乳癌基礎研究 Vol ている 3 ), 4 ) また実験動物を用いた研究においてもこれら因子の過剰発現がリンパ節転移に対して促進的に作用することが報告されており 5)-8) これらの事実は VEGF-C や VEGF-D が転移阻止に対する治療的戦略のターゲットになり得ることを示

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あきとしおえづか
5 years ago
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1 乳癌基礎研究 Vol VEGF-C sirna 発現ベクターではマウス乳癌転移を抑制したが VEGF-D sirna ではその作用は発揮されなかった柴田雅朗 1) 柴田映子 2) 森本純司 3) 斯波真理子 2) 1) 大阪保健医療大学大学院保健医療学研究科解剖学病理組織学研究室 2) 国立循環器病研究センター研究所病態代謝部 3) 大阪医科大学実験動物センター要旨はじめに目的 VEGF-C や VEGF-D は VEGFR-3 受容体を介してリンパ管新生をもたらすことが知られておりヒトではこれら両分子と乳癌のリンパ節転移との間に関連性が報告されているしかしながらその一方で VEGF-D では関与しないとの報告もあるそこでこれら分子の発現を sirna によりノックダウンさせることでマウス乳癌転移に対する抑制作用を検討した方法乳癌細胞株の BJMC3879Luc2 を BALB/c マウス雌に移植し週 1 回腫瘍内に sirna 発現ベクター ( 対照群 psiscr, psivegf-c ないしは psivegf-d) をエレクトロポレーションにより遺伝子導入し実験終了の 7 週まで実施した結果腫瘍体積では実験開始の 3 週より 6 週まで psivegf-c 群で対照群に比較して有意な低下が観察された転移ではリンパ節および肺に限らず総ての臓器での転移において psivegf-c 群で有意な抑制が示された腫瘍内の微小血管密度およびリンパ管侵襲では psivegf-c 群で有意な低下が観察された一方 psivegf-d 群では腫瘍体積リンパ節転移や腫瘍内リンパ管侵襲で低下傾向を示すのみで統計学的な有意差は示されなかった結論マウス VEGF-C に対する sirna 発現ベクターは乳癌転移に対して抑制効果を発揮したしかしながら psivegf-d では明らかな転移の抑制効果は発揮されず転移抑制作用はあっても弱いものと推察された連絡先 : 大阪保健医療大学大阪市北区天満 1 丁目 9 番 27 号 Tel: Fax: masaaki.shibata@ohsu.ac.jp 日本の国立がんセンターがん対策情報センターによれば 21 年では乳癌の罹患数は全ての癌のうち1 位で 212 年の統計報告では乳癌による死亡率は第 5 位である 1) 現在のところ日本では乳癌は年間に罹患数約 4 万人死亡数約 1 万人といわれており 22 年までの我が国の女性乳癌患者の罹患数は 5 万人になると試算されている乳癌患者の死因の殆どは肺リンパ節などへの転移によるものであり癌転移を克服する事こそが延命効果につながると考えられる癌細胞はリンパ管を介したリンパ行性転移血管を介した血行性転移あるいは播種性転移がある癌細胞の浸潤や転移を司るシグナルを遮断することが出来れば転移の抑制につながり延命をもたらすものと考えられる従って乳癌の転移抑制に対する低毒性の治療法の開発に期待は大きい VEGFファミリーは血管新生因子であり VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E に加えて胎盤成長因子 (PIGF) がある中でも VEGF-A は癌など多くの病的血管新生に関与し疾患を増悪させる VEGF-C および VEGF-D はともに強力なリンパ管新生因子であり様々な正常組織で発現が認められているしかしながら乳癌を含む様々な悪性腫瘍においても腫瘍細胞自身が VEGF-C ならびに VEGF-D を過剰に発現していることが報告されている 2)3) 乳癌患者では VEGF-C や VEGF-D の過剰発現と予後不良やリンパ節転移には強い相関が示され 27

2 乳癌基礎研究 Vol ている 3 ), 4 ) また実験動物を用いた研究においてもこれら因子の過剰発現がリンパ節転移に対して促進的に作用することが報告されており 5)-8) これらの事実は VEGF-C や VEGF-D が転移阻止に対する治療的戦略のターゲットになり得ることを示唆している現実に著者らは VEGF-C sirna の発現ベクターを用いて実験的乳癌の転移を抑制した 9) その一方でヒト乳癌において VEGF-D とリンパ節転移には関連性がないとの報告もある 1 ) RNA 干渉を用いた遺伝子ノックダウンは small interfering RNA(siRNA) を用いることにより哺乳類細胞にも適応可能であることが示され遺伝子解析の一般的ツールとして広く用いられるようになったまた最近では合成 sirna が治療薬として有用であることを示しており遺伝子配列から治療薬合成が可能であるという期待感を高めている本研究ではリンパ行性転移の阻止を狙って VEGF-C あるいは VEGF-D に対するsiRNA をそれぞれ発現ベクターに組み込み乳癌転移の抑制効果を追究したなお更なる抗腫瘍効果の増強を目指して以前の研究で著者らの用いた VEGF-C sirna 配列とは違った配列で試みたなおこの研究成果の詳細は Original article 11 ) に掲載されている材料と方法 1. 