの花粉発芽, 香川大学農学部学術報告 66, 1-4 (14). ⑽ 岩波洋造 : 花粉学. 講談社, 東京 (19). ⑾ Ching, T.M. and Ching, K.K.: Freeze-drying pine pollen. Plant Physiol., 39, 5 9 (1964). ⑿ Connor, K.F. and Towill, L.E.: Pollen-handling protocol and hydration/dehydration characteristics of pollen for application to long-term storage, Euphytica, 68, (1993). ⒀ Karipidis, C., Olympios, C., Passam, H.C. and Cavvas, D.: Effect of moisture content of tomato pollen stored cryogenically on in vitro germination, fecundity and respiration during pollen tube growth, J. Hort. Sci. and Biotech., 82, (7). ⒁ Towill, L.E.: Liquid nitrogen preservation of pollen from tuber-bearing Solanum species. HortSci., 16, (1981). ⒂ Hecker, R.J., Stanwood, P.C. and Soulis, C. A.: Storage of sugarbeet pollen. Euphytica, 35, (1986). ⒃ Luza, J.G. and Polite, V.S.: Cryopreservation of English walnut ( Juglans regia L.)pollen. Euphytica, 37, (1988). ⒄ Parton, E., Vervaeke, I., Delen, R., Vandenbussche, B., Deroose, R. and De Proft, M.: Viability and storage of bromeliad pollen. Euphytica, 125, (2). ⒅ Polite, V.S. and Luza, J.G.: Low temperature storage of pistachio pollen. Euphytica, 39, (1988). ⒆ 金澤俊成, 小林佐代, 八鍬利郎 : ギョウジャニンニクの開花過程および花粉発芽と貯蔵, 園学雑.,, (1992).