乳癌細胞株マウス乳癌細胞株 BJMC3879Luc2( ルシフェラーゼ遺伝子を安定的に組み込んだもの ) を用いた本細胞株を同系マウスに移植するとリンパ節や肺に高率に転移を示し 12 ) ヒト乳癌と極めて類似した転移スペクトラムを示すモデルである 2. 有効な sirna 配列の決定マウス VEGF-C(VEGF-C1 ~ C4 ) あるいは VEGF-D(VEGF-D1 ~ D4 ) に対するそれぞれ 4 種類の sirna 配列を Qiagen 社の有するアルゴリズムを用いてデザインした次いで BJMC3879Luc2 乳癌細胞にカチオン性脂質の遺伝子導入試薬 (HiPerFect Qiagen 社 ) を用いてそれぞれ遺伝子導入した対照としてはヒトにもマウスにも相補性を示さないスクランブル sirna 配列を用いた遺伝子導入の 24 時間後にリアルタイム RT-PCR を用いて (LightCycler; Roche 社 ) VEGF-C ならびに VEGF-D の発現レベルを解析 (ΔΔCT 法 ) したその結果約 7% 近いノックダウン効率を示した VEGF-C1 と VEGF-D1 の塩基配列を選択し sirna の発現ベクター (Takara Bio 社 ) に組み込み実験に用いた 3.In vivo sirna 遺伝子治療 6 週齡の BALB/c 系雌マウス ( 日本 SLC) の鼠径乳腺部皮下にBJMC3879Luc2 細胞を移植し腫瘍径が約.3 ~.5cmになった時点で VEGF-C sirna 発現ベクター (psivegf-c) VEGF-D sirna 発現ベクター (psivegf-d) あるいは対照としてスクランブル配列を有したベクター (psiscr) を週 1 回の割合で7 週間腫瘍内に注射し ( 腫瘍の大きさに応じて 5 ~ 75μg) 遺伝子導入した (CUY65-1 ネッパジーン社) 遺伝子導入は 1V 2msec/1 パルス 8 パルス反復の条件で行った毎週体重と乳腺腫瘍のサイズを個体別に測定した乳腺腫瘍はデジタル式キャリパスで短径と長径を計測しその体積を長径 ( 短径 ) 2.4の算出式で求めた 13 ) 実験開始の7 週経過中にはマウス1 匹当たり 3mgの D- ルシフェリン ( 和光純薬工業 ) を腹腔内投与しイソフルレン吸入麻酔下にて Photon Imager (Biospace 社 ) を用いて生体発光イメージングを行った得られた発光シグナルを Photovision software(biospace 社 ) で解析した実験開始の 7 週経過後には全生存動物を屠殺剖検し乳腺腫瘍を摘出し 1% 緩衝ホルマリン溶液にて固定した肺およびリンパ節 ( 腋窩部大腿部 ) を採取し更に肉眼病変部と異常の見られたリンパ節についても採取し病理組織学的に検索した 4. 腫瘍内リンパ管侵襲および微小血管密度の定量リンパ管内皮のマーカーである podoplanin を免疫組織学的に染色し ( 抗 podoplanin 抗体 ; AngioBio 社 ) 腫瘍内のリンパ管を観察し癌細胞の侵襲を受けた腫瘍内リンパ管の数を算出した 14 ) また血管内皮のマーカーである CD31 を免疫組織学的に染色し ( 抗 CD31 抗体 ; Lab Vision 社 ) 陽性を示した腫瘍内の微小血管密度 28

3 乳癌基礎研究 Vol を算定した ) 5. 統計学的解析定量的データにおける 2 群間の平均値の差の解析には Student の t 検定を行った発生頻度の解析には Fisher の正確確率検定を用いた結 In vivo sirna 遺伝子治療腫瘍サイズ腫瘍体積は psivegf-c および psivegf-d 群において対照群 (psiscr) と比較して遺伝子導入の 3 週後より抑制が観察され 6 週まで観察された ( 図 1) しかし psivegf-d 群では実験期間を通して抑制傾向果のみで有意差は示されなかった腫瘍体積 (mm 3 ) psiscr psivegf-c psivegf-d 実験週図 1 腫瘍体積は psivegf-c 群および psivegf-d 群において対照群の psiscr と比較して実験期間を通して抑制が示された psivegf-c 群では実験開始の3~ 6 週まで統計学的な有意差が観察されたが (P <.1 ) psivegf-d 群では抑制傾向のみで有意差は認められなかった生体発光イメージング psivegf-c および psivegf-d 群では対照群と比較して移植した乳癌の大きさは小さい傾向にありまた転移の拡がりもこの両者の治療群で抑制傾向にあったが特に psivegf-c 群では明らかであった病理組織学的検索リンパ節転移は対照の psiscr 群では全例に転移を観察したが psivegf-c 群では 6% に転移を認めマウス 1 匹当たりのリンパ節転移個数で有意な抑制が観察された ( 図 2A) 肺では psivegf-c 群で対照群と比較してマウス 1 匹当たりの肺の転移巣 ( 25μm 以上の転移巣 ) の数で有意な抑制が A マウス 1 匹当たりの平均のリンパ節転移数 B マウス 1 匹当たりの平均の肺転移巣 (25mm 以上 ) の数 C マウス 1 匹当たりの平均の総転移数図 2 A: マウス 1 匹当たりの平均のリンパ節転移数対照群 (psiscr) と比較して psivegf-c 群では有意な低下が示されたが (P <.5 ) psivegf-d 群では抑制傾向のみで有意差は認められなかった B: マウス 1 匹当たりの平均の肺転移巣 ( 肺転移巣のサイズが 25 μm 以上 ) の数対照群と比較して psivegf-c 群では有意な低下が示されたが (P <.5 ) psivegf-d 群では抑制傾向のみで有意差は観察されなかった C: マウス 1 匹当たりの平均の総転移数対照群と比較して psivegf-c 群では有意な低下が観察されたが (P <.5 ) psivegf-d 群では抑制傾向のみであった 29

4 乳癌基礎研究 Vol 観察された ( 図 2B) なお psivegf-d 群ではリンパ節および肺転移ともに抑制傾向を示すのみであった ( 図 2A, B) 転移はリンパ節や肺以外にも腎臓副腎卵巣子宮にも転移が観察されマウス 1 匹当たりの総転移数でみるとやはり psivegf-c 群で有意な抑制が観察されたが psivegf-d 群では明らかな抑制は示されなかった ( 図 2 C ) 微小血管密度および腫瘍内のリンパ管侵襲抗 CD31 抗体を用いて乳腺腫瘍組織内の新生血管を免疫組織学的に染色し腫瘍内の微小血管密度を求めた結果対照群と比較して psivegf-c 群で有意な低下が観察された ( 図 3A) また抗 podoplanin 抗体を用いて乳腺腫瘍内のリンパ管を免疫組織学的に染色観察 A B 腫瘍内の微小血管密度リンパ管侵襲を受けた腫瘍内のリンパ管の平均個数図 3 A: 乳癌組織内の微小血管密度対照群 (psiscr) と比較して psivegf-c 群では有意な低下が示されたが (P <.5 ) psivegf-d 群では明らかな差異は認められなかった B: 乳癌組織内のリンパ管侵襲を受けたリンパ管の平均個数対照群 (psiscr) と比較して psivegf-c 群では有意な低下が示されたが (P <.5 ) psivegf-d 群では抑制傾向のみで有意差は認められなかったしたところリンパ管の内腔に癌細胞を頻繁に観察した ( 図 3B) このような癌細胞の侵襲を受けたリンパ管の数を定量解析した結果対照群と比較して全ての sirna 治療群で低下が観察されたが psivegf-d 群では統計学的な有意差は示されなかった考察本研究では VEGF-C とVEGF-D のそれぞれに対する sirna 発現ベクターを用い高転移性のマウス乳癌モデルに対して遺伝子導入を行い乳癌の転移抑制効果を検討したその結果 psivegf-c 群では腫瘍増殖 ( 腫瘍体積 ) の有意な抑制リンパ節および肺への転移抑制が示されさらにこれらの臓器に限らず広範囲の臓器の転移を抑制した psivegf-d ではある程度の腫瘍増殖に対する抑制傾向は見られたが転移抑制効果は示されなかった VEGF-C や VEGF-D の発現は乳癌を含む様々なヒト 2 )3 ) や実験動物 8)16) の腫瘍においてリンパ節転移と強く関わっているマウス乳癌モデルにおいても sirna によりVEGF-C 発現を阻害すると 9 )1 7 ) あるいは抗 VEGF-D 抗体を投与すると 8) リンパ節転移や肺転移が抑制されることが示されているまた VEGF-R3 は VEGF-C および VEGF-D の受容体であるが可溶性 VEGF-R3 でこれらの分子間の相互作用を阻害するとやはりリンパ節転移は抑制されることが報告されている 18 ) しかしながら本実験ではpsiVEGF-C では著しい転移抑制作用を発揮したが psivegf-d ではある程度の抗腫瘍効果は観察されたものの明らかな転移抑制作用は示されなかった VEGF-C とは対照的に VEGF-D では判然としない研究結果が散見される少なくとも 1つの乳癌の臨床研究において VEGF-D とリンパ節転移の関連性を否定している 1 ) また乳癌において VEGF-A および VEGF-C が乳癌の予後に有用であるとする一方 VEGF-D では予後因子にならないとする報告もある 19 ) またごく最近の研究では腫瘍細胞が分泌する VEGF-C のみが転移前のセンチネルリンパ節におけるリンパ管新生を誘導すると報告している 2) 3

5 乳癌基礎研究 Vol 本研究において癌細胞によるリンパ管侵襲を受けたその数は対照群と比較して psivegf-c 群で有意な低下が観察されこれは癌細胞が腫瘍内リンパ管に侵入する段階を抑制していることを示唆しているしかしながら psivegf-d 群では抑制傾向は示されるものの有意差は示されなかったまた腫瘍内の血管新生においても psivegf-c 群で有意な低下が観察された VEGF-C はリンパ管新生因子であるが実際に血管新生を誘導する 21) という報告があるその作用機序は VEGF-C が VEGF-R2(VEGF-A に対する受容体 ) を活性化するためと考えられる 22)23) psivegf-d 群では腫瘍内の血管新生の抑制作用は示されなかったこのように psivegf-d ではリンパ管新生に対する抑制効果が弱くかつ血管新生に対して抑制作用を有しないことが明らかな転移抑制に繋がらなかった要因の一つと考えられる以上 VEGF-C を標的とした sirna 発現ベクターはリンパ節や肺を含む広範囲の癌腫の転移を強く抑制しこの事実は延命効果につながり臨床的に極めて意義のある所見であると考えるしかしながら psivegf-d では明らかな転移の抑制効果は発揮されず転移抑制作用はあっても弱いものと推察された謝辞ほか本研究は文科省科学研究費基盤 C(2)( 課題番号 ) の助成により実施された文献 1. 国立がんセンターがん対策情報センター : 日本の最新がん統計まとめ ( 212 年 ) statistics1.html 2. Salven, P. et al.: Vascular endothelial growth factors VEGF-B and VEGF-C are expressed in human tumors, Am J Pathol 3: 13-8, Gu, Y. et al.: Lymphangiogenesis induced by VEGF-C and VEGF-D promotes metastasis and a poor outcome in breast carcinoma: a retrospective study of 61 cases, Clin Exp Metastasis 25: , Nakamura, Y. et al.: Lymph vessel density correlates with nodal status, VEGF-C expression, and prognosis in breast cancer, Breast Cancer Res Treat 91: , Skobe, M. et al.: Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis, Nat Med 7: 192-8, Karpanen, T. et al.: Vascular endothelial growth factor C promotes tumor lymphangiogenesis and intralymphatic tumor growth, Cancer Res 61: , Mandriota, S. J. et al.: Vascular endothelial growth factor-c-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis, EMBO J 2: , Stacker, S. A. et al.: VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics, Nat Med 7: , Shibata, M. A. et al.: Combination therapy with short interfering RNA vectors against VEGF-C and VEGF-A suppresses lymph node and lung metastasis in a mouse immunocompetent mammary cancer model, Cancer Gene Ther : , Currie, M. J. et al.: Expression of vascular endothelial growth factor D is associated with hypoxia inducible factor(hif-1alpha) and the HIF-1alpha target gene DEC1, but not lymph node metastasis in primary human breast carcinomas, J Clin Pathol 57: , Shibata, M. A. et al.: Therapy with sirna for Vegf-c but not for Vegf-d suppresses wide-spectrum organ metastasis in an immunocompetent xenograft model of metastatic mammary cancer, Anticancer Res 33: , Shibata, M. A. et al.: Lovastatin inhibits 31

6 乳癌基礎研究 Vol tumor growth and lung metastasis in mouse mammary carcinoma model: a p53-independent mitochondrial-mediated apoptotic mechanism, Carcinogenesis 25: , Shibata, M. A. et al.: Haploid loss of bax leads to accelerated mammary tumor development in C3(1)/SV4-TAg transgenic mice: reduction in protective apoptotic response at the preneoplastic stage, EMBO J. 18: , Shibata, M. A. et al.: Electrogene therapy using endostatin, with or without suicide gene therapy, suppresses murine mammary tumor growth and metastasis, Cancer Gene Ther 14: , 27. Gorrin-Rivas, M. J. et al.: Mouse macrophage metalloelastase gene transfer into a murine melanoma suppresses primary tumor growth by halting angiogenesis, Clin Cancer Res 6: , Achen, M. G. et al.: Targeting lymphangiogenesis to prevent tumour metastasis, Br J Cancer 94: , Chen, Z. et al.: Down-regulation of vascular endothelial cell growth factor-c expression using small interfering RNA vectors in mammary tumors inhibits tumor lymphangiogenesis and spontaneous metastasis and enhances survival, Cancer Res 65: 94-11, Lin, J. et al.: Inhibition of lymphogenous metastasis using adeno-associated virusmediated gene transfer of a soluble VEGFR-3 decoy receptor, Cancer Res 65: 691-9, Mohammed, R. A. et al.: Prognostic significance of vascular endothelial cell growth factors -A, -C and -D in breast cancer and their relationship with angioand lymphangiogenesis, Br J Cancer 96: 192-1, Zhao, Y. C. et al.: Tumor-derived VEGF-C, but not VEGF-D, promotes sentinel lymph node lymphangiogenesis prior to metastasis in breast cancer patients, Med Oncol 29: , Cao, Y. et al.: Vascular endothelial growth factor C induces angiogenesis in vivo, Proc Natl Acad Sci U S A 95: , Joukov, V. et al.: A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4(VEGFR-3 )and KDR (VEGFR-2 )receptor tyrosine kinases, EMBO J : 29-98, McColl, B. K. et al.: Molecular regulation of the VEGF family -- inducers of angiogenesis and lymphangiogenesis, APMIS 112: 463-8, 24 32

1. Caov-3 細胞株 A2780 細胞株においてシスプラチン単剤シスプラチンとトポテカン併用添加での殺細胞効果を MTS assay を用い検討した 2. Caov-3 細胞株においてシスプラチンによって誘導される Akt の活性化に対しトポテカンが影響するか否かを調べるためにシスプラチ

1. Caov-3 細胞株 A2780 細胞株においてシスプラチン単剤シスプラチンとトポテカン併用添加での殺細胞効果を MTS assay を用い検討した 2. Caov-3 細胞株においてシスプラチンによって誘導される Akt の活性化に対しトポテカンが影響するか否かを調べるためにシスプラチ ( 様式甲 5) 学位論文内容の要旨論文提出者氏名論文審査担当者主査朝日通雄恒遠啓示副査副査瀧内比呂也谷川允彦副査勝岡洋治主論文題名 Topotecan as a molecular targeting agent which blocks the Akt and VEGF cascade in platinum-resistant ovarian cancers ( 白金製剤耐性卵巣癌における